向 暉 ，袁德義 ，b，賈寶光

（中南林業(yè)科技大學(xué)a. 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

錐栗Castanea henryi（Skan） Rehd. et Wils.為我國(guó)特有種[1]，屬殼斗科栗屬植物，俗稱榛子，主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江以南的福建、浙江、湖南等近14個(gè)省區(qū)內(nèi)。錐栗營(yíng)養(yǎng)豐富，具有健脾胃、補(bǔ)腎強(qiáng)體等功用[2]，其主干通直，材質(zhì)堅(jiān)實(shí)，耐水濕，被廣泛應(yīng)用于建筑、造船、家具制造等行業(yè)[3]，具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和利用前景[4]。目前，關(guān)于錐栗的研究多限于資源調(diào)查、新品種培育、果實(shí)性狀分析等方面，可對(duì)錐栗分子生物學(xué)方面的研究報(bào)道卻較少[3]，而利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)錐栗進(jìn)行的研究還未見(jiàn)諸報(bào)道。

SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）技術(shù)是美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系的 Li 與 Quiros[5]于 2001 年在蕓薹屬植物中開(kāi)發(fā)出來(lái)的，是一種基于PCR 的新型分子標(biāo)記技術(shù)。它主要通過(guò)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)開(kāi)放閱讀框（ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增[6]，通過(guò)上下游引物的結(jié)合，可同時(shí)對(duì)外顯子、內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，且能擴(kuò)增出特異性[7]。因?yàn)椴煌瑐€(gè)體或物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列不同，故其擴(kuò)增的多態(tài)性高[8-9]；同時(shí)，SRAP所需 DNA 的量少而純度低，操作簡(jiǎn)單且重復(fù)性好[10]。因此，本研究采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的研究方法，對(duì)錐栗的SRAP反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，以期為進(jìn)一步研究錐栗種質(zhì)資源的遺傳多樣性及分子輔助育種奠定基礎(chǔ)，也為其他物種的相關(guān)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試樣品采自不同野生錐栗單株剛萌發(fā)的嫩葉，硅膠保存帶回實(shí)驗(yàn)室，再置于－80 ℃的低溫冰箱中保存以備用。樣品信息見(jiàn)表1。

1.2 主要試劑及儀器

PCR擴(kuò)增所需的Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、10XPCR Buffer（含Mg2+15 mmol/L）均購(gòu)自TaKaRa生物工程有限公司；DNA marker（DL5000） 購(gòu)自Solarbio科技有限公司；電泳所用Tris、 瓊脂糖等主要試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。SRAP引物由華大基因公司合成，所用引物序列有Me2、Me3、Me5、Em1、Em2、Em4，引物信息詳見(jiàn)表2。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 錐栗總DNA的提取與檢測(cè)

樣品總DNA的提取采用改良的CTAB法[11-12]，試劑盒由天根生化科技有限公司提供，按盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)步驟提取DNA。產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度，最后將DNA濃度稀釋至10 ng/μL，于－20 ℃的冰箱中保存。

1.3.2 SRAP基礎(chǔ)體系及擴(kuò)增程序

參照Li等人[5]開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的 SRAP 擴(kuò)增體系及程序，隨機(jī)選擇樣品1號(hào)與引物Me2- Em1組合進(jìn)行擴(kuò)增。

基礎(chǔ)體系為：總體系 20 μL，包括 10 ng/μL 模板 DNA 4 μL，5 U/μL Taq 酶 0.2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，10×Taq Buffer 2 μL，10 μmol/L 的上游引物、下游引物各 1 μL， ddH2O 10.2 μL。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃、1 min，35 ℃ 、1 min，72 ℃、1 min，共5個(gè)循環(huán)；94 ℃、1 min，50 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，于4 ℃下保存。

1.3.3 SRAP體系單因素優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照基礎(chǔ)體系，設(shè)8個(gè)試驗(yàn)水平（即8個(gè)濃度梯度），就不同濃度的模板DNA、Taq 酶、Mg2+、引物、dNTP對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響情況進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，以優(yōu)化基礎(chǔ)反應(yīng)體系，從而找出各因素的最佳反應(yīng)參數(shù)。其總體系為20 μL，各影響因子的濃度梯度如表3所示。

表3 SRAP體系優(yōu)化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Design of single factor test for SRAP-PCR system optimization

