周定耕,詹向陽(yáng),張永虎,張大利

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科,湖南衡陽(yáng)421001;2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科)

膿毒癥急性肺損傷是一種由敗血癥或嚴(yán)重感染引起的一種危急并發(fā)癥,雖然目前的治療方法和手段已經(jīng)取得了較大的進(jìn)步,但其死亡率依然可達(dá)30%～50%[1]。和其他因素引起的急性肺損傷(A-cute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合癥(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)一樣,病理生理學(xué)上是肺泡毛細(xì)血管廣泛損傷,通透性增加,從而導(dǎo)致肺水腫、缺氧,以及多形核中性粒細(xì)胞滲入肺泡腔內(nèi),最終導(dǎo)致呼吸功能受損。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是催化血紅素降解為CO、亞鐵離子(Fe2+)以及膽紅素的限速酶。研究顯示,HO-1對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。因此,HO-1有可能是ALI進(jìn)展的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。藻藍(lán)素(C-phycocyanin,CPC)是一種從螺旋藻提取、加工而成的天然食用色素,是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]。本研究旨在探討CPC對(duì)HO-1表達(dá)的影響,并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

CPC,錫原卟啉(tin protoporphyrin IX,SnPP)為Sigma-Aldrich產(chǎn)品(純度98%)?？笻O-1多克隆抗體,抗Nrf2單克隆抗體、抗Akt磷酸化以及總Akt抗體購(gòu)自Cell Signaling公司?？故螃?actin、抗TATA盒結(jié)合蛋白(TATA-boxbinding protein,TBP)多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司,HRP標(biāo)記IgG抗體購(gòu)自Abcam公司。Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Bio-Rad。

1.2 膿毒癥急性肺損傷大鼠模型的構(gòu)建及分組

40只雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley雄性大鼠(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2010-0004,體重200～250 g)購(gòu)自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將其隨機(jī)分為5組:對(duì)照組(或假手術(shù)組):SD大鼠用10%水合氯醛生理鹽水麻醉(400 mg/kg),去除毛發(fā)并進(jìn)行皮膚消毒后,沿前腹正中線作3 cm長(zhǎng)的切口,取出盲腸,然后逐層關(guān)腹。模型組:取出盲腸后,用4.0絲線在距盲端1.5 cm處結(jié)扎,用18號(hào)針頭在盲腸結(jié)扎處遠(yuǎn)端穿刺2次,擠出少量糞便,隨后將盲腸回納入腹腔中,逐層關(guān)腹。 不同濃度 CPC(20、40、60 mg/kg)干預(yù)組:術(shù)后2 h分別予20、40、60 mg/kg CPC 腹腔注射,12 h后給予第二次注射。此外,在研究HO-1對(duì)超氧化物含量影響時(shí),另設(shè)SnPP干預(yù)組,即在60 mg/kg CPC干預(yù)組的基礎(chǔ)上,同時(shí)加入SnPP(30 μmol/kg)處理。72 h后處死大鼠用于下一步研究。

1.3 肺部O2-測(cè)定

新鮮的右肺組織切成5 mm×5 mm小塊,用Krebs-HEPES緩沖液孵育5～10 min。隨后加至含200 μL Krebs-HEPES緩沖液(含1.25 mm光澤精)的96孔培養(yǎng)板中,用發(fā)光測(cè)定儀(Microlumat LB96V,Berthold)于1 min讀取化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。隨后將所有肺組織在60℃干燥48 h,計(jì)算其總蛋白干重?；瘜W(xué)發(fā)光強(qiáng)度以1 min每毫克干重蛋白的相對(duì)發(fā)光單位(relative light unit,RLU)表示。

1.4 Western blot檢測(cè)HO-1表達(dá),Akt磷酸化以及Nrf2核轉(zhuǎn)位

根據(jù)試劑盒(Pierce)提供的步驟提取肺組織中的總蛋白或核蛋白,并測(cè)定其濃度。獲取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分離的總蛋白或核蛋白隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上(Millipore),并利用含有5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h,隨后加入抗、抗HO-1(1∶500)、β-actin(1∶5 000)、抗 Akt(1∶1 000)或抗 Nrf2(1∶1 000),抗TBP(1∶1 000)的抗體4℃孵育過(guò)夜。多次洗滌之后,加入 HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000稀釋)孵育膜1 h。ECL法(Amersham)發(fā)光、顯影。

1.5 HO-1酶活性測(cè)定

將獲取的肺組織勻漿18 000×g 4℃離心10 min,獲取400 μL上清加到反應(yīng)混合物中(含0.8 mmol/L NADPH、2 mmol/L葡糖糖-6-磷酸鹽、0.2 U葡糖糖6磷酸鹽-1脫氫酶、2 mg大鼠肝臟胞漿、100 mmol/L PBS以及10 μmol/L氯化血紅素)。反應(yīng)在黑暗的環(huán)境中37℃孵育1 h后加入1 mL氯仿終止反應(yīng)。并在463 nm和530 nm雙波長(zhǎng)測(cè)吸光度值(膽紅素吸光系數(shù)為40),以生成的膽紅素量表示HO-1活性,單位為nmol/(mg protein·h),并計(jì)算其與對(duì)照組的相對(duì)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)用表示,并采用單因素方差分析數(shù)據(jù),P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CPC對(duì)肺組織中HO-1蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組HO-1表達(dá)水平較低,膿毒性ALI大鼠肺組織中HO-1蛋白表達(dá)水平有輕微增高,而經(jīng)20～60 mg/kg CPC處理后,HO-1表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)(圖1)。

