(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所,湖南衡陽421001)

支原體是一類能引起人類呼吸道和泌尿生殖道感染的病原體[1]。目前其致病機(jī)制尚未完全明了,但其誘導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)是導(dǎo)致機(jī)體免疫損傷的重要因素[2]。由于支原體缺乏細(xì)胞壁,其細(xì)胞膜是支原體與宿主細(xì)胞相互作用的唯一結(jié)構(gòu),其膜脂蛋白是引起炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)。支原體脂蛋白和其他細(xì)菌脂蛋白結(jié)構(gòu)類似,由N端的二酰半胱氨酸以及C端的多肽組成,其中N端的二酰半胱氨酸結(jié)構(gòu)是其免疫活性的基礎(chǔ)[2]。由于支原體脂蛋白在提取過程中易被內(nèi)毒素污染,因此在研究其功能時,通常采用與脂蛋白結(jié)構(gòu)相同的人工合成的巨噬細(xì)胞活性脂肽-2(macrophage-activating lipopeptide-2,MALP-2)作為替代物質(zhì)[3]。研究顯示,MALP-2通過與細(xì)胞表面的TLR結(jié)合后,能激活MAPKs以及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1,從而誘導(dǎo)多種前炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)的表達(dá)[4]。既然支原體感染所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)是其主要的致病因素,對機(jī)體而言,必然存在某種負(fù)調(diào)控機(jī)制使炎癥反應(yīng)趨向于穩(wěn)態(tài),從而避免組織損傷。研究發(fā)現(xiàn),在感染狀態(tài)下,機(jī)體可合成多種保護(hù)性蛋白,包括谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基,NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)以及血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)等。但MALP-2是否也能誘導(dǎo)這些抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá),目前仍不清楚。本研究旨在觀察MALP-2對HO-1和NQO1表達(dá)的影響并探討其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞購自ATCC,MALP-2購自Alexis Biochemicals(ALX-162-027-C050)。鼠抗人HO-1、NQO1、p-Akt及 total Akt抗體購自 Cell Signaling。LY294002購自 Sigma-Adrich。鼠抗人Nrf2抗體購自Santa Cruz。Nrf2 siRNA序列由Ribo-Bio公司合成。凝膠遷移率分析試劑盒購自Viagene。蛋白酶、磷酸酶抑制劑Cocktail購自Roche,細(xì)胞蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo,FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑購自Roche。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

THP-1細(xì)胞用含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰氨、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,于37℃ 5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MALP-2刺激前,THP-1細(xì)胞于1 000 rpm離心5 min,無菌 PBS洗滌后,用含1%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液于6孔板中調(diào)整其密度為5×105/mL,37℃ 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)不同的實(shí)驗?zāi)康姆譃殛幮詫φ战M和實(shí)驗組。其中對照組僅加入等體積培養(yǎng)基,而實(shí)驗組根據(jù)不同的研究目的加入不同濃度MALP-2刺激5～120 min或12 h。

1.3 Western blot檢測HO-1、NQO1表達(dá)及Akt磷酸化

細(xì)胞刺激結(jié)束后,用預(yù)冷的無菌PBS洗滌,迅速置于冰上,按照胞漿/胞核蛋白提取試劑盒提供的步驟獲取胞漿蛋白或總蛋白,BCA法測定其濃度。取80 μg蛋白加入等體積的2×SDS上樣緩沖液煮沸5 min后用于SDS-PAGE。隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。并利用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h,隨后加入一抗抗體4℃孵育過夜。多次洗滌后,加入HRP標(biāo)記的二抗孵育膜1 h。ECL法發(fā)光、顯影。

1.4 凝膠遷移率實(shí)驗檢測Nrf2 DNA結(jié)合活性

THP-1細(xì)胞處理結(jié)束后,按照試劑盒提供的方法獲取核蛋白。根據(jù)Viagene公司提供的非放射性EMSA試劑盒的操作步驟建立結(jié)合反應(yīng)體系和競爭反應(yīng)體,隨后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移后,交聯(lián)固定DNA,化學(xué)發(fā)光顯影。

