陳娜，陳可可，費建楓，陳小娥，方旭波，2，*，胡道亨

（1.浙江海洋學院食品與藥學學院，浙江舟山316004；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江舟山316004；3.舟山市普陀新興醫(yī)藥化工有限公司，浙江舟山316111）

蝦加工下腳料濃縮蛋白粉制備工藝研究

陳娜1，陳可可1，費建楓1，陳小娥1，方旭波1，2，*，胡道亨3

（1.浙江海洋學院食品與藥學學院，浙江舟山316004；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江舟山316004；3.舟山市普陀新興醫(yī)藥化工有限公司，浙江舟山316111）

以蝦加工下腳料所采肉為原料，利用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶進行水解，以水解度為指標篩選得木瓜蛋白酶為最佳酶，并采用L9（34）正交試驗進一步研究木瓜蛋白酶酶解的最佳工藝條件。結果為固液比為1∶2.5，pH=7.5，酶用量6 000U/g，在55℃下酶解5.0 h，其水解度可達28.12%；將水解液經(jīng)離心過濾、濃縮、噴霧干燥制得濃縮蛋白粉，經(jīng)檢測其所含水分3.21%、灰分3.05%、脂肪3.26%、蛋白質(zhì)90.16%，可作為調(diào)味品、作為功能食品的補充成分或飼料添加。

蝦加工下腳料；木瓜蛋白酶；水解；正交試驗；濃縮蛋白

我國蝦產(chǎn)量豐富，加工出口的主要包括對蝦、淡水小龍蝦的蝦仁湯料等。近年來，隨著水產(chǎn)企業(yè)的增多，加工過程中伴隨著產(chǎn)生的下腳料也越來越多。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，浙江以海水蝦或淡水蝦為主要原料的生產(chǎn)企業(yè)在處理這些下腳料時，一部分作為廢料外售，每噸幾百元不等，或者運送到養(yǎng)殖場烘干粉碎作為飼料，還有很多未來得及處理的下腳料由于堆砌一處發(fā)霉腐爛，最終直接運往垃圾場。而這些副產(chǎn)物含有豐富的蛋白質(zhì)、蝦紅素、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，含有鈣、鎂、磷等礦物質(zhì)鹽類以及腦磷脂、卵磷脂、類胡蘿卜素、碳水化合物、纖維素、維生素等營養(yǎng)成分[1]。蝦副產(chǎn)物主要是指對原料蝦篩選后加工成蝦仁、蝦尾及整肢蝦等產(chǎn)品的下腳料，包括大量無法加工利用的低值小蝦、蝦殼、蝦足及蝦頭，這些下腳料含有許多殘肉。目前，將少量蝦頭、蝦殼等粉碎后摻入魚粉作為飼料、誘餌，以及用蝦頭、蝦殼提取功能性營養(yǎng)物質(zhì)已有許多報道。下腳料中低值蝦類、小蝦等殘留大量蝦肉，將這些殘留蝦肉加以利用具有更高的利用價值，同時采肉后的蝦殼蝦頭可做進一步處理。因此，本試驗利用蛋白酶水解[2]下腳料所采肉制成濃縮蛋白粉，同時優(yōu)化其工藝條件，為企業(yè)實現(xiàn)廢料資源化利用提供參考，而且可減少各種下腳料、廢棄物對環(huán)境的污染。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蝦加工下腳料：舟山市普陀新興醫(yī)藥化工有限公司提供。

胰蛋白酶為廣州正一科技有限公司分銷提供，木瓜蛋白酶為廣州華琪酶制劑廠提供，堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶均為廣西南寧龐博生物工程有限公司提供；其他化學試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設備

分析天平（萬分之一）：湘西天平儀器廠；HH-6系列恒溫水浴鍋：金壇市榮華儀器制造有限公司；JR-22實驗室用絞肉機：諸城市匯豐食品機械有限公司；RE-52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；PHS-3B精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；78-1型磁力加熱攪拌器：金壇市環(huán)宇科學儀器廠；TDL-5-A型離心機：上海安亭科學儀器廠；噴霧干燥機：錫山市林州干燥機廠。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶的篩選

