王亞娜 高莎 沈璽

缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞以及滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性，是現(xiàn)今導(dǎo)致視力損害甚至視力喪失的重要原因。在缺血缺氧情況下，視神經(jīng)的損傷甚至凋亡是造成視力損害的機(jī)制之一［1-2］。越來越多的研究表明，色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)兼具抑制新生血管形成及神經(jīng)保護(hù)的作用［3-4］。但在缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變中，PEDF發(fā)揮視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過建立氧誘導(dǎo)缺血性視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced ischemic retinopathy，OIR)小鼠模型，觀察PEDF對OIR模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)凋亡及凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討PEDF抑制細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 清潔級7 d齡C57BL/6J小鼠140只，雌雄不限，與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)，由上海市瑞金醫(yī)院動物房提供，動物的飼養(yǎng)條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》。采用隨機(jī)數(shù)字表法將140只小鼠分成正常對照組、OIR模型組、PBS治療對照組、PEDF藥物治療組，每組35只。

1.2 主要試劑 TUNEL原位凋亡試劑盒(羅氏公司)，Bcl-2兔單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology)，GAPDH兔單克隆抗體(美國R＆D公司)，Alexa Fluor?488標(biāo)記的雞抗兔熒光二抗(1∶50，美國InvitrogenTM)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(碧云天)。

1.3 OIR模型的建立 將除正常對照組外的所有7 d齡小鼠與哺乳母鼠共同置于含氧體積分?jǐn)?shù)為(75±2)%的氧箱內(nèi)飼養(yǎng)5 d。箱內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，每天日光照射12 h。之后將各組小鼠與哺乳母鼠置于正常氧環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5 d，建立OIR模型;正常對照組小鼠始終置于正常氧環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.4 藥物干預(yù)及取材 所有小鼠均取右眼為實(shí)驗(yàn)眼。造模成功后，PEDF藥物治療組分別于小鼠12 d齡和14 d齡給予兩次玻璃體內(nèi)注射PEDF(2 μg· μL－1)各1 μL［5］，PBS治療對照組玻璃體內(nèi)注射等量的PBS(10 mmol·L－1，pH7.4)。OIR模型組僅造模，不注射藥物;正常對照組不作任何處理。所有小鼠均于17 d齡過量麻醉處死，各組隨機(jī)抽取5只，摘除右眼球，立即浸泡于40 g·L－1多聚甲醛溶液中固定，以供制作冰凍切片;其余小鼠過量麻醉處死后手術(shù)顯微鏡下分離取出視網(wǎng)膜，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存，以備提取蛋白質(zhì)和總RNA。

1.5 TUNEL染色原位檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況恒溫冰凍切片，用新制備的40 g·L－1多聚甲醛固定，室溫20 min。PBS洗片后，于通透液(體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton X-100溶液于1 g·L－1枸櫞酸鈉溶液中)冰浴中孵育2 min。PBS沖洗2次，擦干樣品周圍的水，滴加50 μL的TUNEL反應(yīng)混合溶液，在濕盒中37℃孵育60 min。PBS沖洗3次。染核后洗凈并封片。

1.6 免疫熒光染色觀察視網(wǎng)膜組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)情況 恒溫冰凍切片，用新制備的40 g·L－1多聚甲醛固定，室溫20 min。10 mmol·L－1PBS洗10 min×3次，通透液(體積分?jǐn)?shù)為0.1%的 Triton X-100溶于10 mmol·L－1PBS中)中室溫孵育15 min。PBS洗10 min×3次，滴加按1∶100比例稀釋的一抗，4℃濕盒中過夜?；謴?fù)至室溫，PBS洗10 min×3次。滴加按1∶50比例稀釋的二抗工作液(注意避光)，37℃孵育1 h，PBS洗10 min×3次，DAPI染核室溫10 min，PBS沖洗，封片。