1.3.4 SRAP體系正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照單因素優(yōu)化試驗(yàn)得到的最優(yōu)反應(yīng)參數(shù)，對(duì)模板DNA濃度、Taq 酶濃度、Mg2+濃度、dNTP 濃度、引物濃度這5 個(gè)因素進(jìn)行了4 個(gè)水平的L16（45）正交優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別見(jiàn)表4與表5。再將正交試驗(yàn)結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，最終選出了適合錐栗的SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系。

表4 SRAP反應(yīng)體系的試驗(yàn)因素與水平Table 4 Factors and levels of SRAP-PCR reaction system

表5 SRAP體系優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(45)Table 5 Orthogonal design L16(45) of SRAP-PCR system optimization

1.3.5 產(chǎn)物檢測(cè)

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓110 V，電泳 30～40 min，Gelstain 核酸凝膠染料染色， 置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。

1.4 錐栗SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系穩(wěn)定性的檢測(cè)

隨機(jī)抽取5個(gè)模板（2～6號(hào)）和2個(gè)引物組合（即Me3-Em2與Me5-Em4），對(duì)最終確定的錐栗SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 模板DNA濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

DNA作為PCR反應(yīng)的模板，是體外擴(kuò)增反應(yīng)的基礎(chǔ)。模板濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響擴(kuò)增試驗(yàn)的結(jié)果：濃度過(guò)低，擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定或無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物；濃度過(guò)高可能增加非特異性產(chǎn)物[13]。模板DNA濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響情況如圖1 所示。由圖1可知，模板濃度的變化對(duì)錐栗SRAP反應(yīng)的影響不大。20 μL體系中，DNA含量在5～100 ng之間，均可擴(kuò)增出條帶，但在10 ng以下和85 ng以上時(shí)，擴(kuò)增出的條帶模糊，條帶數(shù)少； 處于25～70 ng之間的條帶穩(wěn)定，條帶數(shù)多且清晰可辨。結(jié)合穩(wěn)定度與樣品用量等方面考慮，初步選擇模板DNA含量的最適濃度為40 ng。

圖1 模板DNA濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 1 Effect of template DNA concentration on SRAP-PCR

2.1.2 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

Taq DNA聚合酶濃度對(duì)PCR擴(kuò)增有著顯著的影響。濃度過(guò)低影響新鏈合成效率，甚至無(wú)法擴(kuò)增；濃度過(guò)高則易造成浪費(fèi)，產(chǎn)生非特異性條帶。本試驗(yàn)設(shè)置了1.0～4.5 U 8個(gè)梯度以觀測(cè)TaqDNA聚合酶濃度對(duì)錐栗SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響情況，試驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。從圖2中可以看出，Taq酶含量在2.5 U以下時(shí)，擴(kuò)增效果較好；其含量超過(guò)2.5 U時(shí)，擴(kuò)增出的條帶既模糊又不穩(wěn)定。綜合考慮試驗(yàn)結(jié)果和經(jīng)濟(jì)因素，初步選定的20 μL體系中Taq DNA聚合酶的最適濃度為2.0 U。

圖2 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 2 Effect of Taq DNA polymerase concentration on SRAP-PCR

2.1.3 Mg2+濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

作為T(mén)aq酶的輔助因子，Mg2+濃度不僅影響Taq酶活性，還能與反應(yīng)液中的dNTP、模板DNA及引物結(jié)合，影響引物與模板的結(jié)合效率和模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度以及產(chǎn)物的特異性和引物二聚體的形成[14]。Mg2+濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響情況如圖3 所示。圖3顯示，當(dāng)Mg2+濃度為1.4～2.8 mmol/L時(shí)，Mg2+濃度對(duì)錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的影響不明顯；當(dāng)其濃度＞2.4 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的條帶數(shù)減少；當(dāng)其濃度超出2.8 mmol/L時(shí)，幾乎無(wú)法擴(kuò)增出條帶；而當(dāng)其濃度為1.8 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增效果最好。

2.1.4 dNTP濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

圖3 Mg2+濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 3 Effect of Mg2+ concentration on SRAP-PCR

dNTPs與DNA一樣，是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)，作為原料參與新鏈DNA的合成，對(duì)PCR反應(yīng)有著十分顯著的影響。dNTPs濃度過(guò)高會(huì)使堿基錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本增加；而其濃度過(guò)低則影響合成效率，產(chǎn)量下降，甚至導(dǎo)致產(chǎn)物單鏈化。因此，適宜的dNTP濃度對(duì)PCR反應(yīng)至關(guān)重要。dNTP濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響情況如圖4 所示。由圖4可知，當(dāng)dNTP濃度低于0.16 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的條帶亮度明顯下降；當(dāng)其濃度低于0.1 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的條帶數(shù)量減少且模糊不清；而其濃度為0.16～0.28 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增效果區(qū)別不大，條帶明亮清晰。本試驗(yàn)初步選定的最適于錐栗SRAP反應(yīng)的dNTP濃度為0.25 mmol/L。

