李廣興，杜威威，韓 溪，潘 龍，王 新，白 妍，洪 琴,2，馬 玲，任曉峰，楊貴君

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.上海藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司，上海 200131）

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的急性、高度接觸性呼吸道傳染病，可引起雞呼吸道、輸卵管、腎臟、腸道、肌肉及腺胃等多種組織器官發(fā)生病變[1]。日齡雞均可感染，導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、死亡、增重和飼料報(bào)酬降低等[2]。根據(jù)IBV對(duì)組織的親嗜性、損害的主要器官、引起主要癥狀不同，將IBV分為呼吸型、腎型和腸型等毒株。

雞傳染性支氣管炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬第Ⅲ抗原群成員，為有感染性線狀單股正鏈RNA病毒，大小約27.6 ku[3]。IBV基因組編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、核衣殼蛋白（N）、膜蛋白（M）和小膜蛋白（E）；其中M蛋白位于病毒外表面，是含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，占病毒總量的40%[4]，與S蛋白共同構(gòu)成病毒外膜，M蛋白由224～225個(gè)氨基酸構(gòu)成，橫跨囊膜，大部分在囊膜內(nèi)側(cè)，僅一小端糖基化N端暴露在膜外。據(jù)其糖基化程度的不同分子質(zhì)量為23～34 ku[5]，M蛋白膜外部分親水端含有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，導(dǎo)致M蛋白多態(tài)現(xiàn)象產(chǎn)生，其對(duì)病毒傳染性具有決定性作用[6]。M蛋白與IBV的抗原性及其感染性有關(guān)[7]，抗M蛋白抗體可中和病毒，在補(bǔ)體參與下可殺滅病毒[8-9]。王晶鈺等報(bào)道M蛋白的位置可決定IBV的出芽位置，可能與病毒的復(fù)制有關(guān)[10-12]。IBV M基因相對(duì)保守，其中M蛋白親水區(qū)比疏水區(qū)易發(fā)生變異，主要是由于基因的替代、插入和刪除而導(dǎo)致變異[13]。在研究IBV保守性和重組情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，其M蛋白與其他IBV同源率僅有85.8%～88.8%[14]。本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IBV HH06株M截短蛋白，將純化后的重組蛋白免疫新西蘭白兔制備其多克隆抗體，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，表明其不僅可用于IBV診斷，也為進(jìn)一步研究該蛋白在IBV復(fù)制過(guò)程中的功能等奠定基礎(chǔ)。因此，研究我國(guó)IBV分離株M基因的遺傳變異情況，對(duì)掌握IBV在我國(guó)發(fā)生發(fā)展情況，篩選有效IBV疫苗株以及開(kāi)發(fā)具有較強(qiáng)保護(hù)性的M基因基因工程疫苗或M蛋白ELISA診斷試劑盒具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和菌株、病毒株、質(zhì)粒

IBV HH06株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)病理解剖實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存；克隆宿主菌E.coliJM109和表達(dá)宿主菌E.coliRosetta（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；pET-30a（+）原核表達(dá)載體質(zhì)粒和PVAX1真核表達(dá)載體質(zhì)粒由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)病理解剖實(shí)驗(yàn)室保存；新西蘭雌性白兔購(gòu)自哈爾濱市某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試劑

ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ和XhoⅠ）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和核酸及蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒和DNA膠回收試劑盒為北京索萊寶生物工程公司產(chǎn)品；HRP和FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；OPD鄰苯二胺、四氯萘酚為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank上公布的IBV SC021202株（EU714029.1）核苷酸序列，用Oligo 6.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物（IBV-M-F/R），擴(kuò)增IBV HH06株M基因，預(yù)期擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度約為687 bp。根據(jù)上述引物擴(kuò)增克隆得到的HH06株M基因序列，采用DNAStar軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，選擇表達(dá)蛋白抗原性及親水性較好的序列設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，分別擴(kuò)增原核（M1Y-F/R）和真核表達(dá)蛋白（M1Z-U/L）的目的基因，擴(kuò)增目的片段預(yù)期大小為384 bp。上述引物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1所示。

表1 擴(kuò)增M和M1基因的引物序列Table 1 Primers for amplification of M and M1 gene

1.4 M全基因的PCR擴(kuò)增及蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分析

IBV HH06株雞胚尿囊液RNA的提取按TRIzol Reagent說(shuō)明書進(jìn)行。以O(shè)ligo dT18為反轉(zhuǎn)錄引物，參照MLV反轉(zhuǎn)錄操作說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。然后以合成的cDNA為模板，以IBV-M-F/R為上下游引物PCR擴(kuò)增M全基因。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物，用8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確的PCR產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后進(jìn)行測(cè)序鑒定。利用DNAStar軟件預(yù)測(cè)M基因編碼氨基酸的親水性、表面可及性和抗原性指數(shù)。

