金永玲，王麗艷

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 161319）

在稻田生態(tài)系統(tǒng)中，捕食性蜘蛛是稻田生態(tài)系統(tǒng)中節(jié)肢動物群落的優(yōu)勢類群，具有適應(yīng)性強、生態(tài)分布廣泛、感覺靈敏、捕食量大、生殖力強、繁殖快、壽命長，田間棲居穩(wěn)定，種群數(shù)量最大等優(yōu)良特性，對農(nóng)作物不同生長時期的多種害蟲具有控制作用，其群落結(jié)構(gòu)與功能特性直接制約稻田害蟲的發(fā)生程度，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1]?；瘜W(xué)農(nóng)藥頻繁使用，不但影響生態(tài)環(huán)境和引起害蟲抗藥性，還會大量殺傷蜘蛛等優(yōu)勢天敵類群，降低天敵對害蟲自然控制能力，使害蟲種群數(shù)量上升，導(dǎo)致害蟲猖獗和次生害蟲上升[2-3]。殺蟲劑大量施用對稻田優(yōu)勢種蜘蛛酶活性有顯著抑制作用，影響田間蜘蛛功能特性及農(nóng)藥抵抗力[4-5]。所以，了解殺蟲劑脅迫對蜘蛛生理生化方面影響尤為必要。

多年對寒地稻田節(jié)肢動物群落多樣性調(diào)查研究結(jié)果表明，寒地稻田捕食性天敵以擬水狼蛛為主要優(yōu)勢種[6]。本試驗在對稻田節(jié)肢動物群落多樣性調(diào)查基礎(chǔ)上研究殺蟲劑脅迫下稻田優(yōu)勢種蜘蛛擬水狼蛛體內(nèi)重要的保護(hù)酶系、解毒酶系含量變化及殺蟲劑對稻田優(yōu)勢種蜘蛛的殺傷力，為科學(xué)合理使用化學(xué)殺蟲劑、保護(hù)害蟲天敵、保持稻田生態(tài)系統(tǒng)平衡提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源

寒地稻田優(yōu)勢種蜘蛛：擬水狼蛛（Pirata subpi?raticus）。采自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)水稻試驗田（王家圍子等地）。

1.1.2 供試水稻品種

墾建稻5號。

1.1.3 供試藥劑

4.5%高效氯氰菊酯乳油（安徽豐樂農(nóng)化有限責(zé)任公司，300～600mL·hm-2）；10%吡蟲啉可濕性粉劑（蘇州華源農(nóng)用生物化學(xué)品有限公司，150～300 g·hm-2）；1.5%阿維菌素乳油（黑龍江綏化農(nóng)墾晨環(huán)生物制劑有限責(zé)任公司，150～300 mL · hm-2）。

1.2 方法

1.2.1 室內(nèi)試驗

室內(nèi)網(wǎng)罩試驗采用直徑為40 cm的塑料盆，盛以稻田土壤，灌水，每盆栽種水稻植株3株。試驗在水稻分蘗期進(jìn)行，以直徑為100 cm的尼籠紗網(wǎng)養(yǎng)蛛籠罩住，周圍用泥土封閉嚴(yán)實以免蜘蛛流失，每個網(wǎng)罩內(nèi)投放蜘蛛50頭。試驗設(shè)三種殺蟲劑及清水對照4個處理，每個處理重復(fù)3次。把事先配制好的殺蟲劑用小噴壺均勻噴施，分別于施藥后1、4、9、15 d進(jìn)行調(diào)查，統(tǒng)計蜘蛛死亡率。