1.5 免疫熒光觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位

用PBS洗滌細(xì)胞并重懸,加入0.1～0.5 mL細(xì)胞懸液至載玻片上,用甩片機(jī)在1 200 rpm下離心10 min,室溫干燥15～20 min。隨后用3.5%多聚甲醛室溫固定15 min,隨后用100%甲醇通透10 min。PBS洗滌后,1%山羊血清37℃封閉30 min。加入Nrf2抗體(1:100)孵育2 h。用PBS充分洗滌后,加入羊抗鼠二抗(1:1 000)室溫孵育1 h。細(xì)胞核采用1 μg/mL DAPI染色。隨后采用共聚焦顯微鏡拍照(Zeiss LSM710)。

1.6 瞬時轉(zhuǎn)染siRNA

約5×104細(xì)胞接種于24孔板中培養(yǎng)過夜。隨后按照FuGENE6提供的操作步驟,將100 nmol/L Nrf2 siRNA(正義鏈5′-UCC CGU UUG UAG AUG ACA A-3′;反義鏈5′-UUG UCA UCU ACA AAC GGG A-3′)混合物孵育細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后,用PBS漂洗細(xì)胞,并用1%FBS維持24 h后再用MALP-2刺激12 h。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prizm軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)用±s表示,并采用單因素方差分析數(shù)據(jù),P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MALP-2誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1和NQO1

Western blot結(jié)果顯示,0.01 ng/mL MALP-2作用THP-1細(xì)胞12 h后,可明顯誘導(dǎo)HO-1和NOQ1表達(dá),且隨MALP-2濃度增高,HO-1和NQO1表達(dá)逐漸增多(圖1A、B)。其中5 ng/mL MALP-2處理后,HO-1和NQO1表達(dá)分別增加了3.2和4.4倍,而此時尚未出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用(MTT結(jié)果未顯示)。

圖1 MALP-2誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1和 NQO1蛋白 A、B：Western blot;C、D：灰度掃描(相對值).與對照組(0 ng/mL)比較,*：P＜0.05

2.2 MALP-2激活PI3K誘導(dǎo)HO-1和NQO1表達(dá)

5 ng/mL MALP-2作用THP-1細(xì)胞5 min即可誘導(dǎo)PI3K下游產(chǎn)物Akt磷酸化(圖2)。而THP-1預(yù)先經(jīng)不同濃度PI3K特異性抑制劑LY294002處理后,再用MALP-2刺激12 h,HO-1和NQO1表達(dá)隨之降低(圖2)。

2.3 MALP-2誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位

5 ng/mL MALP-2作用THP-1細(xì)胞60 min后,激光共聚焦顯示,核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2核轉(zhuǎn)位明顯增多。而經(jīng)25 μmol/L PI3K特異性抑制劑LY294002處理后,可顯著降低細(xì)胞核中Nrf2水平(圖3)。

2.4 MALP-2增強(qiáng)THP-1細(xì)胞中Nrf2 DNA結(jié)合活性

5 ng/mL MALP-2處理30 min尚不能檢測出Nrf2 DNA結(jié)合活性的變化,60 min后開始增強(qiáng),120 min后達(dá)到高峰。未標(biāo)記Nrf2探針可使DNA-蛋白結(jié)合形成的滯后條帶消失,而NF-κB探針對其無明顯影響。同時,Nrf2抗體結(jié)合后,能形成一條超滯后條帶(super shift)。LY294002處理后,DNA結(jié)合活性降低(圖4)。

圖2 MALP-2經(jīng)PI3K誘導(dǎo)THP-1表達(dá)HO-1和NQO1

2.5 Nrf2參與HO-1和NQO1的表達(dá)

采用Nrf2 siRNA干擾其表達(dá)后,Western blot結(jié)果顯示,HO-1和NQO1的表達(dá)水平顯著降低(圖5)。

圖3 MALP-2經(jīng)PI3K誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位

圖4 MALP-2經(jīng)PI3K增強(qiáng)Nrf2 DNA結(jié)合活性 1：對照

3 討 論

圖5 Nrf2參與調(diào)控MALP-2誘導(dǎo)HO-1和NQO1表達(dá)

