王 哲 ，譚曉風 ，龍洪旭 ，陳 昊

（中南林業(yè)科技大學a.經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室；b.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙 410004）

油桐Vernicia fordii屬大戟科Euphorbiaceae油桐屬Vernicia，原產(chǎn)于中國，是我國特有的經(jīng)濟林木，與油茶、核桃、烏桕并稱為我國四大木本油料植物[1]。桐油是優(yōu)質干性油，具有干燥快、光澤度高、附著力強、絕緣性能好、耐酸耐堿、防腐防銹等優(yōu)良性能[2]，是制造涂料和油漆的重要生產(chǎn)原料，也是制造生物柴油和改性高分子材料的優(yōu)質原料。

油脂的合成是從乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A開始的[3]，丙二酰輔酶A是脂肪酸合成和脂酰鏈延伸系統(tǒng)等重要代謝的底物[4]，是脂肪酸合成中C2單位的供體，并且在脂肪酸氧化反應中起到調節(jié)線粒體穿梭系統(tǒng)的作用[5]，乙酰輔酶A羧化酶被認定為生物體內的一個基本代謝底物和特定蛋白活性的調控因子[6]。所以，乙酰輔酶A羧化酶催化反應不僅是第一和關鍵的步驟，同時也是限速步驟[7]。

ACCase在結構上有3個功能域，分別是生物素羧化酶(biotin carboxylase，BC)、生物素羧基載體蛋白(biotin carboxyl carrier protein, BCCP)、羧基轉移酶(Carboxyl transferase, CT)。生物素以共價鍵連接在BCCP亞基上，在ACCase羧化乙酰CoA的過程中，其為羧基的中間載體。BC和CT各催化如下2個獨立的半反應，BCCP則作為活化羧基的供體，在BC和CT之間擺動以傳遞羧基。

（1） BCCP＋ HCO3－＋Mg2＋－ATP→BCCP－CO2－＋Mg2＋－ADP＋Pi:Biotin carboxylase；

（2） BCCP－CO2－＋乙酰－CoA→BCCP＋丙二酰－CoA: Carboxyl transferase。

在自然界中，發(fā)現(xiàn)有異質型和同質型兩種在生理上有很大差別的ACCase形式[8]；而在植物體內則有異質型和同質型兩種類型的ACCase，其分別位于質體和胞質溶膠中[9]。

異質型ACCase，也稱為多亞基或原核型ACCase，存在于細菌及雙子葉植物和非禾本科單子葉植物的質體中[10-11]。異質型ACCase包含了4個亞基，即生物素羧化酶（biotin carboxylase，BC）、生物素羧基載體蛋白（biotin carboxyl carrier protein，BCCP）及羧基轉移酶（carboxyl transferase，CT）的 α-CT和 β-CT這2個亞基，其中前2個亞基組成BC和BCCP域，后2個亞基構成CT催化域。在有活性的狀態(tài)下，異質型ACCase的BC和BCCP亞基呈現(xiàn)同型二聚體，而α-CT和β-CT亞基呈現(xiàn)異型二聚體。異質型ACCase不穩(wěn)定，容易解離。

同質型ACCase，亦稱為多功能或真核型ACCase，存在于動物、酵母、藻類及植物的胞質溶膠中，具有一個分子量為220～260 kDa的生物素包含亞基。這類單亞基ACCase含有3個功能域，在序列上對應于異質型ACCase的BC、BCCP、α-CT和β-CT組分，但與異質型ACCase不同，同質型ACCase的3個功能域融合成一條多肽鏈，結構上更為穩(wěn)定而難以解離。不同生物來源的同質型ACCase具有相同的組織結構形式，即NH2-BCBCCP-CT-COOH。

