向 赟，王 剛，楊紹文，陳兆明，孫成波,2

（1．廣東海洋大學水產學院，廣東湛江 524025；2.廣東高校熱帶海產無脊椎動物養(yǎng)殖工程技術研究中心，廣東湛江 524025；3.廣東海洋大學實驗教學部，廣東湛江 524025）

不同溫度條件下溶壁微球菌和白斑綜合癥病毒對凡納濱對蝦的致病性

向 赟1，王 剛1，楊紹文1，陳兆明1，孫成波1,2

（1．廣東海洋大學水產學院，廣東湛江 524025；2.廣東高校熱帶海產無脊椎動物養(yǎng)殖工程技術研究中心，廣東湛江 524025；3.廣東海洋大學實驗教學部，廣東湛江 524025）

研究在3種不同溫度（19±1℃、25±1℃、31±1℃）條件下不同濃度的溶壁微球菌和白斑綜合癥病毒對凡納濱對蝦的致病性。通過單獨及合并感染對蝦記錄其死亡率并檢測病毒攜帶量。結果顯示：溫度19±1℃條件下，至實驗結束各組累積死亡率和病毒攜帶量分別低于7.7%，8.6×102copy/g。溫度25±1℃條件下，48～96 h單獨感染WSSV累積死亡率與合并感染組差異顯著（P＜0.05），而且合并感染組不同濃度之間存顯著差異（P＜0.05），死亡率和病毒量最大值分別為71.1%，6.2×105copy/g（合并感染濃度9.5×107cfu/mL組）。溫度31±1℃條件下，各組累積死亡率在48 h迅速升高，合并感染組死亡率和病毒攜帶量（最大值：75.6%，2.0×106copy/g）明顯高于單獨感染WSSV組（42.2%，2.2×104copy/g）。隨著感染時間延長，單獨細菌感染組對蝦死亡率隨感染濃度升高而升高（最大值：71.1%）。因此合并感染對對蝦養(yǎng)殖危害更大，且隨著溫度升高，溶壁微球菌和合并感染的致病力隨溫度升高而升高，即溫度能顯著影響溶壁微球菌和WSSV的致病力。

溫度；溶壁微球菌；白斑綜合癥病毒；凡納濱對蝦

凡納濱對蝦是全球3大對蝦養(yǎng)殖品種之一[1]。但隨著人工養(yǎng)殖規(guī)模擴大及密度越來越大，產生的一系列問題限制了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，如養(yǎng)殖環(huán)境惡化，多種疾病爆發(fā)，種質退化等。其中疾病發(fā)生已給對蝦養(yǎng)殖造成巨大損失，如白斑綜合癥、紅體病、爛鰓病等[2-3]。白斑綜合癥是由一種宿主廣泛，傳染性強，對蝦高致死性病毒--白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）引起。很多研究報道白斑綜合癥發(fā)生與蝦體免疫水平，感染方式，環(huán)境因子等有關[4-5]。人工養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖動物感染的病原體可能不僅僅只有一種，可能有兩種或多種[6-8]。如水質惡化，會引起水體中細菌數量增多，極有可能發(fā)生二次感染。溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus屬革蘭氏陽性菌，是一種條件致病菌。且溶壁微球菌對對蝦致病力較弱，國內關于溶壁微球菌與白斑綜合癥發(fā)生是否相關的研究較少，所以本文研究在不同溫度條件下合并注射感染及單獨注射感染WSSV和不同濃度的溶壁微球菌，探討在不同溫度條件下溶壁微球菌和WSSV對凡納濱對蝦的致病性，對對蝦養(yǎng)殖健康可持續(xù)發(fā)展有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 健康對蝦來源

健康凡納濱對蝦取自廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地，體長為8.61±0.39 cm。實驗前隨機抽取10尾對蝦進行熒光定量PCR檢測，檢測結果為陰性。實驗前暫養(yǎng)5 d，投喂對蝦人工配合餌料2次/日，換水1次/d，日換水量接近100%。