1.2.2 田間試驗

試驗采用隨機區(qū)組，三種殺蟲劑及清水對照，3次重復(fù)，共設(shè)12個小區(qū)。每個小區(qū)面積為20 m2，區(qū)間設(shè)有塑料布隔離保護(hù)行，防止蜘蛛逃逸。用工農(nóng)16型背負(fù)式噴霧器常規(guī)噴霧。施藥前調(diào)查蜘蛛基數(shù)。施藥后分別于1、4、9、15 d調(diào)查蜘蛛存活數(shù)量。調(diào)查時采用平行跳躍法取樣，每小區(qū)5點，每點查20穴，統(tǒng)計每百穴蜘蛛減退數(shù)[5]。

室內(nèi)網(wǎng)罩試驗與大田試驗采用殺蟲劑相同，各種處理比例相同（各農(nóng)藥施用劑量見1.1.3）。

1.3 生理指標(biāo)測定方法

1.3.1 蟲源處理

清水喂養(yǎng)：田間采回成年蜘蛛后，用清水喂養(yǎng)10～25 d，排除其消化道內(nèi)尚未消化的異體酶類后，放入-70℃超低溫冰箱中備用。

農(nóng)藥喂養(yǎng)（吡蟲啉、阿維菌素）：試驗蜘蛛為成年蜘蛛，樣本采回后，用清水喂養(yǎng)2周，再用農(nóng)藥亞致死中濃度喂養(yǎng)，分別在喂養(yǎng)后第1、4、9、15天選取存活蜘蛛各5只，放入-70℃超低溫冰箱中備用。

高效氯氰菊酯處理方法：用濾紙在配好的農(nóng)藥中浸泡1 min，拿出放入裝有蜘蛛的生測瓶中，待其爬行，分別在第1、4、9、15天選取存活蜘蛛各5只，放入-70℃超低溫冰箱中備用。

試驗選高效氯氰菊酯、吡蟲啉、阿維菌素三種殺蟲劑的亞致死中濃度，分別為3.9253、41.0037、6.9166 mg·L-1。

1.3.2 保護(hù)酶測定[7]

1.3.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

將經(jīng)過1.3.1處理的蜘蛛用預(yù)冷的磷酸緩沖液充分勻漿，于4℃，4000 g離心15 min，取上清液做酶原。取一試管加入2.8 mL SOD反應(yīng)液（50 mmol·L-1pH 7.0磷酸緩沖液、13 mmol·L-1蛋氨酸、75 μmol· L-1NBT，0.1 mmol·L-1EDTA），再加入酶原0.1 mL，200 mmol·L-1VB2溶液0.1 mL。在25℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)2支40 W日光燈下光照反應(yīng)15 min后，然后用黑暗終止反應(yīng)，立即在分光光度計560 nm處比色，并測定酶液蛋白質(zhì)含量（參照Bradford考馬斯亮藍(lán)G-250法），3次重復(fù)。酶活性以U·mg-1表示。

1.3.2.2 過氧化物酶(POD)活性測定

將經(jīng)1.3.1處理的蜘蛛分別放入研缽中，加入少量石英砂，按每1g幼蟲加入10mL緩沖液的劑量加入預(yù)冷pH7.0、濃度為0.1mol·L-1PBS液，在冰浴條件下研磨，所得勻漿于12000g離心15min，其上清液為待測的酶液。取一試管加入2.9mLPOD反應(yīng)液（其中有pH 6.0100 mmol·L-1磷酸緩沖液1 mL，30 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚0.95mL和26mmol·L-1H2O22mL），再加入酶液0.l mL，30℃水浴反應(yīng)15 min后，立即在470 nm處比色，并測定酶液蛋白質(zhì)含量。以不加酶液為對照，3次重復(fù)。

1.3.3 解毒酶測定

1.3.3.1 羧酸酯酶(CarE)活性測定

參照Byme等方法[8]、高希武方法略作修改[9]。在96孔酶標(biāo)板上設(shè)置好參比和樣品區(qū)域，先向參比孔穴內(nèi)加入25 μL 0.02 mol·L-1pH 7.0 PBS緩沖液，再同時向參比和樣品孔穴內(nèi)各加入25 μL 1×10-4mol·L-1毒扁豆堿溶液，然后向樣品孔穴內(nèi)加入25 μL酶液，最后同時向參比和樣品孔穴內(nèi)各加入200 μL[a-NA+固藍(lán)RR]混合液。用Synergy HT多功能酶標(biāo)儀在450 nm下每隔50 s讀一次光密度值，讀11次，然后將時間與光密度值作圖，求出線性部分的斜率，即以反應(yīng)的初速度值做為酶的活性。每處理各3次重復(fù)。

