孫秀才,施 霞,曾 輝,孟 娟,盛艷華,馮建章

(1.深圳市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科,廣東深圳518112;2.廣東省心血管病研究所心內(nèi)科)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓病、支架內(nèi)再狹窄等多種心血管疾病的共同病理特征。各種生長因子、細(xì)胞因子與血管平滑肌細(xì)胞表面的受體結(jié)合,在細(xì)胞內(nèi)引起一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng),致使外界刺激轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信號(hào)并被逐級(jí)放大,最終導(dǎo)致DNA合成和細(xì)胞的分裂增殖[1-3]。絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是細(xì)胞內(nèi)多種促細(xì)胞增殖信號(hào)傳遞的交匯點(diǎn)和信息的共同通路,在細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用。由內(nèi)皮素-1(endothelin,ET-1)等許多促VSMCs增殖的有絲分裂刺激都是通過ERK1/2途徑起作用[4-5]。姜黃為姜科植物Curcuma longa L的根莖,姜黃素(curcumin)是姜黃的主要有效成分,為天然的酚類抗氧化劑,具有多種分子靶向作用,包括轉(zhuǎn)錄因子、生長因子以及受體,細(xì)胞活素、酶和基因調(diào)控的細(xì)胞增殖和凋亡[5-6]。有研究表明[7]姜黃素能抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖。為探討其分子機(jī)制,本研究以體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs為模型,觀察姜黃素對(duì)ET-1誘導(dǎo)VSMCs增殖及ERK1/2信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購于Gibco公司,內(nèi)皮素-1、姜黃素購自 Sigma公司,3H-胸苷(放射性比活度28Ci/mmol)中國原子能科學(xué)院提供。ERK1/2 Assaykit,NEB公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 VSMCs的原代培養(yǎng)

參照王道生[8]貼塊法進(jìn)行。選用10周齡Wistar kyoto大鼠(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)斷頭處死,取胸主動(dòng)脈中膜以貼塊法培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),1周后可見細(xì)胞從組織塊邊緣爬出,2～3周出現(xiàn)致密細(xì)胞層,此時(shí)即可傳代,傳代細(xì)胞光鏡下呈典型的“峰與谷”樣生長,細(xì)胞抗β-actin抗體鑒定為血管平滑細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)所用的血管平滑肌細(xì)胞均為第4～6代的細(xì)胞。

1.3 血管平滑肌細(xì)胞增殖率的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長期的VSMCs,以2×105/mL細(xì)胞濃度接種于6孔培養(yǎng)板,每孔1 mL,每組3孔。以不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞處于靜止期后,內(nèi)皮素組加入ET-1 10-8mol/L,姜黃素組加入ET-1 10-8mol/L與濃度分別為 10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L姜黃素,并設(shè)對(duì)照組。按上述分組處理后孵育24 h,取出6孔板,制成1 mL細(xì)胞懸液,取18 μL,假如0.1%胎盼蘭 2 μL,染色,在顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),每孔計(jì)3次,取3孔的均數(shù)為細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果。

1.4 3H-胸腺密啶摻入(3H-TdR)法測(cè)定血管平滑肌的DNA合成量

選擇生長良好的第4代培養(yǎng)VSMCs,用0.25%胰酶消化、計(jì)數(shù),以2×105/孔的密度接種于96孔板中。用無血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使VSMCs獲得同步的細(xì)胞生長停止。按組分別加入 ET-1 10-8mol/L,ET-1 10-8mol/L與濃度為10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L的姜黃素,并設(shè)對(duì)照組。培養(yǎng)16 h后,每孔再加入1 mci/mL3H胸腺密啶,孵育12 h后,棄去培養(yǎng)基,PBS沖洗兩次,給予胰蛋白酶消化,加入冷PBS終止反應(yīng)。以0.45 mm微孔濾膜負(fù)壓抽濾收集細(xì)胞,生理鹽水和10%三氯醋酸沖洗濾膜,濾膜烘干后置閃爍瓶中,加入閃爍液(PPO/POPOP/二甲苯/無水乙醇)靜置過夜,在液閃計(jì)數(shù)儀上測(cè)定3H放射強(qiáng)度,結(jié)果以CPM表示。重復(fù)測(cè)定3次,取均數(shù)。