1.1.2 WSSV粗提液制備

取感染WSSV癥狀明顯的凡納濱對蝦，去除甲殼，按1:1（W∶V）加入高鹽PBS，冰浴中勻漿，將勻漿液于4℃、7 000 r/min離心15 min；離心后的上清液加入蔗糖至終濃度為30%（W/W），4℃、16 000 r/min超速離心50 min，棄上清，沉淀用PBS（pH 7.4）重懸，將重懸液用0.45 μm的濾膜過濾，分裝后-80℃冰箱保存。

1.1.3 菌株

對蝦病原菌-溶壁微球菌，由西北農林科技大學劉小林教授實驗室提供，經接種、活化培養(yǎng)24 h后，用無菌PBS緩沖液稀釋制備菌懸液菌。

1.1.4 DNA模板提取和引物設計

DNA模板提取方法參照SUN等[9]的方法，PCR引物參照YOU等[10]的引物設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 感染方式

本實驗采用人工注射感染，在凡納濱對蝦第2腹節(jié)與第3腹肌之間往心臟方向注射40 μl病原緩沖液，3種合并感染注射液含病毒粒子濃度都為3.2×102copy/μL，含溶壁微球菌濃度分別為9.5×107cfu/mL、9.5×106cfu/mL、9.5×105cfu/mL；單獨感染注射液：含3.2×102copy/μL的病毒稀釋液，3種含9.5×107cfu/ mL、9.5×106cfu/mL、9.5×105cfu/mL的溶壁微球菌菌懸液。

1.2.2 溫度對感染不同濃度溶壁微球菌和WSSV的凡納濱對蝦的影響

將實驗對蝦分別培養(yǎng)在19±1℃、25±1℃、31±1℃有60 L水的0.1 m3塑料桶中，實驗組分為合并感染組（合并感染WSSV與溶壁微球菌）與單獨感染組（單獨感染WSSV，單獨感染3種濃度的溶壁微球菌），各組均設置3個平行，每組對蝦各30尾，對照組注射40 μl PBS緩沖液。實驗中投喂對蝦人工配合餌料2次/日，24 h充氣，定時吸出排泄物，日換水量20%。及時取出死亡對蝦放入-20℃冰箱保存。各組在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h取樣保存。觀察記錄對蝦發(fā)病及死亡率，定期檢測對蝦組織中病毒含量，并對死亡對蝦進行病毒檢測。

1.2.3 病毒檢測方法

病毒檢測采用熒光定量PCR方法參考程曉燕等[11]。

2 實驗結果

2.1 溫度19±1℃下WSSV和溶壁微球菌對凡納濱對蝦的致病性

2.1.1 溫度19±1℃下感染WSSV和溶壁微球菌的凡納濱對蝦死亡情況

當溫度為19±1℃時，單獨感染不同濃度的溶壁微球菌和WSSV與合并感染兩種病原對凡納濱對蝦的累積死亡率影響不大，至實驗結束各組累積死亡率低于最大值7.7%，如圖1。

圖1 19±1℃下對感染溶壁微球菌和WSSV的凡納濱對蝦的影響Fig.1 Impact of M.lysodeikticus and WSSV infected L.vannamei at 19±1℃

2.1.2 溫度19±1℃下感染不同濃度溶壁微球菌對凡納濱對蝦攜帶WSSV的影響

在溫度19±1℃條件下，整個實驗過程中單獨感染WSSV對蝦體內攜帶病毒量與合并感染組無顯著差異（P>0.05），各組病毒攜帶量都低于8.6×102copy/g，見表1。

表1 溫度19±1℃下感染不同細菌濃度對凡納濱對蝦體內病毒攜帶量的影響Tab.1 Effects on amount of virus in L.vannamei by infected different concentrations of bacterial at 19±1℃

2.2 溫度25±1℃下WSSV和溶壁微球菌的凡納濱對蝦的致病性

2.2.1 溫度25±1℃下感染WSSV和溶壁微球菌的凡納濱對蝦死亡情況

在溫度25±1℃條件下，整個實驗過程中0～24 h各組的累積死亡率低于2.0%，幾乎沒有死亡，至48 h單獨感染WSSV組對蝦累積死亡率最大為21.0%顯著高于其他組（P＜0.05）；至72 h出現差異變化，單獨感染WSSV組累積死亡率50.0%和合并感染濃度為9.5×107cfu/mL的56.7%顯著高于其他組（P＜0.05），細菌單獨感染組濃度為9.5×107cfu/mL（20.0%）明顯高于其它細菌單獨感染濃度組的累積死亡率（5.6%）（P＜0.05）。至96 h細菌單獨感染濃度為9.5×107cfu/ml顯著高于其他細菌單獨感染，所有感染WSSV組與未感染WSSV之間存在顯著差異，如圖2。

