杜挺挺，陳 蔭，鐘城城，王曉波，曲有樂

（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

貽貝多糖的結(jié)構(gòu)修飾及其體外抗腫瘤活性測定

杜挺挺，陳 蔭，鐘城城，王曉波，曲有樂

（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

采用三氧化硫吡啶法對厚殼貽貝多糖（MT1）結(jié)構(gòu)進行硫酸化修飾，并對修飾后多糖進行了體外抗腫瘤活性測定。在樣品：三氧化硫吡啶=1:6，溫度為90℃條件下反應(yīng)6 h，實驗結(jié)果表明：硫酸化多糖（MTS）得率為34%，且修飾后硫酸根含量從6.51%提升到32.95%。體外抗腫瘤活性測定結(jié)果顯示：濃度為8 mg/mL的MT1、MTS對前列腺癌DU-145細(xì)胞作用72 h后的抑制率分別為79.35%、85.04%，且IC50為2.04 mg/mL，1.72 mg/mL；而對人肺癌H1299細(xì)胞作用72 h后的抑制率分別為:81.28%、85.32%，以及IC50分別為2.46 mg/mL，1.71 mg/mL。結(jié)論：在該條件下修飾后的硫酸化貽貝多糖能提高抗腫瘤活性。

貽貝多糖；硫酸化；抗腫瘤活性

厚殼貽貝為海洋軟體動物門雙殼綱貝類，又稱海紅、淡菜，其營養(yǎng)豐富，富含活性物質(zhì)，在食用和藥用上都有很大價值，在舟山海域廣泛分布。研究表明貽貝多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、降血脂等多種功能活性[1-2]。貽貝多糖活性大小與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，文獻表明，一定含量范圍內(nèi)的硫酸根和磷酸根促使多糖具有更高抗腫瘤活性[3-5]。因此對其進行硫酸酯化、磷酸化、烷基化等適當(dāng)?shù)男揎?，可獲得具有更高活性的多糖化合物[6-7]。目前國內(nèi)外對天然修飾的多糖的報道大多來自于菌類、植物中，而從海洋軟體動物中，尤其是貝類中提取多糖進行修飾的報道不多[8-10]。為此，本文從新鮮的厚殼貽貝中提取多糖，并進行分離純化，再通過硫酸酯化修飾。分別從含量，取代度，結(jié)構(gòu)變化以及抗腫瘤活性等方面進行初步研究，結(jié)果證明經(jīng)修飾后的厚殼貽貝多糖活性有所提高，為應(yīng)用于保健食品與醫(yī)藥等領(lǐng)域提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑

厚殼貽貝多糖（MT1）由本實驗室制備；前列腺癌DU-145細(xì)胞和人肺癌H1299細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所；三氧化硫吡啶、DMF、明膠為 Amresco產(chǎn)品；濃鹽酸為市售分析純試劑;二甲基亞砜；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，上海歐韋達儀器科技有限公司。

1.2 儀器

HH-S型水浴鍋，鄭州科工貿(mào)有限公司；SL-12N型冷凍干燥機，南京順流儀器有限公司；752型紫外可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Necolit5D×B型紅外光譜儀，美國傅立葉變換紅外光譜儀；高速冷凍離心機，日立公司產(chǎn)品；Forma 3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；680型全自動酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 硫酸化修飾

1.3.1.1 硫酸化厚殼貽貝多糖的制備

采用了三氧化硫吡啶法[11-12]對厚殼貽貝多糖進行了酯化，首先取50 mg厚殼貽貝多糖MT1,懸浮于3 mL DMF中攪拌30 min,然后加入0.3 g三氧化硫吡啶,在90℃下均勻攪拌,反應(yīng)6 h，然后加入3倍體積的無水乙醇進行沉淀,離心15 min(8 000 r/min)取沉淀,透析(3.5 kDa),冷凍干燥得硫酸化衍生物MTS。

1.3.1.2 硫酸基含量測定

貽貝多糖樣品中硫酸基含量的測定,采用氯化鋇-明膠比濁法。取樣品MT1和MTS各15 mg放入安瓿瓶中,分別加2 mol/L的三氟乙酸2 mL，封管，105℃下加熱6 h。吸取0.5 mL水解液在500 nm處測定其吸光度,以無水K2SO4作標(biāo)準(zhǔn)物獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線后計算得硫酸基含量，取代度(DS)=1.62×S%/(32-1.02× S%)，S%是樣品中硫的百分含量。