1.3.3.2 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性測定

參照Habig等方法略作修改[10]。在96孔酶標(biāo)板上設(shè)置好參比和樣品區(qū)域，先同時向樣品和參比孔穴內(nèi)加入3 μL GSH溶液，再向參比和樣品孔穴內(nèi)分別加入 250 μL 和 230 μL 0.1 mol· L-1pH 7.5 PBS緩沖液，然后同時向參比和樣品孔穴內(nèi)加入10 μL CDNB溶液，最后向向樣品孔穴內(nèi)加入25 μL酶液。用Synergy HT多功能酶標(biāo)儀在340 nm下每隔50 s讀一次光密度值，讀11次，然后將時間與光密度值作圖，求出線性部分的斜率，即以反應(yīng)的初速度值做為酶的活性。每處理各3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗測得數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5進(jìn)行方差分析。計算見公式1～3。

2 結(jié)果與分析

2.1 施藥處理后室內(nèi)網(wǎng)罩蜘蛛的死亡率

由表1可知，三種殺蟲劑的施用對稻田優(yōu)勢種蜘蛛均有較大影響。在施藥后1～15 d蜘蛛死亡率均顯著高于對照處理。在施藥后第1天，三種殺蟲劑處理后蜘蛛的校正死亡率分別為30.56%、41.67%和64.44%，經(jīng)高效氯氰菊酯處理的蜘蛛校正死亡率最高為64.44%。三種處理間，吡蟲啉和阿維菌素處理的蜘蛛死亡率間差異不顯著，但兩者與高效氯氰菊酯處理的蜘蛛死亡率相比差異顯著；施藥后第4天，蜘蛛校正死亡率分別為39.05%、43.49%和50.92%，經(jīng)高效氯氰菊酯處理的蜘蛛校正死亡率最高為50.92%；施藥后第9天，蜘蛛校正死亡率分別為49.40%、41.90%和50.0%；施藥后第15天，蜘蛛校正死亡率分別為50.67%、45.24%和54.17%，可以看出施藥第4～15天，三種藥劑處理間死亡率差異不顯著。同時，隨著施藥時間延長，經(jīng)高效氯氰菊酯處理的蜘蛛校正死亡率在第4、9、15天均比第1天低，經(jīng)吡蟲啉和阿維菌素處理的蜘蛛校正死亡率在第4、9、15天均比第1天高。

表1 施藥后室內(nèi)網(wǎng)罩蜘蛛的死亡率Table 1 ndoor net cover spiders mortality after pesticide treatment

2.2 施藥處理后大田蜘蛛的退減率

表2結(jié)果表明，三種殺蟲劑處理蜘蛛退減率在施藥后第1～15天均高于對照處理，差異顯著。隨著施藥時間延長，三種殺蟲劑處理稻田優(yōu)勢種蜘蛛數(shù)量均比施藥前大量減少，三種處理蜘蛛校正死亡率在施藥后第4～15天均比第1天低。在施藥后1～15 d呈現(xiàn)出下降-升高-下降趨勢，并且第15天下降顯著。