2.1.5 引物濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

圖4 dNTP濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 4 Effect of dNTP concentration on SRAP-PCR

引物與DNA模板特異性結(jié)合，引導(dǎo)新鏈的合成，在PCR擴(kuò)增中，起著十分重要的作用。引物濃度關(guān)系到擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，增加引物二聚體的形成幾率；濃度太低則無(wú)法進(jìn)行有效擴(kuò)增[15]。試驗(yàn)設(shè)置8個(gè)引物梯度，結(jié)果如圖5所示。在引物濃度為0.3～1.0 μmol/L區(qū)間內(nèi)，均能擴(kuò)增出條帶，且其多態(tài)性好，但濃度低于0.5 μmol/L和大于0.9 μmol/L時(shí)，條帶黯淡不清晰。因此，在保證條帶穩(wěn)定且清晰的前提下，最適于錐栗SRAP反應(yīng)的引物濃度可為0.6 μmol/L。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析

L16（45）正交試驗(yàn)的電泳結(jié)果如圖6所示。按照遺傳多樣性分析要求，參考何正文等人[16]的方法，對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果從高到低依次打分?？偡?6分，條帶數(shù)量豐富、清晰度高，背景低的最佳產(chǎn)物記為16分，與此相反，最差的則記為1分。3次重復(fù)試驗(yàn)獨(dú)立評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表5。根據(jù)得分平均值求出每個(gè)因素同一水平下的試驗(yàn)值之和Ki（即ΣKi，i＝1,2,3,4）以及每一因素水平下的數(shù)據(jù)平均值Ki（即Ki＝Ki/4），并求出同一因素不同水平間平均值的極差R值（即R＝Kmax－Kmin，Kmax為單個(gè)試驗(yàn)因素中Ki的最大值；Kmin為單個(gè)試驗(yàn)因素中Ki的最小值），結(jié)果見(jiàn)表6。

圖5 引物濃度對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 5 Effect of primer concentration on SRAP-PCR

圖6 正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果Fig. 6 Amplification results of orthogonal test

表 6 正交結(jié)果的直觀分析Table 6 Intuitive analysis of orthogonal result

結(jié)合圖6與表5分析，處理組合1、2、7、14的得分很低，條帶效果不理想。其中處理組合1、2的條帶量少且黯淡，擴(kuò)增產(chǎn)物少，其原因是模板、Taq酶濃度、dNTP濃度比較低，新鏈合成效率不高；處理組合7的條帶量較少，其原因是Mg2+濃度過(guò)高，影響了Taq DNA聚合酶的活性，同時(shí)dNTP濃度低，影響了產(chǎn)物的合成；處理組合14條帶少，這可能因?yàn)槟０搴鸵餄舛冗^(guò)高，而Taq酶濃度和dNTP濃度又過(guò)低。參考表5的評(píng)分，綜合3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，考慮穩(wěn)定性、條帶數(shù)、條帶亮度及清晰度，初步選擇處理組合15為最適反應(yīng)體系。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析得出，影響錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的5個(gè)重要因素為模板DNA濃度、Taq 酶濃度、Mg2+濃度、dNTP 濃度、引物濃度，這5個(gè)因素對(duì)PCR反應(yīng)結(jié)果的影響效力存在明顯差異。極差R值反映了每個(gè)因素對(duì)SRAP反應(yīng)的影響程度，R值越大，表示該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越顯著[15]。表6說(shuō)明，RdNTP濃度＞RTaq酶濃度＞R引物濃度＞RMg2+濃度＞R模板濃度，即影響因子dNTP濃度對(duì)錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的影響最大，其次為T(mén)aq酶濃度，對(duì)其影響最小的是模板DNA濃度。Ki值反映了各因素不同水平對(duì)反應(yīng)體系的影響情況，Ki值越大，表示對(duì)應(yīng)的梯度水平越好，對(duì)反應(yīng)體系的影響效果越佳。各試驗(yàn)因素不同試驗(yàn)水平對(duì)錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的影響情況如圖7 所示。由圖7可知，模板DNA濃度的最佳水平為40 ng，Taq酶濃度的最佳水平為2.0 U，Mg2+濃度的最佳水平為1.8 mmol/L，dNTP濃度的最佳水平為0.28 mmol/L，引物濃度的最佳水平為0.8 μmol/L。但由此得出的5因素的最佳水平組合，在正交設(shè)計(jì)表中并沒(méi)有出現(xiàn)。另一方面，正交設(shè)計(jì)中得分最高的處理組合15，與此最佳組合十分接近，兩者只有模板DNA濃度與引物濃度不一致，而極差R值說(shuō)明，這兩個(gè)因素對(duì)錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的影響并不大，因此，綜合比較分析之前的單因素試驗(yàn)結(jié)果，最終確定的錐栗SRAP-PCR反應(yīng)最佳體系為：20 μL體系中，模板DNA濃度40 ng，Taq酶濃度2.0 U，Mg2+濃度1.8 mmol/L，dNTP濃度0.28 mmol/L，引物濃度 0.6 μmol/L。