圖1 CPC對(duì)肺組織中HO-1表達(dá)的影響

2.2 CPC對(duì)肺組織中HO-1酶活性的影響

與對(duì)照組相比,模型組大鼠肺組織中HO-1酶活性輕微增高。給予CPC處理后,HO-1酶活性隨CPC濃度的增高而遞增。當(dāng)CPC濃度為30 mg/kg時(shí),HO-1活性是對(duì)照組的4.6倍(圖2)。

圖2 CPC對(duì)肺組織中HO-1酶活性的影響

2.3 CPC對(duì)肺組織中Akt磷酸化的影響

對(duì)照組以及模型組大鼠肺組織中磷酸化Akt含量較低。CPC處理后能明顯增加磷酸化Akt的水平,而總Akt在所有處理組中保持恒定(圖3)。

2.4 CPC對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2活化的影響:

Western blot結(jié)果顯示,ALI大鼠肺組織內(nèi)細(xì)胞核中Nrf2含量?jī)H輕微高于對(duì)照組,而CPC處理后,細(xì)胞核中Nrf2水平隨著CPC濃度的增高而遞增,表明CPC能誘導(dǎo)Nrf2從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中(圖4)。

2.5 CPC對(duì)肺組織中超氧化產(chǎn)物含量的影響

與對(duì)照組相比,ALI大鼠肺組織中O2-明顯增高。不同濃度CPC干預(yù)后,與模型組相比,超氧化產(chǎn)物含量隨之降低。其中60 mg/kg CPC處理后,其含量降低至30.7%,而SnPP可明顯消除CPC的抑制作用(圖5)。

圖3 CPC對(duì)肺組織中Akt磷酸化的影響

圖4 CPC對(duì)肺組織中Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響

圖5 CPC對(duì)膿毒性ALI大鼠肺組織中超氧化物含量的影響

3 討 論

HO-1是催化血紅素降解為CO、亞鐵離子和膽紅素的限速酶,并在機(jī)體的抗炎癥、抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),HO-1的表達(dá)增加被認(rèn)為是宿主細(xì)胞免受免疫病理?yè)p傷或應(yīng)激損傷的一種適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制。Rushworth等[4]研究發(fā)現(xiàn),LPS可誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生HO-1和NQO1,從而調(diào)節(jié)機(jī)體過(guò)度的免疫應(yīng)答。在大齡小鼠模型中,HO-1能調(diào)節(jié)流感病毒或病毒感染引起的免疫反應(yīng)[5]。因此,以HO-1為出發(fā)點(diǎn),尋求有效的誘導(dǎo)劑,對(duì)ALI的炎癥反應(yīng)的防治具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn),CPC處理后,不但可誘導(dǎo)HO-1蛋白的表達(dá),也能上調(diào)其酶活性水平,這說(shuō)明CPC通過(guò)上調(diào)HO-1的表達(dá)而抑制肺組織內(nèi)的過(guò)度的炎癥反應(yīng)。目前,HO-1發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制仍未完全明了。其介導(dǎo)的游離血紅素降解,以及產(chǎn)生抗炎癥的復(fù)合物比如膽綠素/膽紅素和CO等可能與HO-1的抗炎癥活性有關(guān)[6]。

PI3K是參與細(xì)胞生長(zhǎng)以及骨架重塑的重要激酶,其激活后可導(dǎo)致脂質(zhì)底物磷酸化而形成第二信使,并激活下游蛋白激酶B,即Akt。因此檢測(cè)Akt的磷酸化可間接反映PI3K的激活[7]。本研究證實(shí)CPC處理后能明顯誘導(dǎo)Akt磷酸化。研究顯示,PI3K/Akt的活化不僅可以上調(diào)HO-1基因表達(dá),而且可能與HO-1的細(xì)胞保護(hù)作用相關(guān)。因此,CPC對(duì)HO-1的誘導(dǎo)可能與激活PI3K通路有關(guān)。

研究顯示,HO-1基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的結(jié)合位點(diǎn)。在非激活情況下,Nrf2通過(guò)與抑制物keap1結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到外源性刺激時(shí),Nrf2從keap1中分離出來(lái),轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),從而與應(yīng)激誘導(dǎo)性基因包括HO-1的啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化劑應(yīng)答元件結(jié)合[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)CPC處理后,Nrf2轉(zhuǎn)位增加,這與肺組織中HO-1蛋白表達(dá)的趨勢(shì)一致,表明CPC誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)可能是由于Nrf2的活化所致。HO-1的代謝產(chǎn)物如CO和膽綠素在多種肺部疾病包括ALI中發(fā)揮抗氧化和抗炎癥作用,包括抑制促炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、ROS形成[10]。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)HO-1在CPC的保護(hù)效應(yīng)中的作用,在干預(yù)過(guò)程中加入SnPP,對(duì)組織中超氧化物的含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,不同濃度CPC處理可明顯降低膿毒性ALI大鼠中的超氧化物含量。此外,利用HO-1抑制劑SnPP處理后,可削弱CPC的保護(hù)效應(yīng),這再次表明CPC的保護(hù)效應(yīng)與HO-1有關(guān)。

總之,本研究證實(shí)CPC能有效誘導(dǎo)膿毒性ALI大鼠肺組織表達(dá)HO-1,其機(jī)制可能與PI3K/Akt和Nrf2的激活有關(guān)。HO-1可通過(guò)多種機(jī)制降低肺組織中超氧化物含量,最終發(fā)揮對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用。

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