裘娟萍，楊明欣

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程與環(huán)境學(xué)院，杭州 310014）

生物防治現(xiàn)已成為植物病害防治的主要手段之一，具有環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。耐旱、耐熱、抗逆性強(qiáng)的芽孢桿菌休眠體-芽孢，成為生防菌制劑主要材料[1-3]?？莶菅挎邨U菌為植物根際有益微生物，通過分泌多種抗菌物質(zhì)，在植物病害防治方面具有重要作用[4-7]，成為廣泛應(yīng)用的生物農(nóng)藥，例如用于水稻紋枯病、三七根腐病、煙草黑脛病防治的紋曲寧、根腐消、百抗等。

近年來，Gonz等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌在芽孢形成起始階段，準(zhǔn)備形成芽孢細(xì)胞產(chǎn)生并釋放細(xì)菌毒素，即致死因子（Killing factor），殺死尚未準(zhǔn)備形成芽孢的同類細(xì)胞，釋放致死因子的細(xì)胞對(duì)細(xì)菌毒素具免疫力。尚未形成芽孢的細(xì)胞可利用死亡細(xì)胞釋放的營(yíng)養(yǎng)繼續(xù)生長(zhǎng)，推遲其芽孢形成，該過程稱為“同種相食”（Cannibalism）[8-9]。枯草芽孢桿菌“同種相食”的生物現(xiàn)象及其產(chǎn)生的細(xì)菌毒素-芽孢形成致死因子（Sporulation killing factors，SKF）、芽孢形成延遲蛋白（Sporulation delaying protein，SDP）引起廣泛的研究。Lin等研究發(fā)現(xiàn)“同種相食”產(chǎn)生的細(xì)菌毒素SKF和SDP具有廣譜殺菌性[8,10-12]，作為新型生物農(nóng)藥用于生物防治。

本文綜述枯草芽孢桿菌“同種相食”現(xiàn)象及所產(chǎn)細(xì)菌毒素基因調(diào)控機(jī)制、產(chǎn)毒素細(xì)胞自身免疫機(jī)制及相應(yīng)毒素生防應(yīng)用前景。

1 “同種相食”現(xiàn)象及其分子調(diào)控機(jī)制

在營(yíng)養(yǎng)條件匱乏或其他不利環(huán)境中，枯草芽孢桿菌啟動(dòng)“同種相食”和芽孢形成過程，磷酸化Spo0A（Spo0A～P）是關(guān)鍵調(diào)控因子。

1.1 Spo0A～P的二元調(diào)控機(jī)制

Molle等研究發(fā)現(xiàn)，直接被Spo0A～P調(diào)控的基因達(dá)121個(gè)[13]，其中包括“同種相食”相關(guān)基因skf、sdp和芽孢形成基因spoIIA、spoIIE、spoIIG等，這些基因受高濃度Spo0A～P調(diào)控，或受低濃度Spo0A～P的調(diào)控，形成Spo0A～P二元調(diào)控機(jī)制。

Fujita等研究發(fā)現(xiàn)，參與芽孢形成的相關(guān)基因spoIIA、spoIIE、spoIIG等與Spo0A～P親和力較弱[14]，需高濃度Spo0A～P啟動(dòng)芽孢生成；參與“同種相食”相關(guān)基因skf、sdp與Spo0A～P親和力較強(qiáng)，胞內(nèi)低濃度Spo0A～P可調(diào)控該基因表達(dá)，促使細(xì)胞發(fā)生“同種相食”現(xiàn)象。低濃度Spo0A～P對(duì)abrB基因表達(dá)具抑制作用，其編碼AbrB蛋白是全局調(diào)節(jié)因子，可抑制skf和sdp表達(dá)。因此，低濃度Spo0A～P可解除AbrB對(duì)skf和sdp抑制作用（見圖1）。

圖1 不同濃度的Spo0A～P調(diào)控“同種相食”和芽孢形成Fig.1 Different levels of Spo0A～P control cannibalism and sporulation

1.2 Spo0A～P對(duì)“同種相食”現(xiàn)象的分子調(diào)控機(jī)制

在芽孢形成初期，菌群中少部分細(xì)胞Spo0A因磷酸化而被激活，Spo0A激活細(xì)胞內(nèi)低濃度Spo0A～P啟動(dòng)skf、sdp表達(dá)，產(chǎn)生毒素及免疫因子；Spo0A未激活細(xì)胞中，調(diào)節(jié)蛋白AbrB抑制免疫基因表達(dá)，使其無法合成免疫蛋白而被毒素殺死。死亡細(xì)胞釋放營(yíng)養(yǎng)供Spo0A激活細(xì)胞再次生長(zhǎng)；待到營(yíng)養(yǎng)再次匱乏時(shí)，重復(fù)“同種相食”過程，導(dǎo)致芽孢形成推遲，見圖1。

