張毅 陳霞 周凌云 虞昊 楊洪濱

展神經(jīng)是眼運(yùn)動(dòng)神經(jīng)之一，起自腦橋下部的展神經(jīng)核，具有支配眼球眼外肌運(yùn)動(dòng)的功能。由于展神經(jīng)全程走行復(fù)雜，經(jīng)過Dorello管、海綿竇、眶上裂等許多重要的結(jié)構(gòu)，并與頸內(nèi)動(dòng)脈、交感神經(jīng)、Gruber韌帶等結(jié)構(gòu)毗鄰，因此顱內(nèi)炎癥、腫瘤、外傷、顱內(nèi)高壓、眼部病變等常導(dǎo)致展神經(jīng)損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。以往的觀念認(rèn)為腦神經(jīng)損傷后不能再生［2］，但近年來眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)一些腦神經(jīng)損傷后也有再生現(xiàn)象［3-6］。本次我們對(duì)展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)是否有神經(jīng)再生現(xiàn)象進(jìn)行了深入的研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年Beagle犬22只(南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場提供)，年齡1～2歲，體質(zhì)量10～20 kg，體長70～100 cm。對(duì)照組(2只)和實(shí)驗(yàn)組分為損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d五組(各4只)，實(shí)驗(yàn)許可證號(hào):SCXK(蘇):2008-0010。每只籠內(nèi)最多飼養(yǎng)1只，實(shí)驗(yàn)前、后在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)。

1.2 展神經(jīng)損傷模型制備 實(shí)驗(yàn)組Beagle犬術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，腹腔內(nèi)注射30 g·L－1戊巴比妥鈉(1 mL·kg－1)麻醉。將Beagle犬置于側(cè)臥位，頭向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，頭部置于頭圈上，耳緣牽向中線和尾側(cè)。常規(guī)消毒、鋪巾，開顱皮瓣翻向外側(cè)并縫線固定。于顳肌附著處切開顳肌，在顳骨上保留一小片顳肌附著緣，以便關(guān)顱時(shí)縫合。經(jīng)顳底入路開顱，骨窗要盡量靠近顱底，用高速梅花鉆和顯微咬骨鉗形成從眶后到顴弓前足夠大骨窗，擴(kuò)大約3.0 cm×3.0 cm，即可沿骨窗下緣切開硬膜并呈放射狀剪開。通過向內(nèi)、上方牽拉顳葉牽開腦組織，磨除巖骨前部，可見深部的展神經(jīng)(圖1)，穿過腦橋前池，在神經(jīng)切斷后應(yīng)用雙極電凝處理神經(jīng)斷端，并將近側(cè)端翻向腦干方，術(shù)中給予生理鹽水500 mL+慶大霉素16萬U靜脈滴注，術(shù)后當(dāng)天開始連續(xù)3 d肌肉注射青霉素160萬U。保證實(shí)驗(yàn)室溫度在25℃左右，術(shù)中注意動(dòng)物保暖。對(duì)照組Beagle犬同實(shí)驗(yàn)組的手術(shù)入路暴露展神經(jīng)，但不損傷神經(jīng)。

1.3 BrdU靜脈注射 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組術(shù)后每只犬靜脈注射BrdU 50 mg·kg－1，每天2次(早7∶00和晚7∶00)，連續(xù)7 d。1 d組術(shù)后1 d注射BrdU、3 d組術(shù)后連續(xù)3 d注射BrdU，以此類推。

1.4 組織固定及切片 BrdU末次注射后2 h灌注取材。犬麻醉后，開胸經(jīng)心灌注生理鹽水及含有40 g·L－1多聚甲醛的0.1 mol·L－1PBS(pH 7.2)，取腦后固定6 h，再分別經(jīng)200 g·L－1、300 g·L－1蔗糖平衡，行冠狀位冰凍連續(xù)切片，片厚20 μm。共收集各犬展神經(jīng)核部位前、中、后3套切片，均貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上待染色。

1.5 免疫熒光染色 取上述切片，用0.01 mol· L－1PBS(pH 7.2)漂洗后，每張切片滴加體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清50 μL封閉過夜，然后用一抗孵育:兔抗-BrdU(1∶100，Abcam)、鼠抗-nestin(1∶2000，Millipore)、豚鼠抗 DCX(1∶1000，Millipore)、鼠抗-GFAP(1∶500，Millipore)，4℃濕盒孵育24 h，用0.01 mol·L－1PBS(pH 7.2)漂洗3遍，在避光條件下，用二抗孵育:結(jié)合有Alexa Fluor 594的羊抗兔二抗(1∶1000，Molecular Probes)、結(jié)合有Alexa Fluor 488的羊抗鼠或豚鼠的二抗(1∶200，invitrogen)4℃濕盒孵育24 h，在避光條件下，PBS洗片3遍后，中性甘油封片。熒光顯微鏡下觀察免疫熒光陽性的細(xì)胞數(shù)并攝片。