圖2 溫度25±1℃下對感染WSSV和溶壁微球菌凡納濱對蝦的影響Fig.2 Impact of M.lysodeikticus and WSSV infected L.vannamei at 25±1℃

2.2.2 溫度25±1℃下感染溶壁微球菌對凡納濱對蝦攜帶WSSV的影響

在溫度25±1℃條件下，整個實驗過程中，單獨感染WSSV對蝦體內攜帶病毒量與合并感染組在24 h、48 h、96 h存在顯著差異（P＜0.05），在72 h合并感染濃度為9.5×107cfu/mL組與另兩合并感染組存在顯著差異，72 h單獨感染WSSV組對蝦體內攜帶病毒量與合并感染組不存在顯著差異，見表2。

表2 溫度25±1℃下感染不同細菌濃度對凡納濱對蝦體內病毒攜帶量的影響Tab.2 Effects on amount of virus in L.Vannamei by infected different concentrations of bacterial at 25±1℃

2.3 溫度31±1℃下WSSV和溶壁微球菌對凡納濱對蝦的致病性

2.3.1 溫度31±1℃下感染WSSV和溶壁微球菌的凡納濱對蝦死亡情況

在溫度31±1℃條件下，0～24 h各組的累積死亡率低于5.6%，至48 h合并感染組濃度為9.5×105cfu/mL、9.5×106cfu/mL的累積死亡率明顯高于單獨感染WSSV組和細菌單獨感染濃度為9.5×105cfu/mL、9.5×106cfu/ mL，顯著低于細菌單獨感染濃度為9.5×107cfu/mL（50.0%）及合并感染濃度為9.5×107cfu/mL（48.9%）；至72 h單獨細菌感染組累積死亡率升高，單獨感染WSSV組和單獨細菌感染濃度為9.5×105cfu/mL都顯著低于其它感染組（P＜0.05），且其它感染組之間無顯著差異。至96 h單獨感染WSSV組累積死亡率顯著低于所有細菌感染組（P＜0.05），合并感染濃度為9.5×107cfu/mL組累積死亡率達到最大值75.6%，見圖3。

圖3 溫度31±1℃對感染WSSV和溶壁微球菌的凡納濱對蝦的影響Fig.3 Impact of M.lysodeikticus and WSSV infected L.vannamei at 31±1℃

2.3.2 溫度31±1℃下感染溶壁微球菌對凡納濱對蝦攜帶WSSV的影響

在溫度31±1℃條件下，整個實驗過程中，至12 h單獨感染WSSV組病毒攜帶量明顯低于合并感染濃度為9.5×107cfu/mL、9.5×106cfu/mL組（P＜0.05），24 h時合并感染濃度為9.5×107cfu/mL、9.5×106cfu/mL組與合并感染濃度為9.5×105cfu/mL組、單獨感染WSSV組存在顯著差異（P＜0.05），至48 h病毒攜帶量迅速增加，各組之間無顯著差異，72～96 h病毒攜帶量維持在較高水平，見表3。

表3 溫度31±1℃下感染不同細菌濃度對凡納濱對蝦體內病毒攜帶量的影響Tab.3 Effects on amount of virus in L.vannamei by infected different concentrations of bacterial at 31±1℃

3 討論

隨著凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，伴隨的一系列問題不容忽視，尤其是病害問題，如在表面健康無明顯癥狀的對蝦體內能檢測到WSSV，且在夏季對蝦體內病毒攜帶量高于秋季[12]。對蝦養(yǎng)殖中也出現WSSV和致病弧菌合并感染現象，如SELVIN等[13]在感染WSSV對蝦體內分離到致病性鰻弧菌。溫度不僅直接影響對蝦的新陳代謝、抗病能力、進食、生存發(fā)育，還對病毒及弧菌在對蝦體內增殖有重要影響。如對蝦偷死綜合癥一般發(fā)生在養(yǎng)殖60 d后，且多在高溫季節(jié)暴發(fā)，尤其在蛻殼期間極易發(fā)生，在低溫和養(yǎng)殖前期危害不大[14]。