1.3.2 紅外光譜測定

為進一步鑒定厚殼貽貝多糖MT1經(jīng)硫酸化修飾后的結(jié)果，采用紅外光譜進行鑒定。

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制率的測定

采用MTT法[13]，將MT1、MTS分別配置成濃度為0.5 mg/mL，1.0 mg/mL，2 mg/mL，4.0 mg/mL，8.0 mg/mL五個濃度組，分別測定作用24 h、48 h和72 h后,對前列腺癌DU-145細(xì)胞株和人肺癌H1299細(xì)胞株增殖的影響。

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)修飾結(jié)果

由硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 硫酸根含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard carve of sulfate content

在本實驗條件下，多糖硫酸化回收率為34%。數(shù)據(jù)顯示，多糖硫酸化產(chǎn)率偏低，其原因可能是高溫引起部分多糖被降解成低聚物，在后續(xù)處理過程中被透析。此外，高溫易引起多糖結(jié)構(gòu)破壞，因此更易產(chǎn)生副反應(yīng)而降低MTS產(chǎn)量[14]。經(jīng)氯化鋇-明膠法測定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得MT1中硫酸根含量為6.51%，而MTS中硫酸根含量為32.95%，取代度從0.12提升到了0.86。硫酸根含量明顯增加。

2.2 紅外測定結(jié)果

硫酸化后的多糖除了在1 600 cm-1、1 400 cm-1、1 100 cm-1左右有特征吸收峰外，且在1 240 cm-1左右有明顯的吸收峰，說明有S=O伸縮振動，證明有硫酸基鍵存在；同時在850 cm-1附近也有吸收峰，說明C-O-S的伸縮振動，進一步證明存在硫酸基鍵。紅外譜圖結(jié)果表明：貽貝多糖硫酸化修飾有成果。

2.3 體外抗腫瘤實驗結(jié)果

2.3.1 MT1、MTS樣品對前列腺癌DU-145細(xì)胞的抑制作用

本試驗測定了MT1、MTS樣品對前列腺癌DU-145細(xì)胞的增殖抑制作用,在用量和時間等因素考慮對兩種細(xì)胞生長抑制效率的影響。在一定范圍內(nèi)，隨著樣品濃度增加，對DU-145癌細(xì)胞生長抑制率越高；隨著作用時間增長，癌細(xì)胞生長抑制率也有所提高，呈現(xiàn)了時效和量效的關(guān)系，且硫酸化修飾后多糖抗腫瘤活性相對較好。實驗結(jié)果如圖3～6所示。

圖2 MT1、MTS紅外譜圖Fig.2 IR spectrum of MT1,MTS

圖3 MT1、MTS分別添加24h后對DU-145抑制率Fig.3 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 after 24 h

圖4 MT1、MTS分別添加48h后對DU-145抑制率Fig.4 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 after 48 h

圖5 MT1、MTS分別添加72 h后對DU-145抑制率Fig.5 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 after 72 h

圖6 相同添加量MT1、MTS在不同時間對DU-145的抑制率Fig.6 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 in different time

2.3.2 MT1、MTS樣品對人肺癌H1299細(xì)胞的抑制作用

從圖7～10可以看出，在一定范圍內(nèi)，MT1和MTS對腫瘤細(xì)胞H1299的抑制作用隨樣品濃度的增加以及時間的增長而增強，呈現(xiàn)了量效和時效的關(guān)系，且添加量的影響作用大于添加時間的影響。此外，圖中數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)硫酸化后的多糖MTS的對腫瘤細(xì)胞抑制作用強于未修飾的多糖MT1。

圖7 MT1、MTS分別添加24 h后對H1299抑制率Fig.7 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 after 24 h

圖8 MT1、MTS分別添加48 h后對H1299抑制率Fig.8 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 after 48 h

圖9 MT1、MTS分別添加72 h后對H1299抑制率Fig.9 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 after 72 h

圖10 相同添加量MT1、MTS在不同時間對H1299的抑制率Fig.10 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 in different time