揀出蝦加工下腳料中混雜的石塊、金屬等異物，清洗，瀝水，絞肉，經(jīng)預處理后冷凍備用。取一定質(zhì)量原料一夜自然解凍[3]后，調(diào)成料液比1∶2.5，在恒溫水浴鍋中預熱至50℃，調(diào)節(jié)至所需的pH（見表1），分別加入菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶進行酶解，添加量6 000U/g，酶解4 h后，90℃水浴中滅酶15min，3 000 r/min離心20min，取上清液進行水解度測定。

表1 商品酶的相關參數(shù)表Table1 Related parameters of the table of commodity enzyme

1.3.2 單因素實驗

用所篩選酶進行水解，分別研究溫度、pH、酶解時間和酶用量對水解度的影響，

1.3.3 正交試驗

以水解度為評價指標，考察酶解效果[4]，研究溫度、pH、酶解時間、酶用量4個因素，設計L9（34）正交試驗，因素水平見表2，確定最佳的水解條件。

表2 正交試驗因素設計表Table2 Factors of orthogonal test design table

1.3.4 濃縮蛋白粉的制備

在正交試驗所得最佳條件下進行酶解，滅酶后離心過濾，取上清液濃縮，噴霧干燥[5]制得濃縮蛋白粉。

1.3.5 測定方法

直接干燥法測定水分[6]，550℃灼燒法測灰分[6]，凱式定氮法測粗蛋白含量[7]，索式抽提法測粗脂肪含量[6]，用甲醛滴定法[6]測氨基氮含量，微量凱式定氮法測總氮含量[6]，計算其水解度，計算公式如下：

DH=酶解液中的游離氨基氮含量/原料中的含氮量×100%

2 結果與討論

2.1 酶的篩選結果

在一定條件下，用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶進行酶解實驗。結果見表3。

表3 4種酶水解效果比較Table3 The comparation of hydrolysis effect of four enzymes

從表2可以看出，木瓜蛋白酶的水解效果最好，可達26.73%，其次是胰蛋白酶，堿性蛋白酶，菠蘿蛋白酶，考慮到木瓜蛋白酶資源豐富，價格低廉，且水解能力好，水解液苦味較弱，更能適應實際生產(chǎn)的需要等優(yōu)點，故本實驗選擇木瓜蛋白酶進行水解。

2.2 單因素實驗

2.2.1 溫度對水解度的影響

在pH=7.0、料液比1∶2.5、時間4.0 h、酶用量6 000U/g的條件下，在不同溫度下進行水解，結果見圖1。

從圖1可以看出，從45℃升至60℃，水解度呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，達到60℃后曲線雖有增加但較為緩和，可能因為在一定溫度范圍內(nèi)，酶的活性比較高反應速率較大，超出這個范圍酶活降低，認為最適溫度范圍為60℃～65℃，考慮到提高溫度對應著生產(chǎn)成本的提高，故選擇60℃作為溫度單因素的最佳溫度。

圖1 水解溫度對水解度的影響Fig.1 Effects of temperature on DH of hydrolysate

2.2.2 pH對水解度的影響

在料液比1∶2.5、時間4.0 h、酶用量6 000U/g的條件下。分別用1.0mol/LHCL或NaOH調(diào)節(jié)pH至4.5、5.5、6.5、7.5、8.5進行水解，結果見圖2。

圖2 pH對水解度的影響Fig.2 Effects of pH on DH of hydrolysate

由圖2可知，蛋白質(zhì)的水解率在pH=7.5時達到最大，而當pH大于或小于7.5時水解度下降較明顯，故初步將pH=7.5作為pH對水解度單因素中的最優(yōu)選。