圖7 各試驗(yàn)因素不同試驗(yàn)水平對(duì)錐栗SRAP反應(yīng)結(jié)果的影響Fig. 7 Effects of different test levels of each test factor on SRAP-PCR in C. henryi

2.3 最優(yōu)體系穩(wěn)定性檢測(cè)

隨機(jī)抽取5個(gè)模板與2個(gè)引物組合對(duì)最終確定的錐栗SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。圖8中，編號(hào)為1～5的試驗(yàn)所用引物組合為Me3- Em2，所用模板依次為模板2、模板3、模板4、模板5、模板6；編號(hào)為6～10的試驗(yàn)所用引物組合為Me5- Em4，所用模板依次為模板2、模板3、模板4、模板5、模板6。擴(kuò)增產(chǎn)物條帶豐富、清晰可辨，穩(wěn)定重復(fù)性好，表明最終優(yōu)化后的該體系適用于錐栗SRAP分子標(biāo)記試驗(yàn)。

3 討 論

圖8 錐栗SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果Fig. 8 Test result of stability of the optimal SRAP-PCR system in C. henryi

SRAP是一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)，由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜系的兩位博士Li和Quiros于2001年在發(fā)表的Springer-Verlag雜志中提出[5]，其操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，具有高頻率的共顯性，且不需要預(yù)知物種的序列信息，擴(kuò)增條帶多態(tài)性和信息量豐富，易于分離測(cè)序[10]。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，RAPD存在重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，SSR檢測(cè)的位點(diǎn)較少、引物開(kāi)發(fā)費(fèi)時(shí)且成本高，AFLP分析程序復(fù)雜、成本昂貴等問(wèn)題。而SRAP彌補(bǔ)了上述各項(xiàng)標(biāo)記的不足，并以其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)已成為一種比較理想的分子標(biāo)記技術(shù)[17]。目前，SRAP技術(shù)已成功運(yùn)用于甜菜[18]、色蕉[19]、牡丹[20-21]、野牛草[22]、甜瓜[10]、水稻、馬鈴薯、萵苣、白菜、大豆、油菜、大蒜、蘋(píng)果、生菜、柑橘、櫻桃、芹菜等植物的研究中[23-24]，但還沒(méi)有人將此標(biāo)記方法應(yīng)用于錐栗研究中。因此，建立一套錐栗SRAP-PCR反應(yīng)最優(yōu)體系，可為錐栗的后續(xù)分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

雖然SRAP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于其他植物的研究中，但同樣的方法在不同植物中的應(yīng)用會(huì)有差異，如鄭婷婷[25]、郭大龍[26]、史紅麗[27]、徐穎[28]等人的研究結(jié)果均不同。由此可見(jiàn)，對(duì)錐栗進(jìn)行SRAP反應(yīng)體系的優(yōu)化試驗(yàn)是十分必要的。

