殷耒蘭,陳 琳,蘇 菊,姜 浩,蘇 琦,黃衛(wèi)國(guó),李躍華,唐三元

(1.湖南省胃癌研究中心南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,湖南衡陽(yáng)421001;2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所)

胃癌是全球第4位常見(jiàn)惡性腫瘤,每年大約有98.96萬(wàn)新發(fā)病例,73.8萬(wàn)人死于胃癌[1]。胃癌起病隱匿,早期常無(wú)特殊的明顯癥狀,也無(wú)明顯的體征,故發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已發(fā)生淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,這是導(dǎo)致其預(yù)后差、死亡率高的主要原因。DADS在體內(nèi)外抑制人胃癌MGC803細(xì)胞遷移和侵襲能力已有較多的實(shí)驗(yàn)依據(jù),其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-9、MMP-2、uPAR,上調(diào) TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3,Rac1-Rock1/Pak1通路介導(dǎo)LIMK1下調(diào),抑制cofilin1磷酸化[2-4]等有關(guān)。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶D在胃癌組織中高表達(dá),可能參與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移[5],但DADS是否通過(guò)下調(diào)Cath-D的表達(dá)抑制人胃癌MGC803細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討DADS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞遷移和侵襲的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胃癌MGC803細(xì)胞株、DADS由南華大學(xué)腫瘤研究所惠贈(zèng);胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程公司;LipofectamineTM2000、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司;siRNA由美國(guó) Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成(Cath-D siRNA 序列為:5′-GGATCCACCACAAGTACAA-3′、Control siRNA 序列為 5′-GGACCACAACAATGCTCAA-3′);RT試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自加拿大Fermentas公司;鼠抗人Cath-D蛋白單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人胃癌MGC803細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行,siRNA終濃度為50 nmol/L。培養(yǎng)6 h后更換為含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞,作為后續(xù)檢測(cè)。

1.3 RT-PCR檢測(cè)Cathepsin D mRNA水平

設(shè)計(jì)并合成半定量RT-PCR引物。Cath-D正義鏈 5′-CAA CAG CGA CAA GTC CAG C-3′,反義鏈5′-CTG AAT CAG CGG CAC GGC-3′(597 bp);β-actin為內(nèi)參照,5′-ATC TGG CAC CAC ACC T-3′,反義鏈 5′-CGT CAT ACT CCT GCT T-3′(837 bp)。使用Trizol提取細(xì)胞中總RNA,RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再通過(guò) PCR擴(kuò)增。PCR條件為94℃變性5 min;36個(gè)PCR循環(huán)(94℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃50 s);72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像儀觀察、拍照并分析。

1.4 Western blot檢測(cè)Cath-D蛋白水平

提取細(xì)胞總蛋白,蛋白定量,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后,5%的脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1 h;加入Cath-D、β-actin一抗,室溫下?lián)u動(dòng)反應(yīng)30 min后,置4℃冰箱過(guò)夜;TBST洗滌PVDF膜3次,每次10 min;加入相應(yīng)二抗,室溫下孵育60 min;TBST洗滌PVDF膜3次,每次10 min;加入ECL顯影劑,置于凝膠成像儀內(nèi),結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)量灰度值并分析。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞種于6孔板,轉(zhuǎn)染24 h后,用200 μL Tip頭在6孔板中沿著直尺劃痕,PBS沖洗3次,需DADS處理的3組加入含有30 mg/L DADS的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基,另外3組加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基,各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h,以各組劃痕邊緣細(xì)胞向劃痕內(nèi)部遷移的距離為觀察指標(biāo),分別在0 h和24 h在倒置顯微鏡下拍照并記錄,計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將Matrigel用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋,每個(gè)小室上層均勻鋪50 μL。制備單細(xì)胞懸液2×105/mL,下室加入500 μl含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,取 100 μL單細(xì)胞懸液接種到上室,需DADS處理的3組在上室加入30 mg/L DADS,37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,取出Transwell小室,4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡觀察,隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野侵襲至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù),計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以表示,組間區(qū)別用t檢驗(yàn)分析,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測(cè)DADS及干擾Cath-D對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞Cath-D mRNA表達(dá)的影響

加DADS 3組的Cath-D mRNA表達(dá)水平均較未加DADS 3組明顯下調(diào)(P＜0.05);Cath-D siRNA干擾組的Cath-D mRNA表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P＜0.05,圖1);陰性對(duì)照組與未干擾組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,圖1)。表明DADS能明顯下調(diào)Cath-D mRNA表達(dá)水平。

2.2 Western blot檢測(cè)DADS及干擾Cath-D對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞Cath-D蛋白表達(dá)的影響

圖1 DADS及干擾Cath-D對(duì)MGC803細(xì)胞Cath-D mRNA表達(dá)的影響

加DADS 3組的Cath-D蛋白表達(dá)水平均較未加DADS 3組明顯下調(diào)(P＜0.5);Cath-D siRNA干擾組的Cath-D蛋白表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P＜0.05,圖2);陰性對(duì)照組與未干擾組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,圖2)。表明DADS能明顯下調(diào)Cath-D蛋白表達(dá)水平。