Figure 1 Abducens nerve(arrow) 展神經(jīng)(箭頭示)

2 結(jié)果

2.1 展神經(jīng)損傷后功能測(cè)定 所有存活Beagle犬術(shù)后均生存良好，無感染、角膜潰瘍等并發(fā)癥，展神經(jīng)切斷后，犬眼球始終呈內(nèi)斜視(圖2)，無其他神經(jīng)功能障礙征象。

Figure 2 Eye ball position after abducens nerve injury 展神經(jīng)損傷后眼球位置

2.2 BrdU陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 對(duì)照組雙側(cè)展神經(jīng)核及實(shí)驗(yàn)組健側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)BrdU免疫熒光反應(yīng)為陰性。實(shí)驗(yàn)組各組中4只犬抽取展神經(jīng)核頭部、體部、尾部切片各1張，每組共12張切片，觀察并記錄BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)BrdU免疫熒光反應(yīng)均呈陽性。展神經(jīng)損傷后3 d，展神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的再生已經(jīng)開始并且數(shù)量達(dá)到高峰，損傷后7 d核內(nèi)新生細(xì)胞數(shù)量開始減少，28 d時(shí)新生細(xì)胞明顯減少，見圖3。

2.3 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè) 術(shù)后各組，對(duì)雙側(cè)展神經(jīng)核進(jìn)行nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)可見到nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞(圖4)，而對(duì)照組雙側(cè)展神經(jīng)核及實(shí)驗(yàn)組健側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)未見到nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性的細(xì)胞，展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)了具有再生潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞。

2.3.2 DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè) 術(shù)后各組，對(duì)雙側(cè)展神經(jīng)核進(jìn)行DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)可見DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性的新生神經(jīng)元前體細(xì)胞(圖5)，而對(duì)照組雙側(cè)展神經(jīng)核及實(shí)驗(yàn)組健側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)未見到DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性的細(xì)胞。展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)的神經(jīng)前體細(xì)胞，可能具有向神經(jīng)元分化的能力。

2.3.3 GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè) 術(shù)后各組，對(duì)雙側(cè)展神經(jīng)核進(jìn)行GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)可見GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性的新生星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖6)，而對(duì)照組雙側(cè)展神經(jīng)核及實(shí)驗(yàn)組健側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)未見到GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性的細(xì)胞。這一部分的陽性細(xì)胞可能是由損傷后膠質(zhì)增生而來，也可能是展神經(jīng)損傷后由展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)的神經(jīng)前體細(xì)胞分化而來。

Figure 3 Number of newborn cells at different time points after abducens nerve injury 展神經(jīng)損傷后記錄的不同時(shí)間點(diǎn)新生細(xì)胞數(shù)的變化規(guī)律

Figure 4 The neural progenitor cells in the abducens nucleus after abducens nerve injury were detected by Nestin(green)/BrdU(red)immunofluorescence.Nestin/BrdU double positive neural progenitor cells were found in the abducens nucleus after abducens nerve injury(Arrow).A:Nestin immunofluorescence staining;B:BrdU immunofluorescence staining;C:Confocal merge images of A and B Nestin(綠)/BrdU(紅)免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞，損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)Nestin/BrdU免疫熒光陽性神經(jīng)前體細(xì)胞(箭頭)。A:Nestin免疫熒光染色;B:BrdU免疫熒光染色;C:A、B共聚焦合并圖像

Figure 5 The newborn neuronal progenitor cells in the abducens nucleus after abducens nerve injury were detected by DCX(green)/BrdU(red)immunofluorescence.DCX/BrdU double positive newborn neuronal progenitor cells were found in the abducens nucleus after abducens nerve injury(Arrow).A:DCX immunofluorescence staining;B:BrdU immunofluorescence staining;C:Confocal merge images of A and B DCX(綠)/BrdU(紅)免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)新生神經(jīng)元前體細(xì)胞，損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)DCX/BrdU免疫熒光陽性新生神經(jīng)元前體細(xì)胞(箭頭)。A:DCX免疫熒光染色;B:BrdU免疫熒光染色;C:A、B共聚焦合并圖像