1.5 M部分基因的擴(kuò)增及原核重組質(zhì)粒pET30a-M1和真核重組質(zhì)粒PVAX-M1的構(gòu)建

以M全基因?yàn)槟０澹謩e以M1AF/M1AR和M1AU/M1AL為引物PCR擴(kuò)增截短的M1基因，反應(yīng)條件同上。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定正確后用DNA膠回收試劑盒回收、純化目的基因。

PCR回收產(chǎn)物和pET-30a（+）質(zhì)粒、PVAX1質(zhì)粒分別用EcoR I和XhoI雙酶切，膠回收后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)后挑取單菌落置于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12～15 h，提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并將重組質(zhì)粒命名為pET30a-M1或PVAX-M1。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將重組質(zhì)粒pET30a-M1和空載體pET-30a（+）分別轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta（DE3）感受態(tài)中，涂布于含卡那抗性的LB平板上挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。將PCR鑒定正確的重組菌液進(jìn)行活化，37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)。期間每隔1 h取1 mL菌液作為小時(shí)樣品（0～5 h），6 h后收集菌體，離心后PBS懸起超聲波破碎，再離心后分別收集沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE分析重組蛋白。鑒定正確的表達(dá)產(chǎn)物采用切膠純化方法回收重組蛋白，獲得的產(chǎn)物命名為重組M1蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE分析鑒定。重組M1蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以IBV全病毒多可隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體為二抗，四氯萘酚顯色進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 多克隆抗體的制備

選取健康的新西蘭雌性白兔，將純化后的重組M1蛋白（濃度為1800 μg· mL-1）與弗氏完全佐劑等比例混合充分乳化，于背部皮下多點(diǎn)注射，2 mg·只-1。兩周后每隔一周以弗式不完全佐劑與重組M1蛋白等比例混合充分乳化進(jìn)行免疫，1 mg·只-1。四免后將純化蛋白與無(wú)菌PBS的混合溶液經(jīng)耳緣靜脈注射加強(qiáng)免疫，500 μg·只-1。7 d后心臟采血，4℃3000 r·min-1離心20 min收集多抗血清，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 多克隆抗體的鑒定

1.8.1 間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)

純化的重組蛋白用包被液稀釋至10 μg·mL-1，每孔100 μL，包被酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照。以不同稀釋度的多抗血清為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，鄰苯二胺（OPD）為底物避光顯色，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD490nm值。

1.8.2 Western blot檢測(cè)抗體特異性

經(jīng)上樣緩沖液處理后的HH06純化病毒和重組M1蛋白分別進(jìn)行SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用50 g·L-1脫脂乳4℃封閉過(guò)夜后，將膜置于1∶500稀釋的M1多抗血清中37℃溫育1 h，再與1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG反應(yīng)1 h，四氯萘酚顯色。

1.8.3 間接免疫熒光檢測(cè)

待BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右，將重組真核質(zhì)粒PVAX-M1和PVAX1空載體分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。Vero細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后接種B株IBV，同時(shí)設(shè)未接毒細(xì)胞對(duì)照，轉(zhuǎn)染后24 h（接毒后30 h）多聚甲醛室溫固定30 min，以1∶100倍稀釋的M1多抗血清為一抗，1∶1000倍稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。

1.8.4 多抗血清的病毒抑制試驗(yàn)

M1多抗血清56℃滅活后，按1∶4～1∶64進(jìn)行倍比稀釋，然后與等體積100TCID50的IBV混合，37℃作用1 h后，加入96孔板培養(yǎng)的單層Vero細(xì)胞孔內(nèi)，各稀釋度接種3孔。同時(shí)設(shè)病毒、無(wú)關(guān)血清及細(xì)胞空白對(duì)照。接毒后72 h使用MTT法判定多克隆抗血清對(duì)病毒感染細(xì)胞的抑制率，根據(jù)抑制率公式進(jìn)行計(jì)算：病毒抑制率（%）=（細(xì)胞對(duì)照OD490-血清OD490）/（細(xì)胞對(duì)照OD490-病毒OD490）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBV HH06株M基因的擴(kuò)增及蛋白質(zhì)分析