當(dāng)前，常見(jiàn)的分子標(biāo)記體系的優(yōu)化方法主要有兩種：一種是單因素試驗(yàn)法；一種是正交試驗(yàn)法。兩種方法各有利弊。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，操作誤差小[29]，可快速而又直觀地表現(xiàn)出各因子對(duì)反應(yīng)體系的影響情況，但不能體現(xiàn)出各因素之間的互作效應(yīng)[13]。正交試驗(yàn)可以很好地反映出各影響因素之間的互作效應(yīng)，具有布點(diǎn)均衡、試驗(yàn)次數(shù)少、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)[30]，但對(duì)其結(jié)果的評(píng)價(jià)往往帶有主觀性，試驗(yàn)結(jié)果直接受評(píng)分高低的影響，缺乏一定的可靠度。因此，本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行綜合分析，可揚(yáng)長(zhǎng)避短，能更有效、更準(zhǔn)確地得出錐栗SRAP最優(yōu)反應(yīng)體系，保證體系的穩(wěn)定性。

本研究分析得出，PCR的影響因素之間并不是獨(dú)立而是相互起作用的，但各因素的影響力度不一樣。DNA與dNTP一樣，是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)。dNTP濃度過(guò)高會(huì)增加堿基的錯(cuò)配率；其濃度過(guò)低則影響合成效率，甚至導(dǎo)致產(chǎn)物單鏈化。但是，試驗(yàn)結(jié)果表明，錐栗SRAP反應(yīng)對(duì)DNA的要求不高，而對(duì)dNTP濃度的要求嚴(yán)格。另一方面，Mg2+作為T(mén)aq酶活性的影響因子，不僅干擾Taq酶參與反應(yīng)的效率，還能與其他影響因子結(jié)合，從而影響反應(yīng)進(jìn)程。而文中的試驗(yàn)結(jié)果表明，Mg2+濃度在1.4～2.8 mmol/L 的范圍內(nèi)時(shí)，其對(duì)反應(yīng)的影響不大，因此，此濃度范圍是適合錐栗SRAP標(biāo)記的。比較兩種分析方法，單因素試驗(yàn)中，Taq酶濃度和dNTP濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響較大，而模板DNA濃度的影響較?。徽辉囼?yàn)中，根據(jù)極差R值同樣可以得出，影響較大的因素仍是dNTP濃度和Taq酶濃度，其次是引物濃度，模板濃度的影響最小，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果高度一致。相比其他植物而言[31-33]，采用兩種方法研究的結(jié)果高度一致的情況并不多見(jiàn)，這在一定程度上也凸顯了錐栗的特殊性，以及不同物種試驗(yàn)前體系優(yōu)化的必要性。在具體的試驗(yàn)因素與水平上，單因素試驗(yàn)分析所得的模板濃度、引物濃度、dNTP濃度和正交試驗(yàn)分析所得的結(jié)果并不完全一致，這可能與PCR反應(yīng)本身的不穩(wěn)定性和主觀評(píng)分有關(guān)，由于兩種方法的結(jié)果在總體趨勢(shì)上保持高度一致，因而具體試驗(yàn)因素與水平的差異并不影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠度，最終優(yōu)化體系的驗(yàn)證試驗(yàn)也證實(shí)了此結(jié)論。最后，本研究得出的最優(yōu)體系組合，即 20 μL體系中，模板DNA濃度40 ng，Taq酶濃度 2.0 U，Mg2+濃度 1.8 mmol/L，dNTP濃度0.28 mmol/L，引物濃度0.6 μmol/L，可為錐栗進(jìn)一步的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、親緣關(guān)系及種質(zhì)資源的鑒定與研究奠定了基礎(chǔ)，也為其他物種的分子標(biāo)記研究提供了理論參考。

[1] 郎 萍,黃宏文.栗屬中國(guó)特有種居群的遺傳多樣性及地域差異[J].植物學(xué)報(bào),1999,41(6):651－657.

[2] 孔沈魯,陳錦權(quán).錐栗貯藏溫度對(duì)淀粉降解速率的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2004,20(5):222－224.

[3] 劉國(guó)彬,龔榜初,羅正榮.錐栗自然居群 ISSR-PCR 分析技術(shù)的建立[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2009,26(1):103－107.

[4] 潘超然,鮑世利,陳錦權(quán).錐栗貯藏過(guò)程維生素C的降解速率以及保鮮條件研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2003,19(6):234－237.

[5] Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism(SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction:Its application to mapping and gene tagging inBrassica[J].Theoretical and Applied Genetics,2001,103:455－461.

[6] 彭邵峰,張黨權(quán),陳永忠,等.14個(gè)油茶良種遺傳多樣性的SRAP分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(1):80－85.

[7] M A Espo′sito, E A Martin, V P Cravero,et al.Characterization of pea accessions by SRAP’s markers[J].Scientia Horticu Lturae,2007,113:329－333.