Figure 6 The newborn astrocytes in the abducens nucleus after abducens nerve injury were detected by GFAP(green)/BrdU(red)immunofluorescence.GFAP/BrdU double positive newborn astrocytes were found in the abducens nucleus after abducens nerve injury(Arrow).A:GFAP immunofluorescence staining;B:BrdU immunofluorescence staining;C:Confocal merge images of A and B GFAP(綠)/BrdU(紅)免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)新生星形膠質(zhì)細(xì)胞，損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)出現(xiàn)GFAP/BrdU免疫熒光陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞(箭頭)。A:GFAP免疫熒光染色;B:BrdU免疫熒光染色;C:A、B共聚焦合并圖像

3 討論

展神經(jīng)損傷是神經(jīng)外科、眼科、五官科常見的并發(fā)癥，另外經(jīng)靜脈系統(tǒng)的巖下竇造影術(shù)、海綿竇手術(shù)介入過度填塞靜脈也常常引起展神經(jīng)損傷［7］。展神經(jīng)損傷后可引起眼球向外運(yùn)動(dòng)障礙出現(xiàn)內(nèi)斜視、復(fù)視等癥狀，目前對(duì)于展神經(jīng)損傷后除針對(duì)病因進(jìn)行治療外，尚無很好的康復(fù)治療方法。因此對(duì)展神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復(fù)的臨床探索和基礎(chǔ)研究顯得尤為重要。

展神經(jīng)在組織學(xué)上僅被1～2層髓鞘細(xì)胞包繞，缺乏神經(jīng)外膜、基底膜和牢固的神經(jīng)束膜包被，膠原蛋白含量明顯也低于其他周圍神經(jīng)，且缺少用于連接神經(jīng)束的結(jié)締組織，給修復(fù)和重建帶來一定困難［7-8］。目前關(guān)于展神經(jīng)損傷后是否具有一定自我再生修復(fù)能力尚未見報(bào)道。本研究觀察到，犬展神經(jīng)損傷后(1～28 d)，損傷側(cè)展神經(jīng)核內(nèi)有nestin/ BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞，而且有新生的DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性的神經(jīng)元前體細(xì)胞以及GFAP/BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。本研究表明展神經(jīng)損傷后，具有一定的自我再生能力，出現(xiàn)的神經(jīng)前體細(xì)胞能夠向神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，這些新生的細(xì)胞可能參與了展神經(jīng)的再生過程。以往研究發(fā)現(xiàn)前庭神經(jīng)和動(dòng)眼神經(jīng)損傷后3 d，前庭神經(jīng)核和動(dòng)眼神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)再生出現(xiàn)高峰，前庭神經(jīng)損傷后28 d時(shí)新生神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，而動(dòng)眼神經(jīng)損傷后14 d和28 d時(shí)，新生神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)由增多到減少的現(xiàn)象［9-10］。我們研究表明:展神經(jīng)損傷后，展神經(jīng)核內(nèi)也存在新生神經(jīng)細(xì)胞，損傷后3 d，展神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的再生已經(jīng)開始并且數(shù)量達(dá)到高峰，新生細(xì)胞數(shù)量在7 d時(shí)開始逐漸減少，28 d時(shí)新生神經(jīng)細(xì)胞明顯減少。我們認(rèn)為不同實(shí)驗(yàn)神經(jīng)細(xì)胞再生在時(shí)間周期上出現(xiàn)的差異與實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物及神經(jīng)的成分有密切的關(guān)系。

在臨床中我們發(fā)現(xiàn)展神經(jīng)損傷后部分患者不經(jīng)治療，也能稍有好轉(zhuǎn)，結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析可能與展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞再生有關(guān)，但實(shí)驗(yàn)顯示新生細(xì)胞數(shù)量有限，限制了其自我修復(fù)的能力，所以大多數(shù)患者不能恢復(fù)到正常狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)證明了展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內(nèi)存在新生神經(jīng)細(xì)胞，且可以分化為神經(jīng)前體細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，表明神經(jīng)細(xì)胞是可以再生的，為展神經(jīng)功能修復(fù)等相關(guān)研究領(lǐng)域開辟了新的道路。神經(jīng)系統(tǒng)是人體重要的組成部分之一，損傷神經(jīng)的再生修復(fù)一直是研究熱點(diǎn)。而無論是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還是周圍神經(jīng)系統(tǒng)，損傷神經(jīng)的再生受到多種因素的影響［11-13］，如何刺激展神經(jīng)核內(nèi)再生神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量增加，誘導(dǎo)其分化，以便更好地幫助展神經(jīng)損傷后功能的恢復(fù)是我們下一步的研究重點(diǎn)。

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