表2 施藥后大田蜘蛛的退減率Table 2 Field spiders reduced rate after pesticide treatment

2.3 三種殺蟲劑脅迫下寒地稻田優(yōu)勢種蜘蛛體內(nèi)保護(hù)酶的含量

表3結(jié)果表明，三種殺蟲劑處理后，在施藥后1～15 d內(nèi)，蜘蛛體內(nèi)SOD酶含量均低于對照處理，且差異顯著。施藥后第1天，阿維菌素處理酶含量最低，三種處理間差異顯著；第4、9天，經(jīng)吡蟲啉和阿維菌素處理的蜘蛛體內(nèi)SOD酶含量顯著低于高效氯氰菊酯處理SOD酶含量；施藥后第15天，經(jīng)阿維菌素處理的蜘蛛體內(nèi)SOD酶含量顯著低于高效氯氰菊酯和吡蟲啉處理。

表3 殺蟲劑脅迫下蜘蛛體內(nèi)保護(hù)酶的變化Table 3 Changes of protective enzymes in spider under insecticide stress

隨著施藥天數(shù)的不斷增加，三種處理的蜘蛛體內(nèi)SOD酶含量在施藥后第1～15天均呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢；三種處理在第4天蜘蛛體內(nèi)SOD酶含量均顯著低于第1天；第9天經(jīng)高效氯氰菊酯和吡蟲啉處理的蜘蛛體內(nèi)SOD酶含量在第9天均顯著低于第1天，經(jīng)阿維菌素處理的蜘蛛體內(nèi)SOD酶含量明顯高于第1天；第15天，三種處理蜘蛛體內(nèi)SOD酶含量均顯著高于第1天。

三種殺蟲劑處理后，第1、4、9天蜘蛛體內(nèi)POD酶含量均低于對照處理。施藥后第1天經(jīng)阿維菌素處理的蜘蛛體內(nèi)POD酶含量與對照相比差異顯著，三種處理間差異顯著；施藥后第4天經(jīng)吡蟲啉、阿維菌素處理的蜘蛛體內(nèi)POD酶含量顯著低于對照；第9天經(jīng)三種藥劑處理的蜘蛛體內(nèi)POD酶含量顯著低于對照，三種處理間差異顯著；施藥后第15天經(jīng)高效氯氰菊酯和阿維菌素處理的蜘蛛體內(nèi)POD酶含量均低于對照處理，差異顯著，經(jīng)吡蟲啉處理的蜘蛛體內(nèi)POD酶含量顯著高于對照處理，三種處理間差異顯著。

隨著施藥天數(shù)的不斷增加，三種殺蟲劑處理的蜘蛛體內(nèi)POD酶含量在施藥后第1～15天內(nèi)呈現(xiàn)較大波動。經(jīng)高效氯氰菊酯處理的蜘蛛體內(nèi)POD酶含量在施藥后第1～15天呈現(xiàn)先升高再降低趨勢，第4、9、15天均高于第1天，差異顯著；經(jīng)吡蟲啉處理的蜘蛛體內(nèi)POD酶含量第9、15天均高于第1天，差異顯著，第4天低于第1天，差異顯著；經(jīng)阿維菌素處理的蜘蛛體內(nèi)POD酶含量在施藥后第1～15天呈現(xiàn)先升高再降低然后再復(fù)升高趨勢，第4、15天高于第1天，差異顯著，第9天低于第1天，差異顯著。

2.4 三種殺蟲劑脅迫下寒地稻田優(yōu)勢種蜘蛛體內(nèi)解毒酶的變化

表4結(jié)果表明，三種殺蟲劑處理后，在第1～15天，蜘蛛體內(nèi)羧酸酯酶CarE含量均低于對照處理。施藥后第1天，三種處理的蜘蛛體內(nèi)CarE酶含量均顯著低于對照，三種處理間差異不顯著；施藥后第4天，經(jīng)阿維菌素和吡蟲啉處理的蜘蛛體內(nèi)CarE酶含量與對照相比差異均極顯著，且顯著低于高效氯氰菊酯處理的蜘蛛體內(nèi)CarE酶含量；第9天，三種處理的蜘蛛體內(nèi)CarE酶含量顯著低于對照，三種處理間差異不顯著；施藥后第15天，經(jīng)吡蟲啉處理的蜘蛛體內(nèi)CarE酶含量與對照相比，降低最多，但差異不顯著。