[8] 祝全東,張黨權(quán),李曉云,等.油茶SRAP標(biāo)記的PCR體系建立與優(yōu)化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(3):57－62.

[9] 韓 欣,張黨權(quán),王志平,等.基于SRAP的贛南油茶良種分子鑒別研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(3):147－151.

[10] Ferriol M, Pico B, Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection ofCucurbita pepousing SRAP and AFLP markers[J].Theor Appl Genet, 2003,107(2): 271－282.

[11] 黃少勇,張智俊,羅淑萍,等.山核桃EST-SSR引物的篩選及通用性分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2013,31(3):10－15.

[12] 張建英,毛向紅,張瑩瑩.利用RAMP分子標(biāo)記對(duì)酸棗資源的遺傳多樣性分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2014,32(2):14－18.

[13] 郭凌飛,鄒明宏,曾 輝,等.澳洲堅(jiān)果ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].林業(yè)科學(xué),2008,44(5):160－164.

[14] 曾艷玲,謝 鵬,謝耀堅(jiān),等.桉樹(shù)ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(1):44－48.

[15] 穆立薔,劉贏男,馮富娟,等.紫椴ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].林業(yè)科學(xué),2006,42(6):26－31.

[16] 何正文,劉運(yùn)生,陳立華.正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1998,23(4):403－404.

[17] 陳 罡,吳立國(guó).SRAP 標(biāo)記及其在林木遺傳育種研究中的應(yīng)用前景[J].遼寧林業(yè)科技,2009,(6):48－51.

[18] Nevena N L, John W, Robert L. Detection of DNA polymorphism in sugarbeet bulks by SRAP and RAPD markers[J]. Journal of Biotechnology, 2007, (Supplement): 131－132.

[19] Youssef M, James A C, Rivera M R,et al. Musa genetic diversity revealed by SRAP and AFLP[J]. Molecular Biotechnology, 2011,47(3): 189－199.

[20] Han Xiao-yan, Wang Liang-sheng, Liu Zheng-an,et al.Characterization of sequence-related amplified polymorphism markers analysis of tree peony bud sports[J]. Scientia Horticulturae, 2008, 115:261－267.

[21] Han Xiao-yan, Wang Liang-sheng, Shu Qing-yan,et al.Molecular characterization of tree peony germplasm using Sequence-Related Amplified Polymorphism markers[J].Biochemical Genetics, 2008, 46:162－179.

[22] Budak H, Shearman R C, Parmaksiz I,et al. Molecular characterization of buffalo grass germplasm using sequencerelated amplified polymorphism markers[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2004, 108:328－334.

[23] Xiaoming Wu, Xiaohua Qi, Mingfang Zhang,et al. Molecular phylogeny of Chinese vegetable mustard (Brassica juncea) based on the internal transcribed spacers (ITS) of nuclear ribosomal DNA[J]. Genet Resour Crop Evol, 2007, 54: 1709－1716.

[24] 李 嚴(yán), 張春慶. 西瓜雜交種遺傳多態(tài)性的 SRAP 標(biāo)記分析[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2005, 32(4):643－647.

[25] 鄭婷婷,林 萍,王開(kāi)良,等.油茶SRAP-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].林業(yè)科學(xué)研究,2010,23(2):302－307.

[26] 郭大龍,羅正榮.部分柿屬植物 SRAP- PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2006,23(1):138－141.

[27] 史紅麗,韓明玉,趙彩平.桃SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2008,23(增刊):201－204.

[28] 徐 穎,韓 影,趙巍巍,等.山梨 SRAP 反應(yīng)體系的建立[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49(1):24－26.

[29] 邱 帥,丁信譽(yù),席夢(mèng)利,等.東方百合 SRAP 體系優(yōu)化及引物篩選[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,37(3):6－10.

[30] 姜榮波,姜景民,劉 軍,等.紅楠ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化[J].林業(yè)科學(xué)研究,2011,24(2):194－199.

[31] 方 攀,張運(yùn)城,袁虎威,等.樟子松SSR反應(yīng)體系優(yōu)化[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2013,32(3):413－419.

[32] 李 鵬,汪陽(yáng)東,陳益存,等.油桐ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的建立[J].林業(yè)科學(xué)研究,2008,21(2):194－199.

[33] 陳亮明,相 陽(yáng),張冬林,等.兩種方法對(duì)廣玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化比較[J].種子,2008,27(6):10－14.