1.3 skf基因簇及各基因功能

枯草芽孢桿菌skf基因簇包括skfA～H8個(gè)結(jié)構(gòu)基因，各基因的功能見表1?；騭kfA編碼由55個(gè)氨基酸組成的skfA多肽，skfA經(jīng)翻譯后修飾為26個(gè)氨基酸組成的毒性多肽skf。

表1 枯草芽孢桿菌“同種相食”過程中相關(guān)基因的功能Table 1 Functions of related genes in cannibalistic behavior of B.subtilis

Flühe等研究發(fā)現(xiàn)，skfB表達(dá)的skfB蛋白催化skfA4位的半胱氨酸和12位的甲硫氨酸α-C間形成硫脂鍵[15]。skfH編碼的skfH蛋白催化skfA多肽中在1位和16位半胱氨酸間形成二硫鍵[10,16]。Liu和Pei等研究推斷，最后環(huán)化步驟可能是由skfC催化，因?yàn)閟kfC是skf基因簇編碼唯一具蛋白酶功能的蛋白質(zhì)，推測(cè)其降解29個(gè)氨基酸后，將余下26個(gè)氨基酸頭尾相連形成skf[10,17]。skf合成過程及結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 枯草芽孢桿菌中skf結(jié)構(gòu)及其推測(cè)的合成途徑[10]Fig.2 Proposed biosynthetic pathway and structure of skf in B.subtilis

skfD表達(dá)的skfD蛋白具有肽鏈內(nèi)切酶保守區(qū)域，Morales推斷其參與多肽skfA修飾，或具有毒素skf的酶解功能，使細(xì)胞獲得免疫能力[17-18]。skfE和skfF表達(dá)產(chǎn)物SkfEF蛋白作為毒素skf的轉(zhuǎn)運(yùn)體，將細(xì)菌毒素分泌到胞外。

1.4 sdp基因簇及各基因功能

1.4.1 操縱子sdpABC

sdp基因簇含有sdpABC和sdpRI兩個(gè)操縱子5個(gè)結(jié)構(gòu)基因，各基因功能見表1。在sdpABC操縱子中，sdpC表達(dá)由203個(gè)氨基酸組成的多肽prosdpC1-203，pro-sdpC1-203經(jīng)修飾形成含42個(gè)氨基酸的毒性多肽sdp，其結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖3 毒素sdp結(jié)構(gòu)[10]Fig.3 Structure of sdp

pro-sdpC1-203修飾過程分3步[18]：①細(xì)胞將prosdpC1-203分泌至胞外，在信號(hào)肽酶作用下，將N端的信號(hào)肽切除，形成sdpC33-203；②sdpC33-203肽鏈中C141和C147之間二硫鍵由一種巰基二硫鍵氧化還原酶—芽孢桿菌二硫鍵合成酶（Bacillusdisulfide bond，Bdb）BdbB和（或）BdbC催化形成。Perez Morales研究發(fā)現(xiàn)，該二硫鍵存在具增強(qiáng)SDP毒性或信號(hào)活性作用，但活性非必須。③在sdpC33-203的C140-C141和C181-C182處可能由未知蛋白酶剪切，形成含42個(gè)氨基酸、具毒素活性sdp141-181。

sdpA編碼158個(gè)氨基酸組成的胞質(zhì)蛋白sdpA，該蛋白與已知功能蛋白無同源性。sdpB表達(dá)sdpB系以維生素K為輔酶，具羧化酶活性跨膜蛋白，當(dāng)細(xì)胞缺乏sdpAB時(shí)，pro-sdpC轉(zhuǎn)運(yùn)需要伴侶CsaA的參與[23]。當(dāng)細(xì)胞缺少sdpAB中任何蛋白時(shí)，細(xì)胞無法產(chǎn)生毒素。Morales等推測(cè)，sdpA作為分子伴侶，參與pro-SdpC轉(zhuǎn)運(yùn)。sdpA與sdpB形成復(fù)合體，參與sdpC修飾[20]，對(duì)其功能有待進(jìn)一步研究。