表4 殺蟲劑脅迫下蜘蛛體內(nèi)解毒酶的變化Table 4 Changes of detoxifying enzymes in spider under insecticide stress

三種殺蟲劑處理后，隨施藥時間延長，第1～5天內(nèi)，蜘蛛體內(nèi)CarE酶含量整體上均呈現(xiàn)先下降再升高然后再復(fù)下降的過程。在第4、9、15天蜘蛛體內(nèi)CarE酶含量均低于第1天，差異顯著。

三種殺蟲劑處理后，在施藥后第1～15天，蜘蛛體內(nèi)GST酶含量均低于對照處理。第1天，三種處理與對照GST酶含量降低，差異不顯著；施藥后第4天，三種處理蜘蛛GST酶含量與對照相比顯著升高；第9、15天三種處理與對照相比酶含量降低，但差異均不顯著。隨著施藥時間延長，三種殺蟲劑處理的蜘蛛體內(nèi)GST酶含量在第1～15天呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，第4、9、15天均高于第1天，但差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

化學(xué)農(nóng)藥長期使用，在殺死害蟲同時也殺傷其天敵，使田間天敵數(shù)量大量減少，破壞作物田生態(tài)環(huán)境平衡穩(wěn)定，降低天敵對害蟲控制作用。本研究結(jié)果表明，三種殺蟲劑對稻田優(yōu)勢種蜘蛛擬水狼蛛的殺傷力均較高，大田試驗結(jié)果與胡子強等研究結(jié)果一致[11]。王智等研究表明殺蟲劑在較低劑量條件下，促進(jìn)蜘蛛對害蟲控制能力[12]。

昆蟲體內(nèi)含有的活性氧在受到逆境脅迫后含量增加，對許多生物功能分子有很強破壞作用。但是生物體內(nèi)存在的保護(hù)酶系能抑制活性氧形成，其中SOD和POD是生物體內(nèi)重要保護(hù)酶，這兩種酶共同協(xié)調(diào)作用以免受外界環(huán)境的刺激并維持動態(tài)平衡，防止自由基的毒害[13-15]。本試驗結(jié)果表明，三種殺蟲劑處理后稻田擬水狼蛛SOD、POD酶活性均比對照低，差異顯著，其中阿維菌素對蜘蛛作用最強。說明三種殺蟲劑脅迫使稻田蜘蛛體內(nèi)的活性氧含量增加，抑制蜘蛛SOD、POD酶活性，這兩種酶活性含量大小直接影響蜘蛛對殺蟲劑脅迫抵抗能力。本研究結(jié)果與徐海偉研究結(jié)果[13]一致。

羧酸酯酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是昆蟲體內(nèi)重要兩種解毒酶系，兩種酶的活性直接決定對殺蟲劑的解毒能力。本研究結(jié)果表明，各處理稻田擬水狼蛛解毒酶的含量均相比對照處理低，經(jīng)阿維菌素處理擬水狼蛛解毒酶活性與對照相比降低最多，其次是吡蟲啉，最后是高效氯氰菊酯。綜上所述，蜘蛛對殺蟲劑的解毒能力較低，恢復(fù)能力較慢。這與徐海偉研究結(jié)果[13]一致。本試驗只對三種殺蟲劑進(jìn)行研究，稻田其他常用殺蟲劑對蜘蛛影響還有待進(jìn)一步研究。

本試驗研究不同殺蟲劑對不同蜘蛛及其體內(nèi)酶活性的影響，了解蜘蛛對殺蟲劑脅迫抵抗能力及解毒能力高低，增強蜘蛛對藥劑抵抗能力，持續(xù)發(fā)揮天敵自然控制作用。為化學(xué)殺蟲劑合理使用提供新依據(jù)，為稻田害蟲可持續(xù)控制提供理論依據(jù)。

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