提取IBV HH06株總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)特異性引物RT-PCR擴(kuò)增出M基因，目的基因大小為678 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期大小一致（見(jiàn)圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增M基因Fig.1 PCR product of M gene

利用DNAStar軟件對(duì)M基因編碼氨基酸的親水性、表面可及性和抗原性指數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)M蛋白含有親水區(qū)和三個(gè)跨膜疏水區(qū)。N端前20個(gè)氨基酸為親水區(qū)與第一個(gè)跨膜疏水區(qū)構(gòu)成M蛋白的膜外區(qū)。緊鄰的約80個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成三個(gè)α-螺旋疏水區(qū)，至少跨膜三次。其余的C端區(qū)氨基酸（約占M蛋白的一半）幾乎都位于脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)部，分析顯示其抗原的親水性較強(qiáng)，潛在的抗原決定簇比較集中且較多，說(shuō)明該部分蛋白的抗原指數(shù)較高，抗原表位較多，去除N端的三個(gè)跨膜疏水區(qū)更利于蛋白質(zhì)表達(dá)，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)抗原性指數(shù)和活性的改變較小。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-M1和PVAX-M1的構(gòu)建

將亞克隆的M1基因插入pET-30a（+）原核表達(dá)載體和PVAX1真核表達(dá)載體，經(jīng)PCR和酶切鑒定結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-M1和PVAX-M1均構(gòu)建成功（見(jiàn)圖2），測(cè)序結(jié)果顯示克隆序列正確。

圖2 重組質(zhì)粒PCR及酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid

2.3 PET-M1蛋白的表達(dá)及Western blot分析

SDS-PAGE顯示，重組菌液經(jīng)誘導(dǎo)后在20 ku處出現(xiàn)特異性蛋白條帶，并且主要以包涵體形式表達(dá)，切膠純化效果良好，重組蛋白的分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致（見(jiàn)圖3）。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物（A）和純化蛋白（B）的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed M1 recombinant protein（A）and purified protein(B)in E.coli

以IBV全病毒多克隆抗體為一抗，HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western blot，在20 ku處可見(jiàn)特異性條帶（見(jiàn)圖4）。

圖4 Western blot檢測(cè)M1重組蛋白Fig.4 Detection of the recombinant M1 protein in E.coli by western blot

2.4 多克隆抗體制備及其鑒定

2.4.1 多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)和Western blot分析

將純化后的重組M1蛋白免疫新西蘭雌性白兔，制備M1多克隆抗體。采用間接ELISA方法檢測(cè)該多抗血清的抗體效價(jià)可達(dá)1∶218，同時(shí)與IBV HH06株反應(yīng)效價(jià)可達(dá)1∶214。Western blot結(jié)果表明，該多克隆抗體與未純化的重組M1蛋白和IBV HH06株在20 ku處均出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，表明制備的抗體具有良好的特異性及反應(yīng)性（見(jiàn)圖5）。

圖5 多克隆抗體Western blot鑒定Fig.5 Identification of polyclonal antibody with Western blot

2.4.2 多克隆抗體IFA檢測(cè)

間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)IBV Beaudette感染的Vero細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染真核質(zhì)粒PVAX-M1的BHK-21細(xì)胞可以檢測(cè)到較強(qiáng)的特異性熒光信號(hào)，而非感染細(xì)胞、轉(zhuǎn)染PVAX1空載體細(xì)胞對(duì)照孔未能檢測(cè)到綠色熒光（見(jiàn)圖6）。

圖6 多克隆抗體IFA檢測(cè)Fig.6 Assay of the polyclonal antiserum with indirect fluorescence antibody

2.4.3 病毒感染抑制試驗(yàn)

用DMEM倍比稀釋最大無(wú)毒濃度的多抗血清和對(duì)照血清（2-2～2-6），檢測(cè)不同稀釋度血清對(duì)Beaudette株IBV感染Vero細(xì)胞的抑制效果。結(jié)果顯示，多抗血清的抑制率隨血清稀釋度增加而減弱，當(dāng)多抗血清稀釋度為2-2時(shí)，其對(duì)病毒的抑制率最大，達(dá)25.9%；而對(duì)照血清對(duì)IBV感染Vero細(xì)胞幾乎無(wú)抑制作用（見(jiàn)圖7）。并且細(xì)胞對(duì)照孔的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，病毒感染孔的細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變。這表明，該多抗血清雖然對(duì)IBV感染細(xì)胞的抑制率較低但仍具有抗病毒感染活性。