1.7 Western-blot檢測視網(wǎng)膜組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)情況 取出各組視網(wǎng)膜，提取蛋白后酶標(biāo)儀測蛋白濃度，計(jì)算含40 μg蛋白的溶液為上樣量，與蛋白上樣緩沖液混合后100℃加熱5 min使其變性，加入配置好的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF(美國Millipore公司)上，50 g·L－1脫脂奶粉37℃封閉1～2 h，洗膜后分別加入按1∶100稀釋的Bcl-2一抗以及1∶10 000稀釋的GAPDH一抗;4℃過夜后洗膜，分別加入HRP標(biāo)記的1∶500稀釋的二抗。室溫下孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次。進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯色，各組以GAPDH作為內(nèi)參照。用GIS-2020凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶的光密度(OD)值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH OD值的比值作為目的蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

1.8 Real time RT-PCR檢測視網(wǎng)膜組織中bcl-2 mRNA的表達(dá)情況 每組隨機(jī)取10個(gè)視網(wǎng)膜樣本，利用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA，利用分光光度計(jì)測定 A260、A280及其濃度，根據(jù)A260/A280和A280/A260的比值鑒定總RNA的純度，之后每組每個(gè)視網(wǎng)膜樣品根據(jù)測得的總RNA濃度取2 μg總RNA，20 μL體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。引物設(shè)計(jì)合成如下:Bcl-2上游引物:5’-TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’，下 游 引 物:5’-ATTTCTACTGCTTTAGTGAACC-3’;β-Actin上游引物:5’-CTTCTTTGCAGCTCCTTCGT-3’，下游引物: 5’-GTGCCAGATCTTCTCCATGT-3’。采 用 SYBR green PCR試劑盒(日本Takara公司)，優(yōu)化反應(yīng)條件，如引物濃度、退火溫度等，使目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率保持一致，接近于1。ABI Prism 7500-HT定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)完成后，得到所有標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，軟件進(jìn)行自動數(shù)據(jù)分析，得出cycle (Ct)值。以目的基因的Ct值減去內(nèi)參基因Ct值計(jì)算△Ct值。以2－△△Ct值表示目的基因相對表達(dá)量。每組取8個(gè)樣品，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL原位凋亡染色結(jié)果 各組小鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色結(jié)果見圖1。OIR模型組與PBS治療對照組小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡主要見于RGC層。OIR模型組小鼠 RGC層細(xì)胞凋亡率為(55.044± 14.538)%，明顯高于正常對照組的(3.317± 1.657)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。PBS治療對照組小鼠 RGC層細(xì)胞凋亡率為(55.852± 4.490)%，明顯高于PEDF藥物治療組的(5.897± 2.079)%及正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01);正常對照組與PEDF藥物治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(四組間F=86.796，P＜0.01)。

Figure 1 TUNEL positive cells in retina of mice in each group(×400，arrows).A:Negative control;B:Normal control group;C:OIR model group; D:Positive control;E:PBS treatment group;F:PEDF treatment group(ONL:Outer nuclear layer;INL:Inner nuclear layer;GCL:Ganglion cell layer)各組小鼠視網(wǎng)膜TUNEL陽性染色細(xì)胞(×400，箭頭示)。A:陰性對照;B:正常對照組;C:OIR模型組;D:陽性對照;E:PBS治療對照組;F: PEDF藥物治療組(ONL:外核層;INL:內(nèi)核層;GCL:RGC層)

2.2 免疫熒光檢測視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白的表達(dá) Bcl-2陽性反應(yīng)出現(xiàn)于外網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)狀層及RGC層。與正常對照組相比，OIR模型組和PBS治療對照組Bcl-2表達(dá)強(qiáng)度明顯降低;PEDF藥物治療組Bcl-2表達(dá)強(qiáng)度較 PBS治療對照組明顯增高(圖2)。

2.3 Western-blot檢測視網(wǎng)膜組織中Bcl-2蛋白的表達(dá) 正常對照組、OIR模型組、PBS治療對照組、PEDF藥物治療組相對OD值(Bcl-2蛋白相對表達(dá)量)分別為0.778 7±0.097 4、0.386 9±0.071 3、0.284 8±0.153 6、0.610 1±0.109 5。與正常對照組比較，OIR模型組和PBS治療對照組Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.01);PEDF藥物治療組Bcl-2蛋白表達(dá)較PBS治療對照組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖3)。