1.4.2 操縱子sdpRI

操縱子sdpRI含有sdpR和sdpI兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因。在sdp誘導(dǎo)下sdpRI表達(dá)產(chǎn)生自身調(diào)節(jié)因子sdpR和免疫蛋白sdpI[19]。

sdpR是由90個(gè)氨基酸組成的阻遏蛋白，其N端含有一個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋（Helix-turn-helix，HTH）的DNA結(jié)合區(qū)域和一個(gè)二聚體區(qū)域，能與自身啟動(dòng)子結(jié)合，阻止sdpRI表達(dá)[19,21]。其C端能感應(yīng)并結(jié)合不同種類的金屬離子，當(dāng)sdpR與金屬離子結(jié)合時(shí)，HTH區(qū)域無法與DNA序列結(jié)合，對(duì)sdpRI不能產(chǎn)生阻遏效應(yīng)[24]。

sdpI是一種有六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的免疫蛋白[25]，對(duì)感應(yīng)sdp的存在具有重要意義[18,22]。Ellermeier等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)枯草芽孢桿菌細(xì)胞外無毒素sdp時(shí)，阻遏蛋白sdpR定位于sdpRI操縱子啟動(dòng)子上，抑制sdpRI基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞外存在毒素sdp時(shí)，SdpI受到感應(yīng)，發(fā)生構(gòu)象變化，與sdpR結(jié)合并發(fā)生轉(zhuǎn)移，解除sdpR對(duì)sdpRI阻遏作用，大量合成sdpI[19]（見圖4）。

圖4 sdp誘導(dǎo)sdpRI操縱子表達(dá)模型Fig.4 Model of how sdp induces expression of the sdpRI operon

sdpRI表達(dá)受調(diào)節(jié)蛋白AbrB阻遏作用。在Spo0A激活細(xì)胞中，Spo0A～P抑制AbrB表達(dá)，sdpI大量合成；在Spo0A未激活細(xì)胞中，AbrB不受抑制，大量AbrB抑制sdpRI表達(dá)，雖有胞外sdp誘導(dǎo)，但因AbrB蛋白抑制作用，細(xì)胞不能合成免疫蛋白sdpI，而被毒素殺死（見圖1）。

2 枯草芽孢桿菌產(chǎn)毒素細(xì)胞的自身免疫機(jī)制

枯草芽孢桿菌“同種相食”過程中產(chǎn)毒素細(xì)胞，因存在自身免疫機(jī)制，而不受毒素侵害；而不產(chǎn)毒素細(xì)胞因無相應(yīng)免疫蛋白，而被毒素殺死。

2.1 細(xì)胞對(duì)skf的免疫機(jī)制

2.1.1 skfEF將skf泵出細(xì)胞

Gonz'alez-Pastor等研究發(fā)現(xiàn)，野生型的枯草芽孢桿菌細(xì)胞能夠殺死skf突變株。如果突變株和野生菌株共培養(yǎng)時(shí)，在細(xì)胞生長(zhǎng)初期數(shù)量比維持在一定數(shù)值，但進(jìn)入芽孢形成階段，突變株菌落數(shù)快速減少。當(dāng)skfEF基因在skf突變株中過量表達(dá)時(shí)，這些細(xì)胞又能抵御這些致死因子[8]。Perez Morales推測(cè)其原因是受Spo0A～P調(diào)控，skf基因簇產(chǎn)生skf毒素，同時(shí)產(chǎn)生自身免疫蛋白——skfE和skfF。skfE和skfF類似ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)體，將skf毒素泵出胞外，使產(chǎn)毒素細(xì)胞免受損傷[8,18]。

2.1.2 skfD對(duì)skf的剪切

Claverys和Pei等研究發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)菌毒素免疫蛋白（PlnP、PlnI、PlnT、PlnU和BlpY）均存在肽鏈內(nèi)切酶功能，skfD與其具有同源區(qū)域，推測(cè)skfD具有類似的肽鏈內(nèi)切酶活性，可能通過降解skf，而引起自身免疫作用[9,17]。

2.2 細(xì)胞對(duì)SDP的免疫機(jī)制

由sdpI編碼的跨膜蛋白SdpI對(duì)sdp具有免疫功能，可能與毒素sdp相結(jié)合，但其免疫機(jī)制尚不清楚[18]。

3 枯草芽孢桿菌同種相食現(xiàn)象生物意義

3.1 維持菌群平衡、推遲芽孢形成

枯草芽孢桿菌形成芽孢需消耗一定能量和時(shí)間。如果菌群細(xì)胞同時(shí)形成芽孢，將消耗大量能量，不利于菌群生長(zhǎng)。正在形成或已形成芽孢的細(xì)胞也將難以恢復(fù)或萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。“同種相食”過程中釋放的營(yíng)養(yǎng)和能量有利于維持菌群的平衡與穩(wěn)定。