在溫度為19±1℃條件下，各組對蝦累積死亡率和病毒含量都很低，累積死亡率低于7.7%，病毒含量低于8.6×102copy/g。說明在低溫19±1℃條件下，WSSV和溶壁微球菌的增殖都受到了抑制，溶壁微球菌致病力與感染劑量無關，屬于潛伏感染，此結果與管越強等[15]報道當水溫低于15℃對日本囊對蝦體內WSSV的增殖情況相符，DU等[16]報道在低溫10±1℃條件下蝦體內病毒攜帶量明顯低于24±1℃條件下病毒攜帶量。

在溫度25±1℃條件下，0～24 h各組的累積死亡率低于2.0%（P＞0.05），病毒攜帶量低于6.0×102copy/g，48 h單獨感染WSSV組累積死亡（21.1%）和病毒含量（1.9×105copy/g）明顯高于其他組。72 h后死亡加速，伴有死亡高峰（P＜0.05），病毒含量隨著合并感染濃度升高而提高，與累積死亡率結果相符。說明在溫度25±1℃條件下，對蝦感染病原體沒有立即發(fā)病，有一定的潛伏期，但隨著時間延長，死亡加快，病毒增殖也加快，合并感染組中病毒增殖受溶壁微球菌感染濃度影響顯著（P＜0.05），但前期比單獨感染WSSV組病毒增殖要慢，有研究報道少量病原菌侵入對蝦體內，酚氧化酶原系統(tǒng)被病原菌細胞壁的多糖激活，產生一種細胞毒殺作用[17]，是否由于少量細菌入侵，短暫提高對蝦免疫力，對WSSV初期增殖產生影響有待進一步研究。而且李侃等認為WSSV在對蝦體內增殖速度受到感染初期病毒侵染對蝦組織細胞能力高低的直接影響[18]。單獨感染溶壁微球菌中發(fā)現溶壁微球菌數量達到產生毒力閥值所需時間因感染濃度不同而不同，因此溫度25±1℃條件下，溶壁微球菌的致病力和WSSV在對蝦體內增殖與溶壁微球菌感染濃度密切相關。

在溫度31±1℃條件下，0～24 h各組的累積死亡率低于5.6%（P＞0.05），但對蝦體內病毒在12 h時出現增殖高峰期，明顯高于單獨感染WSSV組，48 h后合并感染組累積死亡率隨溶壁微球菌感染濃度升高而升高，病毒含量同樣高于單獨感染WSSV組，說明在高溫條件下，提高了合并感染中病原體對對蝦的致死率，并大大縮短了發(fā)病時間。對比溫度25±1℃條件下單獨感染WSSV組結果可知在溫度31±1℃下單獨感染WSSV組對蝦體內WSSV增殖受到一定程度的抑制，與研究報道在高溫33℃條件下，可以延緩感染WSSV對蝦發(fā)病，抑制WSSV在對蝦體內增殖，降低死亡率相符[19-20]。合并感染組的病毒增殖情況剛好相反，溫度31±1℃條件下整個實驗中病毒在對蝦體內增殖迅速，死亡率至48 h迅速升高。說明合并感染后，高溫引起溶壁微球菌迅速增殖，并促使WSSV在對蝦體內迅速增殖，現在對高溫對WSSV增殖的抑制作用機理尚不清楚，高溫可能引起感染宿主細胞加速凋亡[21]；甲殼動物體內血細胞數會隨著溫度升高而增加，溫度升高將激活酚氧化酶原系統(tǒng)，提高對蝦免疫水平[22-24]；高溫能影響多數昆蟲病毒復制的多個環(huán)節(jié)，推測高溫也能影響WSSV復制的多個環(huán)節(jié)[25]。從單獨感染溶壁微球菌組結果中發(fā)現在高溫條件下，溶壁微球菌致病力明顯提高，且發(fā)病時間隨感染濃度升高而縮短，較溫度25±1℃條件下結果，說明感染溶壁微球菌發(fā)病時間隨溫度升高而縮短。已有研究報道某些弧菌致病力隨著溫度升高而升高，同等溫度條件下鰻弧菌感染劑量與感染程度密切相關，高溫能提高對蝦對鰻弧菌的易感性，大大縮短對蝦的發(fā)病時間[26,27]。此結果也說明現在的連續(xù)養(yǎng)殖模式中，隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大和養(yǎng)殖時間推移，引起水體富營養(yǎng)化加重，高溫促使合并感染發(fā)生，引起對蝦死亡。這可能也是目前華南地區(qū)中造蝦變的難養(yǎng)的原因。