1.5 ERK1/2表達(dá)的免疫印跡測(cè)定

應(yīng)用ERK1/2檢測(cè)試驗(yàn)劑盒進(jìn)行檢測(cè)。取靜止的VSMCs按組分別分別加入ET-1 10-8mol/L,濃度為10-5mol/L的姜黃素,ET-1 10-8mol/L與濃度為10-5mol/L的姜黃素,并設(shè)對(duì)照組。反應(yīng)24 h后,移除原孵育液終止反應(yīng)。加入100 μL SDS樣品緩沖液溶解細(xì)胞,迅速刮取細(xì)胞并移至試管中,置于冰上。超聲處理15s以去除DNA和減少樣品粘滯度。在95～100℃中加熱5 min,冰上冷卻。離心5 min,取蛋白質(zhì)上清20 mL用10%SDS聚丙烯酰胺電泳分離蛋白質(zhì),將已分離的區(qū)帶用電轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,室溫下,用25 mL TBS洗硝化纖維膜5 min。室溫下,在25 mL終止緩沖液中孵育膜1 h。15 mL TBS洗膜5 min,共3次。膜中加入適當(dāng)比例的-抗(1∶1 000稀釋)孵育,4℃過。15 mL TBS洗膜,5 min×3次。膜中加入適當(dāng)比例的二抗孵育1 h。15 mL TBS洗膜5 min×3次。室溫下,用10 mL LumiGLO孵育膜1 min,輕攪動(dòng)。倒掉過剩液體,用薄膜包好,用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白印記條帶,結(jié)果用影像軟件Smartview分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組資料的兩兩比較用t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 15.0軟件處理,以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)ET-1刺激的血管平滑機(jī)細(xì)胞增殖及DNA合成的影響

與對(duì)照組比較,ET-1組VSMCs計(jì)數(shù)、3H-TdR的摻入量明顯增加(P＜0.01),ET-1刺激了VSMCs的增殖和DNA的合成;3個(gè)不同劑量的姜黃素組VSMCs計(jì)數(shù)、3H-TdR與ET-1組比較,均顯著降低(P＜0.05)。說明ET-1刺激VSMCs增殖,而姜黃素能抑制ET-1刺激VSMCs的增殖。姜黃素抑制ET-1誘導(dǎo)VSMCs增殖呈劑量依賴關(guān)系(見表1)。

表1 姜黃素對(duì)ET-1誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和DNA合成的影響(±s)

表1 姜黃素對(duì)ET-1誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和DNA合成的影響(±s)

與對(duì)照組比較,a:P＜0.01;與ET-1組比較,b:P＜0.05

分 組 細(xì)胞計(jì)數(shù)(×103/mL)3H胸腺嘧啶摻入(cpm)對(duì)照組214.83±5.42 1 563±347 ET-1組 384.11±7.23a 2 847±366a ET-1+10-6/mol姜黃素組 364.04±4.51b 2 471±310b ET-1+10-5/mol姜黃素組 341.21±4.73b 2 154±308b ET-1+10-4/mol姜黃素組 319.43±3.83b 1 834±328b

2.2 姜黃素對(duì)VSMCs磷酸化ERK1/2活性表達(dá)的影響

用免疫印跡法檢測(cè)VSMCs磷酸化ERK1/2的表達(dá),以對(duì)照組磷酸化ERK1/2表達(dá)的相對(duì)值為1,各組磷酸化ERK1/2表達(dá)相對(duì)值見圖1。濃度為10-8mol/L的ET-1刺激VSMCs后,與對(duì)照組比較,VSMCs磷酸化ERK1/2活性的表達(dá)顯著增加(P＜0.05);無ET-1存在時(shí),濃度為10-5mol/L的姜黃素組與對(duì)照組比較,對(duì)磷酸化ERK1/2的表達(dá)無影響(P＞0.05)。在濃度為10-8mol/L的ET-1刺激后,10-5mol/L的姜黃素對(duì)VSMCs磷酸化ERK1/2的表達(dá)有顯著的抑制作用(P＜0.05),提示姜黃素抑制ET-1誘導(dǎo)的VSMCs增殖與阻斷磷酸化ERK1/2的表達(dá)有關(guān)。