ACCase與植物種子的含油量密切相關。Gengenbach等人[2]在以黃豆為材料的研究中發(fā)現(xiàn)，從發(fā)育早期到中期，高油黃豆ACCase的活性比低油黃豆高2倍。由此推斷，在種子的早期發(fā)育過程中，ACCase基因表達量的增加與種子成熟時含油總量的增加具有相關性。因此，在植物體內過量表達的ACCase有可能導致植株和種子含油量的增加。Ohlrogge等人[12]將油菜種子貯藏蛋白napin特異性表達啟動子連接到擬南芥同質型ACCase基因上，將其轉入油菜中，結果獲得的轉基因植株T1代成熟種子的ACCase活性比對照增加了1.7～1.9倍，脂肪酸含量增加了6%，而T2代的脂肪酸含量則增加了5.0%～6.4%。Sellwood等人[13]利用反義表達技術抑制油菜同質型ACCase的活性，結果獲得的轉基因植株其成熟種子的含油量顯著低于對照。油桐是我國特有的油料植物，開展乙酰輔酶A羧化酶質體工程的研究，具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。因此，克隆與分析羧基轉移酶α亞基的cNDA基因是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采用的油桐近成熟種子來自于湖南省永順縣青坪鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學永順實驗基地——國家油桐種質資源保存庫。2012年8月底采集葡萄桐近成熟種子為實驗材料，保存于－80 ℃的冰箱中以備用。

大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、2×EasyTaq PCR SuperMix 均購自北京全式金生物技術有限公司，PureLinkTM RNA Mini Kit購自英濰捷基（上海）生物技術有限公司，高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase、100 bp 的 Plus DNA Ladder購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。無水乙醇、異丙醇等均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 油桐種子總RNA的提取和cDNA的合成

油桐種子總RNA的提取，參照英濰捷基生物技術有限公司的PureLinkTM RNA Mini Kit試劑盒中說明的方法進行。以瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的提取效果。采用寶生物工程有限公司的cDNA合成試劑盒，參照試劑盒中的說明方法，得到第一鏈cDNA。

1.2.2 油桐ACCase基因α亞基的克隆

從油桐轉錄組測序結果中獲得了α-CT亞基的全長序列，其開放閱讀框長為2313 bp。利用Primer Premier 5軟件設計的上游引物（AF1）5'-ATGGCTTCTGTATCGCATTCTC-3 '和下游引物（AR1）5'-TAAATATCTAAGCAAAGCTGCGGTT-3'，以葡萄桐近成熟種子反轉錄的單鏈cDNA為模板，進行了PCR擴增。PCR反應體系（20 μL）為：5×Preme STAR Buffer（Mg2+）4 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，上游、下游引物（10 μmol）各 0.4 μL，模板 cNDA 0.4 μL，Prime STAR HS 0.2 μL，dH2O 13 μL。擴增條件為：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60.2 ℃、30 s，72 ℃、150 s，30 個循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃Forever。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，再將回收產(chǎn)物與pEASYBlunt Simple載體連接起來，并轉化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞，將其均勻地涂抹在含有氨芐青霉素的LB平板上，于37 ℃下培養(yǎng)8 h，挑取單菌落，37 ℃下?lián)u菌過夜。對菌液作PCR檢測，將陽性結果送至北京六合華大基因公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析

用NCBI的BLAST功能（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索同源的核苷酸序列及氨基酸序列；用DNAman軟件將accA亞基與其它物種的氨基酸進行比對，并用clustalx和MEGA4.0軟件構建accA的系統(tǒng)進化樹；用在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）計算accA的分子量、等電點、分子式、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)；用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）檢測信號肽序列；用在線軟件protscale（http://expasy.org/tools/protscale.html） 分析accA的疏水性；用在線軟件TMpred（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）進行跨膜結構的預測；用在線軟件SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測蛋白質二級結構；用ESyPred3D Web Server 1.0（http://webapps.fundp.ac.be/esypred/）預測蛋白質三級結構。

2 結果與分析

2.1 目的基因全長cDNA的克隆

以葡萄桐近成熟種子反轉錄的單鏈cDNA為模板，用特異性引物（AF1、AR1）進行擴增，將回收的目的片段連接到pEASY-Blunt Simple上，轉化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞，用PCR檢測后獲得了陽性克隆，最后進行測序。最終確認為：accA的cDNA序列全長為2 313 bp，其編碼770個氨基酸，命名為VfCTα，GenBank登錄號為KF964574。總RNA的電泳結果見圖1，PCR擴增結果見圖2。