Nandy等發(fā)現(xiàn)當(dāng)混合枯草芽孢桿菌和大腸桿菌（Escherichia coli）培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌毒素會(huì)先作用大腸桿菌[11]?！巴N相食”或“異種相害”，通過殺死其他細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)，維持多數(shù)細(xì)胞為營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，盡可能地推遲進(jìn)入芽孢形成階段，使菌群可繼續(xù)生長(zhǎng)。若營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)一步匱乏，多數(shù)細(xì)胞再“被迫”形成芽孢。因此，“同種相食”現(xiàn)象推遲芽孢形成，有利于菌群生長(zhǎng)。

3.2 促進(jìn)生物被膜形成

生物被膜是指細(xì)菌通過分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)，將自身包裹其中，形成大量細(xì)菌聚集的膜狀物結(jié)構(gòu)粘附于表面。生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境，有利于自身生存的一種生命現(xiàn)象。López等研究發(fā)現(xiàn)[26]，枯草芽孢桿菌菌群中，殺死同類的細(xì)胞也是產(chǎn)生生物被膜的細(xì)胞。被膜基質(zhì)的形成和“同種相食”均由信號(hào)分子脂肽引發(fā)，死亡細(xì)胞釋放的營(yíng)養(yǎng)首先用于被膜基質(zhì)的形成。因此，“同種相食”過程促進(jìn)生物被膜形成，有利于細(xì)菌的生存。

4 skf和sdp毒素作為新型生物農(nóng)藥應(yīng)用前景

4.1 skf毒素的應(yīng)用前景

Lin等發(fā)現(xiàn)skf多肽能殺死水稻白葉枯病的致病菌-水稻白葉枯黃桿菌（Xanthomonas oryzae）[12]，它是一種G-菌，寄生于水稻葉片內(nèi)部深處葉脈內(nèi)，一般農(nóng)藥不易達(dá)到這個(gè)位置[27]。這是首次發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物能夠抑制水稻白葉枯黃桿菌，自1884年在日本福岡地區(qū)首先發(fā)現(xiàn)以來，該病發(fā)病范圍不斷擴(kuò)大，早已遍及世界各水稻產(chǎn)區(qū)，尤其對(duì)南亞和東南亞稻米生產(chǎn)國(guó)造成嚴(yán)重危害[28]，目前對(duì)該病的防治主要采用噻唑類有機(jī)銅殺菌劑，通過對(duì)skf深入研究今后有望取代化學(xué)農(nóng)藥用于水稻白葉枯病防治。

4.2 sdp毒素的應(yīng)用前景

Liu等研究發(fā)現(xiàn)sdp能夠抑制致病菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的生長(zhǎng)，其抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）能力與萬古霉素相當(dāng)[10]。Lamsa等研究表明，sdp對(duì)多種人體致病菌具有抗菌活性，其抗菌機(jī)制為破壞細(xì)胞膜的質(zhì)子動(dòng)勢(shì)（proton motive force）[29]。

目前，通過破壞細(xì)胞膜質(zhì)子動(dòng)勢(shì)而起到殺菌作用的主要是G+菌細(xì)菌素，如硫醚抗生素、非羊毛硫氨酸細(xì)菌素等，其對(duì)李斯特菌等致病菌有抑制能力[30]。李斯特菌可侵染多數(shù)果蔬使人體致病，因此推測(cè)sdp也可通過破壞致病菌細(xì)胞膜的質(zhì)子動(dòng)勢(shì)抑制此類致病菌。

目前skf、sdp尚未在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用，但由于其具有廣譜殺菌性及良好安全性，未來可開發(fā)生產(chǎn)新型生物農(nóng)藥。

5 展望

枯草芽孢桿菌在芽孢形成的初期階段通過形成不同類型的細(xì)胞而發(fā)生“同種相食”現(xiàn)象，由此產(chǎn)生細(xì)菌毒素skf和sdp。

本文在研究提高枯草芽孢桿菌芽孢形成率過程中發(fā)現(xiàn)，用顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于平板菌落計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，前者芽孢形成率低于后者，除平板計(jì)數(shù)法中菌體沒有充分分散外[31]，“同種相食”現(xiàn)象也是原因之一。“同種相食”現(xiàn)象研究對(duì)認(rèn)識(shí)芽孢形成及生物農(nóng)藥制備有指導(dǎo)作用：若以芽孢為主要生物農(nóng)藥制劑，可阻斷“同種相食”現(xiàn)象發(fā)生，縮短芽孢形成時(shí)間、提高芽孢產(chǎn)量、節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本；通過研究毒素skf和sdp抑菌機(jī)理，擴(kuò)大抗菌譜以及相關(guān)基因?qū)Ξa(chǎn)量影響等，可為枯草芽孢桿菌在植病生物防治等領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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