劉珂

研究環(huán)孢菌素A對再障病患骨髓細胞Fas表達及凋亡率的影響

劉珂①

目的：研究環(huán)孢菌素A（CsA）對再生障礙病患骨髓細胞Fas表達及凋亡率的影響。方法：從2010年2月-2013年2月，本院共計48例病患被確診為再障。以數(shù)字法隨機分成觀察組24例和對照組24例，對照組以注射用丹參治療，觀察組在此基礎上另以CsA治療。對比兩組療效，分析CsA對于再障病患骨髓Fas表達情況和對MNC有關凋亡率影響。結(jié)果：觀察組總有效率為83.33%（20/24），顯著高于對照組的37.50% （9/24），比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組在治療前后CD34+Fas+的細胞百分率相比，差異無統(tǒng)計學意義。觀察組病患骨髓CD34-細胞的Fas表達和對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。觀察組治療后MNC有關凋亡率為（2.27±0.74）%，顯著低于治療前的（6.58±2.33）%，以及對照組治療后的（2.92±1.20）%，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：細胞Fas異常表達和再障發(fā)病情況有一定聯(lián)系，以CsA治療再障病患，可明顯降低其骨髓MNC凋亡率，療效顯著，值得臨床推薦。

環(huán)孢菌素A； 再障； 骨髓細胞； Fas表達； 凋亡率

再生障礙性貧血是一種骨髓造血干細胞和/或造血微環(huán)境損傷性血液病。其免疫機制發(fā)生紊亂損傷，及造血干細胞和骨髓的微環(huán)境發(fā)生損害等因素均為該病主要機制[1]。因此在治療該病時，免疫抑制療法可作為一類主要手段。同時，近年來有報道表明，F(xiàn)as/ FasL系統(tǒng)可有效誘導凋亡，其不僅和正常造血相關，亦和造血病理及生理狀態(tài)相關，此系統(tǒng)和再障病患免疫發(fā)病有關機制有著一定聯(lián)系，有學者認為細胞凋亡的增加是再障疾病重要性病理和生理機制，但此方面報道較少[2]。鑒于此，本文通過以環(huán)孢菌素A（CsA）藥物治療再障病患，分析其對病患骨髓細胞Fas的表達和凋亡率情況影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2010年2月-2013年2月，本院共計有48例病患被確診為再障。其中男26例，女22例。年齡17～64歲，平均（37.2±2.8）歲。含慢性再障（以下簡稱為CAA）者24例；重型再障（以下簡稱為SAA）Ⅰ型者15例，Ⅱ型者9例。以數(shù)字法隨機分成觀察組24例和對照組24例。觀察組男13例，女11例，年齡17～63歲，平均（37.1±2.7）歲，CAA者12例，SAAⅠ型者7例，Ⅱ型者5例。對照組男13例，女11例，年齡18～64歲，平均（37.5±1.7）歲，CAA者12例，SAAⅠ型者6例，Ⅱ型者6例。兩組性別，年齡以及疾病類型等方面對比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 對照組以注射用丹參（哈藥集團）治療，規(guī)格為2 mL/支，一次用4 mL，治療3個月。觀察組在此基礎上加用環(huán)孢菌素A（新山地明，瑞士的SADONA公司，規(guī)格為25 mg/粒）。初始劑量是每天2.5 mg/kg，服用3個月。兩組病患在治療期間需定期檢測血常規(guī)，以及肝﹑腎功能等。

1.3 療效評價標準 根據(jù)張之南主編有關血液病診療標準判定[3]，分為明顯緩解﹑進步和無效，總有效率=（明顯緩解+進步）/總例數(shù)×100%。

1.4 觀察指標 分別在治療前以及治療3個月后采集病患新鮮的骨髓標本計2～4 mL，而肝素抗凝以淋巴細胞有關分離液將單個核細胞（即MNC）進行分離，將細胞濃度予以調(diào)整到1×107mL，以分析凋亡率和Fas檢測。CD34和Fas標記以直接免疫法進行，抗體是抗CD34-PE，及抗Fas-FITC（產(chǎn)于Pharmingen公司）。以流式細胞儀（FACS Vantage BD公司生產(chǎn)）進行測定。而細胞凋亡率測定以Boehringer Mannheim公司所產(chǎn)的原位末端標記（即TUNEL）法進行。根據(jù)有關說明書嚴格執(zhí)行測定操作，確保結(jié)果準確。