炎癥是機(jī)體抵抗外源性感染的一種自我防御反應(yīng)。對于機(jī)體而言,炎癥反應(yīng)必然受到受到嚴(yán)格的調(diào)控,從而使機(jī)體的炎癥-抗炎反應(yīng)趨于平衡而避免過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生[5-6]。目前已經(jīng)證實(shí),機(jī)體可表達(dá)過多抗氧化、抗炎功能的蛋白,從而負(fù)調(diào)控炎癥反應(yīng)[7],其中以HO-1和NQO1研究最為透徹。研究顯示,通過誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)可顯著降低細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的含量,抑制粘蛋白表達(dá)以及細(xì)胞凋亡[8],同時,LPS也可上調(diào)HO-1和NQO1的表達(dá),從而抑制IL-1β和TNF-α的過度分泌[9]。此外,采用藥物誘導(dǎo)HO-1或NQO1表達(dá)后,可下調(diào)多種細(xì)胞因子以及炎癥介質(zhì)的表達(dá)[10]。這表明 HO-1和NQO1在維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用,這可能是機(jī)體一種獲得性的自我保護(hù)機(jī)制。本研究證實(shí),MALP-2可通過PI3K/Nrf2通路誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1和NQO1,這表明支原體感染后,雖然能誘導(dǎo)單核、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子或介質(zhì)清除病原體,但同時也能誘導(dǎo)HO-1和NQO1的表達(dá),從而在一定程度上負(fù)調(diào)控炎癥反應(yīng)而避免炎癥失控或組織損傷。PI3K是參與細(xì)胞生長以及骨架重塑的重要激酶,其激活后可導(dǎo)致脂質(zhì)底物磷酸化而形成第二信使,并激活下游蛋白激酶 B,即Akt。因此檢測Akt的磷酸化可間接反應(yīng)PI3K的激活[11]。有研究顯示TLR2和相應(yīng)配體結(jié)合后,可與PI3K形成復(fù)合體而參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。本研究證實(shí)MALP-2處理后能明顯誘導(dǎo) Akt磷酸化,而 PI3K抑制劑處理THP-1細(xì)胞后,HO-1和NQO1表達(dá)明顯降低,這表明HO-1和NQO1的表達(dá)受PI3K的調(diào)控。Nrf2在正常情況下與抑制因子Keap1存在于細(xì)胞漿中,keap1降解后,Nrf2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)與 HO-1或NQO1基因上游的啟動子趨于結(jié)合而誘導(dǎo)其表達(dá)[13-14]。本研究通過免疫熒光證實(shí)MALP-2能顯著誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位,凝膠遷移率實(shí)驗也進(jìn)一步證實(shí)了其DNA結(jié)合活性顯著增強(qiáng),而上述過程能被PI3K抑制劑LY294002所抑制。同時,采用siRNA干擾Nrf2表達(dá)后,HO-1和NQO1的表達(dá)也隨之降低。這表明Nrf2和PI3K參與HO-1和NQO1的表達(dá)。

總之,本研究證實(shí)MALP-2可通過PI3K/Nrf2信號通路反饋性誘導(dǎo)HO-1和NQO1的表達(dá),從而可能實(shí)現(xiàn)對炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控,這在維持機(jī)體的穩(wěn)定具有重要意義。由于MALP-2是支原體膜蛋白的衍生脂肽,其主要的生物學(xué)特性是致炎作用。若能從結(jié)構(gòu)上對MALP-2進(jìn)行改造,降低其致炎活性而保留HO-1和NQO1的誘導(dǎo)活性,或許可以成為某些炎癥性疾病治療的重要輔助藥物。

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