Figure 2 Immunofluorescence staining of Bcl-2 protein expression in retina of mice in each group(×400，red).A:Normal control group;B:OIR model group;C:PBS treatment group;D:PEDF treatment group 各組視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白表達(dá)的免疫熒光染色圖(×400，紅色)。A:正常對照組; B:OIR模型組;C:PBS治療對照組;D:PEDF藥物治療組

Figure 3 Expression of Bcl-2 protein in retina of mice in each group measured by Western-blot Western-blot檢測各組視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白表達(dá)

2.4 Real time RT-PCR檢測視網(wǎng)膜組織中bcl-2 mRNA的表達(dá) 正常對照組、OIR模型組、PBS治療對照組、PEDF藥物治療組Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.000 0、0.694 2±0.235 2、0.481 0±0.100 8、0.818 3±0.308 0。與正常對照組比較，OIR模型組和PBS治療對照組bcl-2 mRNA表達(dá)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05);PEDF藥物治療組bcl-2 mRNA表達(dá)較PBS治療對照組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖4)。

Figure 4 Expression of Bcl-2 mRNA in retina of mice in each group by RT-PCR(*P＜0.05，＊＊P＜0.01)Real time RT-PCR檢測各組視網(wǎng)膜bcl-2 mRNA的表達(dá)(*P＜0.05，＊＊P＜0.01)

3 討論

越來越多的研究表明，缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變不僅引起新生血管的形成還伴有RGC的損傷和凋亡［1-2，6］。視神經(jīng)由RGC的軸突組成，RGC的進(jìn)行性凋亡是視神經(jīng)損傷時(shí)導(dǎo)致視功能不可逆性損害的主要原因。視網(wǎng)膜作為體內(nèi)代謝較為活躍的組織之一，氧耗大，視網(wǎng)膜內(nèi)雙重的血液循環(huán)通路構(gòu)成了其獨(dú)特的氧供途徑［7］。視網(wǎng)膜光感受器以及大部分的外叢狀層細(xì)胞直接從臨近的脈絡(luò)膜血液循環(huán)中獲得所需的氧分，而內(nèi)層視網(wǎng)膜則需要從視網(wǎng)膜中央動脈分支形成的深淺層毛細(xì)血管叢中獲得氧分，因此內(nèi)層視網(wǎng)膜對缺血缺氧反應(yīng)更為敏感。當(dāng)視網(wǎng)膜發(fā)生缺血缺氧性病變時(shí)，內(nèi)層視網(wǎng)膜尤其是RGC細(xì)胞易發(fā)生損傷與凋亡［8］。本研究采用TUNEL法檢測顯示，OIR小鼠RGC層較正常對照組有明顯增多的凋亡細(xì)胞。Sivakumar等［9］的研究也表明低氧誘導(dǎo)了RGC的凋亡。

在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體外膜通透性增高致使cyt-c的釋放是線粒體介導(dǎo)凋亡過程的重要環(huán)節(jié)。釋放至細(xì)胞質(zhì)的cyt-c與凋亡蛋白酶激活因子-1結(jié)合后與半胱天冬酶原-9結(jié)合，參與和促進(jìn)凋亡小體的形成，從而啟動caspase的級聯(lián)反應(yīng)，激活下游的凋亡效應(yīng)器caspase-3。Caspase-3又稱為“細(xì)胞死亡執(zhí)行者”，活性caspase-3可導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的放大效應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10-11］。而Bcl-2可通過調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性和完整性來調(diào)控這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Bcl-2是一種結(jié)合在線粒體外膜上的抑制細(xì)胞凋亡的基因，可以穩(wěn)定線粒體的結(jié)構(gòu)，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，從而阻止cyt-c從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)［12］;同時(shí)缺血缺氧情況下，Bcl-2還可以抑制促凋亡因子Bax從細(xì)胞質(zhì)遷移到線粒體外膜上，減弱線粒體外膜通透性，從而抑制細(xì)胞凋亡［13］。研究證實(shí)［14］，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使神經(jīng)元Bcl-2高度表達(dá)，減少了神經(jīng)元的凋亡;誘導(dǎo)缺血后，轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型比較Bcl-2表現(xiàn)出了明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。正常視網(wǎng)膜表達(dá)一定量的Bcl-2，缺血缺氧情況下，Bcl-2的表達(dá)會發(fā)生一些改變。視網(wǎng)膜受損早期表達(dá)迅速增多并達(dá)到高峰，但隨后開始下降并維持在一定的水平［15］。本研究顯示，OIR小鼠17 d齡時(shí)視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白與mRNA表達(dá)均較正常對照組下調(diào)。這與Peng等［16］關(guān)于視網(wǎng)膜RGC-5在體外低氧環(huán)境下培養(yǎng)Bcl-2表達(dá)下調(diào)的研究一致。