1.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 13.0軟件分析，計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗，計量數(shù)據(jù)采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組療效比較 觀察組總有效率為83.33% （20/24），顯著高于對照組37.50%（9/24），比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.541，P＜0.05）。觀察組明顯緩解4例，占比16.67%，對照組明顯緩解2例，占比8.33%。

2.2 CsA對于再障病患骨髓細胞Fas表達情況影響兩組治療前后CD34+Fas+的細胞百分率相比，差異無統(tǒng)計學意義。同時，觀察組病患骨髓CD34-細胞的Fas表達和對照組相比，差異亦無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 CsA對再障病患骨髓細胞Fas表達情況影響（±s） %

表1 CsA對再障病患骨髓細胞Fas表達情況影響（±s） %

+Fas+CD34-Fas+組別 CD34治療前 治療后 治療前 治療后觀察組（n=24） 40.53±7.33 37.92±4.52 51.42±13.44 52.65±10.67對照組（n=24） 39.08±6.86 38.83±7.89 50.82±14.35 47.83±13.86 t值 0.078 0.490 0.150 1.350 P值 0.483 0.626 0.882 0.184

2.3 CsA對于再障病患骨髓MNC有關凋亡率影響 觀察組治療前后MNC有關凋亡率分別為（6.58±2.33）%﹑（2.27±0.74）%，對照組分別為（6.46±2.17）%﹑（2.92±1.20）%，觀察組治療后MNC有關凋亡率顯著低于治療之前和對照組治療后，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

異常免疫造血抑制是再障最常見的病理生理機制[4-5]。通常而言，CsA的化學結(jié)構(gòu)為環(huán)寡肽，由一種真菌產(chǎn)生的具有生理活性的代謝產(chǎn)物，是一種特異性較強的免疫抑制劑[6]?？赏ㄟ^封閉T淋巴細胞表面受體，阻斷T移植細胞活化和增殖反應等機制發(fā)揮作用[7]。CsA作為一類免疫抑制劑，其特異性比較高，經(jīng)十一個氨基酸構(gòu)成環(huán)形多肽[8]。其對于治療再障而言是一種有效藥物。據(jù)有關報道表明，1995年第37屆美國的血液學年會指出，以CsA對再障進行治療，有效率為50%～60%，且病患在血液學指標的改善上通常開始于用藥之后3個月中[9]。故本文選擇在治療前以及治療3個月時對有關指標實施測定。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，觀察組總有效率為83.33%，顯著高于對照組的37.50%。同時治療后觀察組明顯緩解4例，占比16.67%，對照組明顯緩解2例，占比8.33%，表明觀察組CsA治療方案療效更佳。符合Xiao等[10]報道結(jié)果。這可能和CsA可通過對T細胞進行抑制，從而促使T細胞亞群比例產(chǎn)生變化而恢復造血有關[11]。

此外，兩組在治療前后CD34+Fas+的細胞百分率相比，差異無統(tǒng)計學意義；同時，觀察組病患骨髓CD34-細胞的Fas表達和對照組相比，差異亦無統(tǒng)計學意義，提示以GsA治療后，并不影響Fas抗原的表達。但筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，再障病情的不同，F(xiàn)as表達結(jié)果亦不盡相同，SAA病患相應CD34+Fas+的細胞百分率會高于CAA病患，而根據(jù)本院正常體檢者有關資料，無論是SAA還是CAA病患，其CD34+Fas+的細胞百分率均高于健康人群，這也從側(cè)面反映了Fas和再障免疫發(fā)病機制有一定關聯(lián)。進一步研究表明，CD34+Fas+的細胞百分率和骨髓細胞的凋亡率可呈現(xiàn)正相關聯(lián)系（SAA病患r=0.624，P＜0.05；而CAA病患r=0.631，P＜0.05）。