2.3 DADS及干擾Cath-D對(duì)MGC803細(xì)胞遷移能力的影響

從圖3可見(jiàn),各組在0 h時(shí),劃痕距離大體相同(P＞0.05,表1)。24 h后,加DADS 3組的劃痕距離均較未加DADS 3組劃痕距離明顯增寬(P＜0.05);Cath-D siRNA干擾組較陰性對(duì)照組、未干擾組劃痕距離明顯增寬(P＜0.05,表1);陰性對(duì)照組與未干擾組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,表1)。

圖2 DADS及干擾Cath-D對(duì)MGC803細(xì)胞Cath-D蛋白表達(dá)表達(dá)的影響

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)劃痕距離的比較(μm)

圖3 DADS及干擾Cath-D對(duì)MGC803細(xì)胞遷移的影響(×100)

2.4 DADS及干擾Cath-D對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,加DADS 3組侵襲細(xì)胞數(shù)目均較未加DADS 3組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05);Cath-D siRNA干擾組較陰性對(duì)照組、未干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P＜0.05,表2);陰性對(duì)照組與未干擾組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,圖4,表2)。

圖4 DADS及干擾Cath-D對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲的影響(24 h,×200)

表2 干擾Cath-D與DADS聯(lián)合對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲(穿膜細(xì)胞數(shù),個(gè))的影響(24 h)

3 討 論

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,全世界每年有超過(guò)90萬(wàn)的人罹患胃癌并且有大約70萬(wàn)的人死于胃癌[6]。絕大部分胃癌患者就診時(shí)已是晚期,5年生存率只有10%,這主要與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[7],所以明確其機(jī)制已成為研究的熱點(diǎn)。

DADS是從大蒜中提取的一類脂溶性的有機(jī)硫化合物,對(duì)多種腫瘤具有明顯的抑制作用[8],是一種很有開發(fā)潛力的抗腫瘤藥物。DADS可抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制與G2/M阻滯,調(diào)節(jié) ATR/Chk1/Cdc25C/cyclin B1通路,激活p38、JNK通路,抑制ERK通路,下調(diào)Cdc25C蛋白表達(dá),上調(diào) Caspase-3mRNA表達(dá)等有關(guān)[9-13]。DADS可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞分化,其機(jī)制可能與ERK1/2通路抑制[14],p21WAF1、pRb表達(dá)增強(qiáng),突變型 p53、p21ras、c-Myc表達(dá)減弱,上調(diào) RORα蛋白等有關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,DADS作用人胃癌MGC803細(xì)胞24 h后,加DADS 3組較未加DADS 3組Cath-D mRNA與蛋白表達(dá)水平明顯下降,劃痕距離明顯增寬,穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,表明DADS能抑制人胃癌MGC803細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,其機(jī)制可能與下調(diào)Cath-D的表達(dá)有關(guān)。

Cath-D是存在于溶酶體內(nèi)的一種可溶性的天門冬氨酸蛋白酶,在正常細(xì)胞中以低濃度存在,其功能是在溶酶體的酸性pH環(huán)境下分解蛋白質(zhì),參與細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)[16-17]。研究發(fā)現(xiàn),Cath-D過(guò)表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的惡性表型和轉(zhuǎn)移能力,而在Cath-D基因敲除的裸鼠中發(fā)現(xiàn),腫瘤的形成和肺轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)受到明顯抑制,表明Cath-D與腫瘤的遷移和侵襲有一定的關(guān)系[18-19]。Ohri等[20]證實(shí)組織蛋白酶D前體能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移,這些效應(yīng)的發(fā)揮主要與活性肽的27～44位氨基酸有關(guān)。Li等[5]證實(shí)胃癌組織中Cath-D的含量明顯高于鄰近的正常胃黏膜,并且Cath-D與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度以及預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用siRNA干擾技術(shù)將Cath-D siRNA轉(zhuǎn)染人胃癌MGC803細(xì)胞,研究結(jié)果顯示,Cath-D siRNA下調(diào)Cath-D的mRNA與蛋白表達(dá)水平后,Cath-D siRNA干擾組較陰性對(duì)照組、未干擾組劃痕距離明顯增寬,侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少,表明Cath-D下調(diào)能明顯抑制人胃癌MGC803細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,Cath-D表達(dá)水平與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。加入DADS后,Cath-D siRNA干擾組的Cath-D mRNA與蛋白表達(dá)水平下降最為明顯,劃痕距離最寬,穿膜細(xì)胞數(shù)最少,表明DADS可能通過(guò)下調(diào)Cath-D的表達(dá)抑制人胃癌MGC803細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述,DADS能抑制人胃癌MGC803細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,其機(jī)制可能與下調(diào)Cath-D的表達(dá)有關(guān)。本研究為尋找抑制胃癌遷移和侵襲的作用靶點(diǎn)及藥物提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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