李超 錢新華 千新來 李航 馮思佳

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是嬰幼兒眼內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅患兒的生命，其發(fā)病率約為1/20 000，且呈逐年上升趨勢(shì)［1-2］。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療以手術(shù)為主，但其嚴(yán)重影響患兒的生存質(zhì)量。因此，以保存患兒眼球并盡可能保存一定程度視力的包括中藥治療在內(nèi)的綜合治療手段正日益受到重視［3-6］。侵襲、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤顯著的生物學(xué)特性，是惡性腫瘤頑固性、難治性和患者死亡的根本原因。因此，防治腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移對(duì)于控制腫瘤、提高治愈率及延長(zhǎng)患者生存具有重要意義。黃芪多糖(astragalus polydsaccharide，APS)是黃芪的主要活性成分之一，其抗腫瘤作用已經(jīng)被越來越多的研究證實(shí)［7-9］。但APS對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲能力是否具有抑制作用及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。本研究擬以200 mg· L－1APS誘導(dǎo)48 h的RB44細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組(預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)，以不加藥的RB44細(xì)胞為對(duì)照組，探討APS對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB44細(xì)胞侵襲能力的影響及其機(jī)制，以期為APS用于治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的可行性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB44細(xì)胞購(gòu)于中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞中心。培養(yǎng)條件:含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100×103U· L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和材料 β-actin鼠抗人單克隆抗體(IgG)、羊抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)多克隆抗體(IgG)、羊抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metallo-proteinase 2，MMP-2)多克隆抗體(IgG)、兔抗人鈣黏附蛋白E(E-cadherin)多克隆抗體(IgG)和辣根酶標(biāo)記的抗鼠、抗羊、抗兔(IgG)二抗及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒均為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品;APS為本實(shí)驗(yàn)室提取并定量(提取的APS濃度為51.514 g·L－1，稀釋至10 g·L－1，過濾除菌并分裝后－80℃凍存)，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) APS組RB44細(xì)胞用含200 mg·L－1APS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)照組RB44細(xì)胞用正常RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后消化并計(jì)數(shù)，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為105mL－1。加含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基于24孔板(每孔600 μL)，將Transwell小室放入24孔板中，靜置5 min。各小室接種細(xì)胞數(shù)量為40×103mL－1，補(bǔ)無血清培養(yǎng)基至200 μL。常規(guī)培養(yǎng)16 h，取出小室，用棉簽完全擦去小室基膜上面的細(xì)胞。體積分?jǐn)?shù)95%酒精室溫固定15 min，2 g·L－1結(jié)晶紫染色10 min。倒置顯微鏡下觀察小室基膜下面細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 在小室基膜上面預(yù)鋪設(shè)基質(zhì)膠。接種細(xì)胞后培養(yǎng)時(shí)間為24 h，余同1.2.1方法。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)APS對(duì)RB44細(xì)胞中侵襲相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響 提取對(duì)照組和APS組RB44細(xì)胞總蛋白并定量。通過 Western blotting檢測(cè)侵襲相關(guān)基因蛋白表達(dá)的變化。以βactin為內(nèi)參照，蛋白上樣量為75 μg。β-actin鼠抗人單克隆抗體(IgG)、羊抗人MMP-9多克隆抗體(IgG)、羊抗人MMP-2多克隆抗體(IgG)、兔抗人E-cadherin多克隆抗體(IgG)和辣根酶標(biāo)記的抗鼠、抗羊、抗兔(IgG)二抗稀釋倍數(shù)分別為:1∶2500、1∶150、1∶300、1∶150、1∶7500、1∶5000和1∶5000。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，通過Bandscan 5.0軟件分析Western blotting條帶灰度與內(nèi)參照條帶灰度比值，數(shù)據(jù)以s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 APS對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB44細(xì)胞侵襲能力的影響

2.1.1 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，由表1可見:APS組RB44細(xì)胞遷移穿過基膜的數(shù)顯著少于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.1.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，由表1可見看出:與對(duì)照組相比，APS組RB44細(xì)胞侵襲并穿過基膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of transwell migration and invasion test (s，cell/HPF)

表1 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of transwell migration and invasion test (s，cell/HPF)

Group Transwell migration test Transwell inv asion test Control 54.667±4.041 26.000±2.646 APS 26.667±4.041 8.667±2.082 t 0.001 0.001 8.485 8.918 P

2.2 APS對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB44細(xì)胞中侵襲相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)APS對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB44細(xì)胞中侵襲相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果見圖1、表2:與對(duì)照組相比，APS組RB44細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而MMP-9和MMP-2的表達(dá)顯著降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01)。

Figure 1 Effects of APS on the expression of invasion related genes in RB44 cells.A:Control group;B:APS group APS對(duì)RB44細(xì)胞中侵襲相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響。A:對(duì)照組;B:APS組

表2 APS對(duì)RB44細(xì)胞中侵襲相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響Table 2 Effects of APS on the expression of invasion related genes in RB44 cells (s)

表2 APS對(duì)RB44細(xì)胞中侵襲相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響Table 2 Effects of APS on the expression of invasion related genes in RB44 cells (s)

Group E-cadherin/β-actin MMP-9/β-actin MMP-2/β-actin Control 0.128±0.019 0.269±0.187 0.223±0.013 APS 0.117±0.019 0.134±0.008 0.085±0.006 t 0.766 11.530 17.149 P 0.486 0.000 0.000

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展和醫(yī)療水平的提高，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療目標(biāo)正由保存患兒的生命向提高患兒生存質(zhì)量轉(zhuǎn)變，即以保存患兒眼球并盡可能保存一定程度視力的包括中藥治療在內(nèi)的綜合治療手段正日益受到重視［3-6］。APS具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗應(yīng)激、抗氧化等多種藥理功效［10-12］。