圖1 總RNA的電泳結果Fig. 1 Electrophoresis result of total RNA

圖2 油桐accA基因的PCR擴增結果Fig. 2 PCR amplification result of accA gene in V. fordii

2.2 accA亞基序列的生物信息學分析

2.2.1 accA核苷酸序列分析結果

對accA的全長cDNA測序結果進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，測序結果與油桐轉錄組ACCase基因的accA亞基完全吻合，CDS長2 313 bp，其編碼770個氨基酸。將accA亞基CDS序列與NCBI中的 Blastn進行比對，結果見表1。由表1可知，accA亞基核苷酸序列與麻瘋樹的相似度最高，達到90%，其與蓖麻、大葉楊、甜橙、葡萄、陸地棉等物種的相似度分別為88%、82%、80%、80%、78%。

表1 油桐accA全長cDNA序列的Blastn結果Table 1 Blast result of full-length cDNA of accA in Vernicia fordii

2.2.2 accA蛋白氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進化分析結果

運用Primer5.0軟件將cDNA序列翻譯成氨基酸序列，結果得到了770個氨基酸。用DNAman軟件將accA蛋白的氨基酸與其它9個物種的氨基酸序列進行多序列比對，結果如圖3所示。圖3表明：它與麻瘋樹的氨基酸同源性最高，可達90%，其次是蓖麻，為87%；它與可可、楊樹、陸地棉、葡萄、甜椒、番茄、黃瓜的同源性分別為76%、76%、72%、73%、69%、69%、68%。由圖3可知，不同物種accA亞基的相似性較高，N端的保守性很強，C端的保守性很弱。

圖3 油桐與其它物種的accA蛋白質序列的比對結果Fig. 3 Alignment of accA protein sequences in V. fordii and other species

對這幾個氨基酸序列進行深入的系統(tǒng)進化分析，用clustalx和MEGA4.0軟件構建accA亞基的進化樹，結果如圖4所示。從圖4中可以看出，油桐與麻瘋樹最先聚合，然后與蓖麻聚合，再與葡萄、番茄甜椒聚合，而與可可、楊樹、陸地棉、黃瓜的進化關系較遠。在進化樹上最先聚合的是親緣關系較近的物種，油桐與麻瘋樹、蓖麻同屬于大戟科，相對而言，其與上述其它物種的遺傳距離應該也是最近的。

圖4 accA蛋白質系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of accA protein

2.2.3 accA蛋白質特性及親水性的預測結果

用在線軟件ProtParam對accA蛋白質的理化性質進行了分析，結果（如圖4）表明：accA蛋白質分子量為85 902.7 Da；其理論等電點為8.48，其中負電荷氨基酸殘基（Asp＋Glu）數(shù)目為113，正電荷氨基酸殘基（Arg＋Lys）數(shù)目為118；其分子式可寫為C3798H6156N1044O1158S29；在280 nm下測定的光吸收值為0.403；該蛋白在大腸桿菌中的半衰期大于10 h；其不穩(wěn)定系數(shù)為37.33，被劃分為不穩(wěn)定蛋白；其脂肪系數(shù)為83.16。對提交于SignalP 4.1 Server網(wǎng)站的accA氨基酸序列進行了信號肽預測，結果表明：accA中不存在信號肽切割位點，是一個非分泌蛋白。

用在線軟件protscale對accA進行了親水性分析，結果如圖5所示。由圖5可知，其親水指數(shù)為－0.510。對親環(huán)素蛋白的疏水性也進行了在線分析，結果如圖5所示。由圖5還可知，該蛋白的疏水指數(shù)從－3.044 至2.589，約在第189、282位表現(xiàn)出較強的疏水性，在第58、208、747、752位表現(xiàn)出較強的親水性。

圖5 油桐accA蛋白質疏水性分析結果Fig. 5 Analysis result of hydrophobicity of accA protein in V. fordii

2.2.4 accA亞基氨基酸跨膜結構預測及功能域確定

將accA的氨基酸序列提交到Tmpred網(wǎng)站，對accA的跨膜結構進行了預測，結果如圖6所示。圖6表明：該蛋白有4個比較明顯的跨膜區(qū)，即第273～299、302～323位氨基酸的跨膜區(qū)，其跨膜方向由內向外，另外兩個由外向內的跨膜區(qū)位于第293～306和302～323位氨基酸。