3 討 論

圖1 姜黃素對(duì)血管平滑肌細(xì)胞ERK1/2磷酸化的影響

血管平滑肌細(xì)胞是動(dòng)脈血管壁的主要成份,血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜下遷移及過度增生,分泌細(xì)胞基質(zhì)是動(dòng)脈粥樣硬化和支架內(nèi)再狹窄的病理基礎(chǔ)[1,2]。細(xì)胞的增殖在細(xì)胞數(shù)量表現(xiàn)為細(xì)胞個(gè)數(shù)的增加,而細(xì)胞本身的生物學(xué)行為則表現(xiàn)為蛋白質(zhì)的合成增加、DNA的復(fù)制。其中DNA合成是細(xì)胞分裂增殖的主要標(biāo)志,細(xì)胞增殖越快,DNA合成亦越快。胸腺嘧啶是DNA合成的原料,當(dāng)DNA合成時(shí),3H-TdR摻入率增高,3H-TdR摻入率是反映細(xì)胞DNA合成,細(xì)胞增殖狀態(tài)敏感和理想的指標(biāo)。我們的研究結(jié)果顯示:經(jīng)ET-1刺激后,VSMCs計(jì)數(shù)增多,3H-TdR摻入率明顯增加(P＜0.05),而不同劑量的姜黃素則能顯著抑制VSMCs個(gè)數(shù)的增多和3HTdR摻入率的增加,提示姜黃素能抑制ET-1誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖。

絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族是一組廣泛存在細(xì)胞內(nèi)具有絲氨酸和蘇氨酸雙磷酸化能力的蛋白激酶。MAPKs是與細(xì)胞增殖關(guān)系最為密切的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶,是細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞核之間信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路[5,9]。在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中并存多條MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其中ERK1/2(P44/P42 MAPK)途徑被認(rèn)為是經(jīng)典的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,是細(xì)胞因子、生長因子介導(dǎo)細(xì)胞增殖效應(yīng)中最重要的途徑[10-11]。ERK1/2在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有二大特征:①活化的MAPK通過轉(zhuǎn)位方式進(jìn)入細(xì)胞核,激活其下游底物,主要是一些編碼核轉(zhuǎn)錄因子的早反應(yīng)基因(如原癌基因c-fos、c-myc、c-jum和Eng-1等)表達(dá),調(diào)控細(xì)胞生長反應(yīng),導(dǎo)致次級(jí)反應(yīng)基因(如基因ANF、MHC、MLC-2等)的異常表達(dá),影響細(xì)胞功能;②MAPK可將多個(gè)不同受體系統(tǒng)(如G蛋白 耦聯(lián)受體和蛋白酪氨酸激酶受體)介導(dǎo)的信號(hào)加以整合,起著多種信號(hào)的交匯點(diǎn)或共同通路作用。VSMCs增殖與MAPK的激活有關(guān)[12-13]。ET-1是VSMCs增殖的強(qiáng)力刺激劑,已發(fā)現(xiàn)ET-1引起VSMCs增殖是通過促進(jìn)MAPK活性上調(diào)而實(shí)現(xiàn)的[14-15]。

本研究發(fā)現(xiàn),ET-1誘導(dǎo)VSMCs的增殖伴有磷酸化ERK1/2表達(dá)的上調(diào),與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致。姜黃素在抑制ET-1誘導(dǎo)的VSMCs增殖的同時(shí),也抑制磷酸化ERK1/2的表達(dá)。表明姜黃素抑制ET-1誘導(dǎo)的VSMCs的增殖,可能與下調(diào)細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵的分子—ERK1/2的表達(dá),從而阻斷增殖信號(hào)在胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

最近Kapakos等[16-17]報(bào)道姜黃素可以通過PKB、ERK1/2等通路抑制胰島素、內(nèi)皮素等引起的A10血管平滑肌細(xì)胞增殖,說明姜黃素的作用有更復(fù)雜的機(jī)理,2013年Yu等[18]報(bào)道了sek-1,skn-1,sir-2.1等通路介導(dǎo)了姜黃素參與氧化應(yīng)激抵抗,如此看來,姜黃素的更廣泛的作用還需要繼續(xù)深入研究。

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