筆者在研究中還發(fā)現(xiàn)，觀察組治療后MNC有關凋亡率為（2.27±0.74）%，顯著低于治療前的（6.58±2.33）%，以及對照組治療后的（2.92±1.20）%。與朱琳超等[12]報道一致，表明以CsA治療方案治療再障，可明顯減少骨髓MNC凋亡。這可能是因為再障為骨髓的造血功能發(fā)生衰竭引發(fā)全血細胞數(shù)量減少，無論其初始病因怎樣變化，造血干細胞的數(shù)量減少即為其基本特征。目前不但已經(jīng)觀察到再障患者體內(nèi)T淋巴細胞亞群分布異常﹑腫瘤壞死因子和白介素-2等負調(diào)控因子活性增高等免疫紊亂現(xiàn)象，而且能夠從患者骨髓內(nèi)分離出攻擊CD34+細胞的T淋巴細胞克隆[13]。而CsA能夠降低某些因促凋亡因素而減少損傷骨髓，抑制活化T細胞有關功能，減少對Fas高表達的CD34+細胞攻擊，最終對其有關造血功能有明顯改善[14-15]。筆者在研究過程中，以TUNEL方法進行檢測發(fā)現(xiàn)再障病患MNC的凋亡率整體而言處于增高趨勢，在治療之后又下降，這證實細胞凋亡于再障疾病中的影響作用。需要指出的是，由于研究樣本量較少，所得結(jié)果仍需大樣本進一步驗證，進而尋找深入因素，為徹底對再障疾病進行治愈而努力奮斗。

綜上所述，細胞Fas異常表達和再障發(fā)病情況有一定聯(lián)系，以CsA治療再障病患，可明顯降低其骨髓MNC凋亡率，療效顯著，值得臨床推薦。

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Research on the Influence of Cyclosporin A to Patients with Aplastic Anemia’s Marrow Cells Fas Expression and Apoptosis Rate

/LIU Ke.//Medical Innovation of China，2014，11（16）：063-065

Objective：To study the influence of Cyclosporin A （CsA） to patients with aplastic anemia’s marrow cells Fas expression and apoptosis rate.Method：From February 2010 to February 2013， in our hospital a total of 48 patients were diagnosed with aplastic anemia， who were digital randomly divided into observation group （24 cases） and control group （24 cases）. The control group was treated with salvia injection， the observation group on the basis of it was treated with CsA. To compare the curative effect of the two groups， and analyze the influence of CsA to patients with aplastic anemia’s marrow cells Fas expression and apoptosis rate.Result：The total effective rate of the observation group was 83.33% （20/24）， which was significantly higher than that of the control group 37.50% （9/24）， and difference was statistically significant （P＜0.05）. To compare both the two groups before and after treatment of CD34+Fas+cell percentage， the difference was not statistically significant. To compare the observation group’s Fas expression of bone marrow CD34-cells with the control group， the difference was not statistically significant. The observation group after treatment’s MNC apoptosis rate was （2.27±0.74）%， which was significantly lower than （6.58±2.33）% before treatment， and （2.92±1.20）% of the control group after treatment， the differences were statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：The abnormal expression of Fas has some contact with the incidence of aplastic anemia. Using CsA to treat patients with aplastic anemia can significantly reduce the bone marrow MNC apoptosis rate. It has a significant effect and is worthy of recommendation.

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.16.020

2014-04-08） （本文編輯：王宇）

①河南科技大學第一附屬醫(yī)院 河南 洛陽 471003

劉珂

【Key words】Cyclosporin A； Aplastic anemia； Bone marrow cells； Fas expression； Apoptosis rate

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of He’nan University of Science and Technology，Luoyang 471003， China