3 結(jié)論

厚殼貽貝多糖的硫酸化與磷酸化同為聚陰離子修飾,國內(nèi)外對其研究越來越重視。為了得到更多含硫的貽貝多糖化合物可以使活性增加的依據(jù)，本實驗室通過化學(xué)合成的方法得到了厚殼貽貝多糖的衍生物，再通過分別測定未經(jīng)修飾的貽貝多糖MT1和經(jīng)化學(xué)修飾后的MTS的硫酸根含量，結(jié)果顯示經(jīng)修飾后貽貝多糖硫酸根的含量明顯提高。最后經(jīng)MTT法對MT1、MTS進行初步抗腫瘤活性檢測，經(jīng)硫酸化修飾后的貽貝多糖對DU-145和H1299細(xì)胞的生長的抑制作用有所提高。在一定含量范圍內(nèi)硫酸基團對多糖抗腫瘤活性起重要作用，為今后貽貝多糖硫酸化及衍生物在功能性食品或藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

[1]蘇秀榕,李太武,丁明進.紫貽貝和厚殼貽貝營養(yǎng)成分的研究[J].中國海洋藥物,1998,17(2):30-32.

[2]李江濱,黃迪南.貽貝的藥用價值研究進展[J].水產(chǎn)科學(xué),2004,23(11):43-44.

[3]VISHCHUK O S,ERMAKOVA S P,ZVYAGINTSEVA T N.Sulfated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonica and Undaria pinnatifida:isolation,structural characteristics,and antitumor activity[J].Carbohydrate Research,2011(346):2 769-2 776.

[4]WIJESEKARAA I,PANGESTUTIA R,KIMA B SE-KWON.Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae[J].Carbohydrate Polymers,2011(84):14-21.

[5]CHEN Cong,WU Wenhua,XU Xiaojuan,et al.Chain conformation and anti-tumor activity of derivatives of polysaccharide from Rhizoma Panacis Japonici[J].Carbohydrate Polymers,2014(105):308-316.

[6]李全才,李春霞,勾東霞,等.磷酸化多糖的研究進展[J].生命科學(xué),2013,25(3):262-266.

[7]羅佳捷,張 彬,王 潔,等.硫酸化多糖的最新研究進展[J].廣東飼料,2012(6):28-30.

[8]KAMEI I,TAKAGI K,KONDO R.Degradation of endosulfan and endosulfan sulfate by white-rot fungus Trameteshirsuta[J]. Journal of Wood Science,2011(57):317-322.

[9]靳文娟,魯曉翔.硫酸化雞油菌多糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響[J].食品科技,2012(8):168-172.

[10]王新宇,遲 祥,石 亮,等.2種方法制備硫酸化小刺猴頭菌多糖[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,35(6):704-707.

[11]李 珺,鐘耀廣,劉長江.香菇多糖硫酸酯化修飾的研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(1):14-16.

[12]張 佳.玉米芯木聚糖硫酸酯的制備及其抗炎活性研究[D].濟南:山東大學(xué),2011.

[13]司徒鎮(zhèn)強,吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].西安:世界圖書出版公司,2004:250-252.

[14]朱玉婷,譚 姚,莫開菊.硫酸酯化修飾葛仙米多糖工藝研究[J].食品科學(xué),2011,32(24):46-49.

Structure Modification and Research on Antitumor Activity of Mussel Polysaccharide

DU Ting-ting,CHENG Ying,ZHONG Cheng-cheng,et al
(Food and Pharmacy School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

Mussel polysaccharide structure wasmodified bysulphur trioxide pyridine,and antitumor activity of Sulfated polysaccharides was investigated in vitro.The condition of Sulfuric acid esterification experiment was that:the quality proportion of sample and sulphur trioxide pyridine was 1:6,reaction temperature was 90℃and reaction time was 6h.It showed that:the yield of sulfated polysaccharide(MTS)was 34%,and the content of SO42-was improved from 6.51%to 32.95%.Antitumor activity test in vitro showed that:inhibitory effect of MT1, MTS on DU-145 was 79.35%,85.04%,and IC50was 2.04mg/mL，1.72mg/mL.The inhibitory effectno H1299 was 81.28%,85.32%and IC50was 2.46 mg/mL,1.71mg/mL.Conclusion:Sulfated polysaccharide can improve the antitumor activity.

mussel polysaccharide;sulfating;antitumor activity

S284

A

1008－830X(2014)04－0354－04

2014-03-20

浙江省科技廳項目（2010R50029-19）

杜挺挺（1991-），女，浙江東陽人，碩士研究生，研究方向：天然藥物提取.E-mail:714716887@qq.com

曲有樂（1960-），男，教授，研究方向：天然藥物活性結(jié)構(gòu)改造與設(shè)計.E-mail:youle1960@163.com