綜上，本實驗結果較好的解釋目前對蝦養(yǎng)殖生產中一些想象，如（1）冬棚養(yǎng)殖成功率較高，即低溫狀態(tài)下病毒和細菌增殖較慢，對蝦病毒病和細菌病不容易暴發(fā)；（2）華南地區(qū)早、晚造蝦發(fā)病率高，原因主要是因為春夏交替和夏秋交替時，溫度較適宜WSSV等在對蝦體內增殖，造成WSS暴發(fā)流行。（3）隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大和養(yǎng)殖時間推移，引起水體富營養(yǎng)化加重，細菌容易大量繁殖，目前華南地區(qū)中造蝦同樣暴發(fā)病害，成功率較低，原因可能是在高溫條件細菌與WSSV合并或繼發(fā)感染，引起對蝦發(fā)病，這一點也和本文研究結果相吻合，因此在今后的對蝦養(yǎng)殖中，病害防治要同時防控病毒單一引發(fā)、細菌單一引發(fā)及病毒和細菌合并感染或繼發(fā)感染3種情況。

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The Pathogenicity of Micrococcus lysodeikticus and White Spot Syndrome Virus to Litopenaeus vannamei under Different Temperature Conditions

XIANG Yun,WANG Gang,YANG Shao-wen,et al
(Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524025,China)

Explored the pathogenicity of different concentrations of Micrococcus lysodeikticus and White Spot Syndrome Virus to Litopenaeus vannamei under three different temperature conditions(19±1℃,25±1℃, 31±1℃).The paper recorded the mortality and detect viral load in vannamei by singal or combined infection with two pathogens.The results showed that when the temperature was 19±1℃,the cumulative mortality andviral load of each group were respectively lower than 7.7%and 8.6×102copy/g;When the temperature was 25± 1℃,there was a significant difference between the WSSV single-infection group and co-infection group at 48-96 h(P＜0.05),and there was also a remarkable disparity between co-infection group in different concentrations(P＜0.05)with the maximum mortality and viral load of 7.7%and 6.2×105copy/g(under the concentration of 9.5×107cfu/mL).Under the condition of 31±1℃,the cumulative mortality of each group rose rapidly at 48 h. The mortality and virus carrying amount of co-infection group(max:75.6%，2.0×106copy/g)were obviously higher than the single-infection ones(42.2%，2.2×104copy/g).As the time of infection prolonged,the mortality caused by single-infection group grew with the increase of virus concentration(mortality max:71.1%).Therefore,coinfection is more harmful than single ones.What is more,the pathogenicity of M.lysodeikticus and co-infection group on L.vannamei′s breeding increase as the temperature goesd up,from which we learned that temperature could significantly affect the pathogenicity of M.lysodeikticus and WSSV.

temperature;Micrococcus lysodeikticus;White Spot Syndrome Virus;Litopenaeus vannamei

S945.4+9

A

1008－830X(2014)04－0304－07

2014-03-10

科技部星火計劃重點項目(2010GA800008)；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項（A201301D02）；湛江市自主創(chuàng)新企業(yè)科技創(chuàng)新項目（2011[79]）

向赟（1987-），男，湖南懷化人，碩士研究生，研究方向：對蝦養(yǎng)殖和病害防治.E-mail:x418312@126.com

孫成波（1970-），男，江蘇贛榆人，博士，教授，研究方向：對蝦養(yǎng)殖和病害防治.E-mail:suncb@gdou.edu