腫瘤的遷移和侵襲是一個(gè)由瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、細(xì)胞相互作用的過程［13-14］，包括腫瘤細(xì)胞去黏附從瘤體脫落、瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力、瘤細(xì)胞與基底膜的黏附、瘤細(xì)胞產(chǎn)生分泌蛋白水解酶、蛋白水解酶降解ECM等，是惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ)［13-14］。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)是體外檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的良好指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，APS組RB44細(xì)胞穿過transwell小室基膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.01)。提示APS能顯著抑制RB44細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

MMP-2是一種相對(duì)分子質(zhì)量為72 000的Ⅳ型膠原酶，MMP-9是MMPs家族中分子量最大的膠原酶，能夠降解明膠、膠原等多種ECM成分，有利于腫瘤的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移［15-16］。研究顯示，當(dāng)MMP-9和MMP-2表達(dá)或活性降低時(shí)，高轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞的侵襲性會(huì)明顯減弱［17-18］;MMP-9和MMP-2與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的惡性表型和預(yù)后有關(guān)［19］。本研究通過Western blotting檢測(cè)了APS處理前后RB44細(xì)胞中MMP-9和MMP-2表達(dá)的變化，結(jié)果表明，APS組RB44細(xì)胞中MMP-9和MMP-2的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(均為P＜0.01)。提示APS對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB44細(xì)胞遷移侵襲能力的抑制作用可能與其抑制MMP-9和MMP-2的表達(dá)有關(guān)。

瘤細(xì)胞之間的黏附主要由上皮鈣黏連素介導(dǎo)，當(dāng)E-cadherin表達(dá)降低時(shí)可導(dǎo)致瘤細(xì)胞間黏附力下降，有利于瘤細(xì)胞脫落，進(jìn)而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，E-cadherin是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的一種重要抑制因子［20］。本研究通過Western blotting檢測(cè)了APS處理前后RB44細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)的變化，結(jié)果表明，APS組和對(duì)照組RB44細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示在APS抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB44細(xì)胞遷移侵襲能力中E-cadherin可能不起重要作用。

綜上所述，本研究證明了APS可顯著抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB44細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其該作用可能與其抑制MMP-9和MMP-2的表達(dá)有關(guān)。本研究為APS治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤可行性提供了一定的理論依據(jù)。

1 Broaddus E，Topham A，Singh AD.Incidence of retinoblastoma in the USA:1975-2004［J］.Br J Ophthalmol，2009，93(1):21-23.

2 Yun J，Li Y，Xu CT，Pan BR.Epidemiology and Rb1 gene of retinoblastoma［J］.Int J Ophthalmol，2011，4(1):103-109.

3 郁想想，陳長(zhǎng)征，趙軍陽(yáng)，鄭紅梅，葉美紅，李璐，等.視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤綜合治療療效分析［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，33(2): 247-250.

4 劉瑾，朱豫.視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療進(jìn)展［J］.眼科新進(jìn)展，2013，33(1):91-94.

5 唐松，陸曉和，張國(guó)明.視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤綜合治療的臨床分析［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2013，28(2):167-169.

6 馮亦穎，王巨存，潘振華，李正翔，李燕.小檗胺對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-RB44細(xì)胞增殖的抑制作用［J］.天津醫(yī)藥，2012，40(4): 356-358.

7 Cho WC，Leung KN.In vitro and in vivo anti-tumor effects of A stragalusmembraneceus［J］.Cancer Lett，2007，252(1):43-46.

8 劉愛平，曾峰.黃芪多糖對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］.腫瘤藥學(xué)，2011，1(6):499-501.

9 鄒品文，趙春景，李攀，尹小燕黃紅.黃芪多糖抗S180肉瘤作用及其免疫調(diào)節(jié)的影響［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，35(1):17-20.

10楊志霞，王琦.黃芪多糖免疫作用的基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展［J］.世界中醫(yī)藥，2013，8(7):833-836.

11黃家林，張勇.黃芪多糖抗炎免疫作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2013，11(11):1374-1376.

12張小鴻，徐先祥，汪寧卿.黃芪保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48(18):1526-1530.

13 Hubert S，Abastado JP.The early steps of the metastatic process［J］.Med Sci(Paris)，2014，30(4):378-384.

14 Wan L，Pantel K，Kang Y.Tumor metastasis:moving new biological insights into the clinic［J］.Nat Med，2013，19(11):1450-1464.

15 Velinov N，Poptodorov G，Gabrovski N，Gabrovski S.The role of matrixmetallo-proteinases in the tumor growth and metastasis［J］.Khirurgiia(Sofiia)，2010，(1):44-49.

16蔡維艷，李愛敏，初清，周廣玉，柳雪梅，李春香.血栓調(diào)節(jié)蛋白、血管性假血友病因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9在過敏性紫癜腎損害早期診斷中的價(jià)值［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2012，27(17):1340-1342.

17王洪興，張潔，朱會(huì)芳，李娜.KISS-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白在胃癌中的表達(dá)及意義［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，29(12): 733-735.

18王永霞，王金祥.人腦膠質(zhì)瘤中核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)及臨床意義［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，29(6): 425-427.

19 Long H，Zhou B，JiangFG.Expression of MMP-2 and MMP-9 in retinoblastoma and their significance［J］.Int J Ophthalmol，2011，4(5): 489-491.

20 Canel M，Serrels A，F(xiàn)rame MC.E-cadherin-integrin crosstalk in cancer invasion and metastasis［J］.J Cell Sci，2013，126(2):393-401.