采用同樣的方法，將accA氨基酸序列與SMART網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫進行了比對，找出了相應的功能結構域。第92～236位氨基酸是ACCA功能域；第160～389位氨基酸為羧基轉移酶域。而第431～442、446～460、715～730、741～757位氨基酸則是復雜性弱的序列。

2.2.5 accA蛋白質二級結構和三級結構的預測結果

圖6 Tmpred對油桐accA跨膜區(qū)的預測結果Fig. 6 Tmpred prediction result of transmembrane domain in accA of V. fordii

在SOPMA網(wǎng)站預測的accA蛋白質中，α螺旋結構（438AA）占56.88%，延伸主鏈（69AA）占8.96%，β折疊（37AA）占4.81%，無規(guī)則卷曲（226）占29.35%。這一結果說明，accA基因編碼的蛋白質主要以α螺旋結構為主，間或為無規(guī)則卷曲和延伸主鏈。

為了預測accA蛋白質的三級結構，必須先找到對應模板。SWISS-Model是一個在已知大分子結構的基礎上的分子模建自動服務系統(tǒng)，用相似性在30%以上且結構已知的蛋白質來建立未知結構的蛋白質分子模型。在SWISS-MODEL中找到了金黃色釀膿葡萄球菌(編號為2f9iA)的accA蛋白，其與油桐accA蛋白的三級結構最為相似，其中第89～406位氨基酸與2f9iA的相似度最高，相似度達到48%，故以此作為預測accA蛋白質三級結構的模板。在ESyPred3D中提交accA氨基酸序列和參考模板（2f9iA），得到油桐accA蛋白質的三級結構（如圖7a）。從圖7a中可以看出，accA中有14個α螺旋。accA蛋白大致可以分為2個部分（如圖7b所示），一個是呈球體的主體，另一個是連接著主體的延伸部分，結合accA蛋白所起到的轉移羧基作用，此延伸部分應該與accD蛋白結合形成CT功能域有關。

圖7 油桐accA蛋白質三維結構模型Fig. 7 Three-dimensional structure of accA protein in V. fordii

3 結論與討論

乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）是催化種子脂肪酸生物合成的第一步，也是最關鍵的限速步驟。有關研究結果表明，ACCase的BC、BCCP、β-CT、α-CT亞基中任何一個亞基的基因超量表達均可提高種子的含油率[8,12,14-15]。植物體內異質型ACCase的BC、BCCP和α-CT三個亞基都是由核基因組編碼的，在N端都具有轉移肽序列，它們表達的前體蛋白被運送到葉綠體中，除去轉移肽后，就組裝成了具有ACCase催化活性的高分子量的復合體[16]。在細胞質中α-CT亞基所表達的前體蛋白被運送到葉綠體中，與β-CT亞基所表達的蛋白結合，形成ACCase三大結構功能域之一的羧基轉移酶（CT）。在不同物種accA蛋白氨基酸的多重比對中發(fā)現(xiàn)，所有accA所編碼的氨基酸都包含了ACCA功能域，該功能域位于accA保守區(qū)域內，可以作為判斷accA亞基的標志。而油桐accA亞基所編碼的氨基酸同樣含有ACCA功能域，位于第92～236位氨基酸。此次克隆的cDNA序列，通過網(wǎng)上比對，可確定為油桐ACCase的accA亞基，將其命名為VfCTα，并將accA亞基的核苷酸序列及其氨基酸序列登陸到GenBank，登錄號為KF964574。accA是組成乙酰輔酶A羧化酶4個亞基中的一個亞基，其本身并沒有活性，而且無法檢測其酶活性，在其體內該酶與羧基轉移酶β亞基（accD）一起形成異源二聚體，即羧基轉移酶（CT），羧基轉移酶與生物素羧化酶（BC）和生物素羧基載體蛋白（BCCP）一起構成乙酰輔酶A羧化酶這個多酶復合體，才能發(fā)揮該酶的作用。VfCTα的全長cDNA的確定，蛋白質的生物信息學分析和理化性質分析及二、三級結構的預測，為以后油桐ACCase基因的研究提供了理論依據(jù)，也為油桐accA亞基的表達及其對ACCase活性的影響提供了物質條件，為油桐的分子育種奠定了基礎。

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