以往研究表明，神經(jīng)保護(hù)藥物可以通過調(diào)節(jié)與凋亡通路相關(guān)的凋亡因子的表達(dá)減緩RGC的凋亡。PEDF以其獨(dú)特的具有神經(jīng)保護(hù)和抑制新生血管的雙重作用而受到越來越多的關(guān)注［4，17］。Pang等［18］的研究證明，PEDF對體內(nèi)外培養(yǎng)的RGC均有神經(jīng)保護(hù)作用，并且其作用要強(qiáng)于等濃度的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。PEDF主要通過以下三條途徑在神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞中起作用:MAPK、AKt/NF-κB和caspase途徑。PEDF通過AKt/NF-κB途徑起神經(jīng)保護(hù)作用，而通過MAPK和caspase途徑起調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用［17］。本研究采用玻璃體內(nèi)注射的方法對OIR小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行PEDF干預(yù)，結(jié)果顯示，RGC凋亡明顯減少，同時(shí)Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平較OIR模型組及PBS治療對照組顯著升高。表明在缺血缺氧環(huán)境下，PEDF可能通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)而減弱或抑制 RGC的凋亡。這與 Murakami等［19］的關(guān)于PEDF調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)的研究結(jié)果一致。在凋亡過程中，線粒體膜電位發(fā)生變化，釋放凋亡誘導(dǎo)因子(AIF);Bcl-2能抑制AIF的釋放，這也是Bcl-2保持線粒體外膜通透性和完整性的機(jī)制之一。Murakami等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，血清饑餓誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜R28細(xì)胞的凋亡引起線粒體去極化，釋放AIF，而重組人PEDF可以改善線粒體的這種特征性病變;同時(shí)重組人PEDF干預(yù)上調(diào)了Bcl-2的表達(dá)。因此PEDF可能通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平而抑制了AIF從線粒體的釋放，同時(shí)上調(diào)的Bcl-2減緩甚至改善了線粒體的膜電位變化。而Yabe等［20］在小腦顆粒細(xì)胞的研究表明，PEDF還可激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)抑制凋亡因子Bcl-2、Bcl-x和Mn-SOD等，或一些神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、BDNF、GDNF等的基因表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，PEDF可能通過激活NF-κB，繼而誘導(dǎo)Bcl-2的表達(dá)，Bcl-2抑制了缺血缺氧等損傷因素刺激下線粒體的去極化和AIF的釋放，減緩或逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞的凋亡過程，從而發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用。這一機(jī)制鏈有待于在缺血缺氧視網(wǎng)膜病變模型中進(jìn)一步研究證實(shí)，從而豐富并明確這一類疾病的治療靶點(diǎn)與策略。

綜上所述，本研究利用OIR小鼠模型觀察了PEDF對缺血缺氧環(huán)境下RGC凋亡的抑制作用及其對Bcl-2表達(dá)的影響，證實(shí)了在缺血缺氧情況下，PEDF可以通過上調(diào)視網(wǎng)膜 Bcl-2的表達(dá)而抑制RGC的凋亡，并在此基礎(chǔ)上探討了PEDF這一作用的上下游機(jī)制。這為預(yù)防和治療諸如糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、青光眼、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等引起的視神經(jīng)病變提供了新的策略。

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