圖7 多抗血清抗病毒感染作用Fig.7 Inhibition rate of anti-IBV infection by polyclonal antiserum

3 討論與結(jié)論

M蛋白由mRNA4編碼，大部分位于囊膜內(nèi)側(cè)，約10%N端暴露于囊膜外并被糖基化，形成N-連接的寡聚糖，形成抗原決定簇。M蛋白約占病毒蛋白總量40%，由224～225個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為23 ku，因其糖基化程度不同分子質(zhì)量為23～35 ku。

M蛋白是傳染性支氣管炎病毒中次重要糖蛋白，因未知因素，冠狀病毒M蛋白體外表達(dá)困難。分析原因可能與M蛋白在細(xì)胞中表達(dá)并積累到一定量時(shí)破壞細(xì)胞壁有關(guān)，因此會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。M蛋白的N端前20個(gè)氨基酸具有親水性特征，緊鄰的約80個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成3個(gè)α螺旋疏水區(qū)，至少跨膜3次，這種跨膜結(jié)構(gòu)是影響表達(dá)的原因。M基因存在大量大腸桿菌稀有密碼子（約占12.1%），部分以串聯(lián)形式存在，影響M蛋白原核表達(dá)。因此，本研究之初對(duì)全基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，更換幾種表達(dá)載體和誘導(dǎo)條件均未獲得成功，一直不能對(duì)其進(jìn)行全長(zhǎng)表達(dá)。用DNAStar軟件分析，M蛋白的跨膜區(qū)位于N端，其抗原表位主要集中在C端，經(jīng)分析去除三個(gè)跨膜疏水區(qū)，選擇抗原表位集中的C端378 bp（126個(gè)AA）M基因進(jìn)行表達(dá)，最終用pET-30a表達(dá)載體經(jīng)誘導(dǎo)后成功表達(dá)。這可能是由于截短的M1基因不含其疏水區(qū)且稀有密碼子減少，使外源基因獲得高效的表達(dá)。同時(shí)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)表明，該蛋白具有良好免疫原性，可反映天然蛋白生物學(xué)活性。

制備高效價(jià)抗體是示蹤基因表達(dá)和研究基因功能前提。本研究將純化的IBV重組M1蛋白與佐劑乳化后免疫新西蘭白兔，獲得重組M1蛋白多克隆抗體。間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)可達(dá)1∶218，與IBV HH06株反應(yīng)效價(jià)達(dá)1∶214，Western Blot試驗(yàn)表明，制備多抗與重組M1蛋白和IBV HH06株均具有良好的反應(yīng)性和特異性。間接免疫熒光結(jié)果表明，本研究獲得的多克隆抗體可以檢測(cè)到真核表達(dá)的M1蛋白，同時(shí)，本試驗(yàn)還構(gòu)建表達(dá)M蛋白的真核重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后也可被檢測(cè)到，表明表達(dá)截短的膜外區(qū)M1蛋白多克隆抗體可作為一種特異性抗體檢測(cè)M蛋白，同時(shí)該抗體還與IBV B株發(fā)生特異性反應(yīng)。以上結(jié)果表明，本研究制備的多克隆抗體具有良好的生物學(xué)活性，可為后續(xù)IBV研究奠定基礎(chǔ)。

IBV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)，M蛋白C末端在病毒出芽時(shí)與核衣殼蛋白相互作用，M蛋白在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中聚集，形成病毒出芽位點(diǎn)，說(shuō)明M蛋白可能與病毒的復(fù)制有關(guān)[15]。McBride等報(bào)道M蛋白膜外區(qū)部分可與S蛋白協(xié)同在病毒吸附細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將IBV M1蛋白多克隆抗體與IBV病毒粒子作用后，其抑制病毒感染效果較病毒感染對(duì)照處理只達(dá)到25.9%，抑制效率較低?？赡苡捎诮囟痰腗1蛋白缺失膜外區(qū)和跨膜區(qū)存在的關(guān)鍵性表位，與病毒的吸附和復(fù)制過(guò)程有關(guān)，導(dǎo)致多抗血清對(duì)病毒抑制率較低。包含膜外區(qū)的M完整蛋白不易表達(dá)[17]，與本試驗(yàn)結(jié)果相似，相應(yīng)抗體制備在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，M蛋白表達(dá)及其優(yōu)化有待于進(jìn)一步研究。制備M蛋白抗體，可為進(jìn)一步研究該蛋白在IBV復(fù)制過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

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