2.2.3 水解時間對水解率的影響

在pH=7.0、溫度為60℃、酶用量6 000 U/g、料液比1∶2.5的條件下，分別水解2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 h，測其水解度，結果見圖3。

圖3 酶解時間對水解度的影響Fig.3 Effects of time on DH of hydrolysate

從圖3可以看出，增加酶解反應時間，有利于反應的充分進行；反應時間達到4.5 h測得的水解度幾乎呈現(xiàn)線性增長，說明在此段時間里酶解反應較快速的進行，而達到5.5 h后，水解度變化不明顯，可能由于隨著反應的進行，底物濃度減小且伴隨著水解產(chǎn)物的影響，使得酶與底物接觸受阻，導致酶解反應的速率降低。故初步將酶解時間確定為5.5 h。

2.2.4 酶用量對水解度的影響

在pH=7.0、料液比1∶2.5、時間4.0 h、考察木瓜蛋白酶不同添加量對水解度的影響，結果見圖4。

圖4 酶用量對水解度的影響Fig.4 Effects of amount of enzyme on DH of hydrolysate

由圖4可看出，當?shù)孜锪恳欢〞r，在酶飽和底物之前，反應速率隨酶濃度的變化而變化[8]，蛋白質(zhì)的水解度增大，酶用量從3 000 U/g到6 000 U/g時，曲線增長明顯，達到6 000U/g后，由于底物達到飽和，再增加酶量水解度變化不明顯，因此可以確定使得底物飽和的酶用量大致在6 000U/g～7 000U/g之間，綜合考慮實驗指標和加工成本，選擇6 000U/g較為合適。

2.3 正交試驗

正交試驗結果如表4所示。

表4 正交試驗結果Table4 Orthogonal test results

通過對正交試驗結果進行直觀分析，可知，因素B的極差最大，其次是C，D，A，由此可見決定實驗結果因素的主次順序為B＞C＞D＞A，其最佳組合是A2B2C3D2。比較之下，因素A的極差較小，對水解度的影響不大，且考慮到節(jié)約成本，故選擇溫度為55℃。近來有一些學者也指出，在使用酶時，為了避免酶所產(chǎn)生的一些潛在的危害，所以盡可能降低酶的處理時間[9]，故時間選擇5.0 h更加合適，即最終優(yōu)化條件為A1B2C2D2，即初始溫度55℃、pH=7.5，酶用量6 000U/g，酶解時間5.0 h。

2.4 驗證試驗

在以上得到的優(yōu)化工藝條件下，進行驗證實驗，實驗重復3次，得到蛋白質(zhì)水解度為（28.12±0.15）%，所以通過正交實驗得到的最優(yōu)工藝條件具有一定的科學性、可靠性。

2.5 濃縮蛋白粉主要成分分析[10]

制得的濃縮蛋白粉含水分3.21%、灰分3.05%、脂肪3.26%、蛋白質(zhì)90.16%，且蝦味濃郁，鮮味十足。與幾種常見蛋白制品比較分析，結果見表5。

表5 濃縮蛋白粉制品與幾種常見蛋白產(chǎn)品營養(yǎng)成分比較Table5 The nutrition comparison of enrichment protein powder products and several protein products

3 結論

以水解度為指標，從4種常用酶篩選出木瓜蛋白酶最適合用于本試驗。通過正交試驗，得到最佳優(yōu)化條件為，當固液比為1∶2.5，pH=7.5，酶用量6 000U/g，在55℃下酶解5.0h，此時水解度可達28.12%，將水解液離心過濾，濃縮，噴霧干燥制得濃縮蛋白粉，經(jīng)檢測其所含水分3.21%、灰分3.05%、脂肪3.26%、蛋白質(zhì)90.16%，且制品蝦味濃郁、色澤較好，粉末狀顆粒，非常適合作為蛋白強化劑或風味料的填充劑等。

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A Method of Concentrating Protein from Shrimp Using Enzyme Preparation

CHEN Na1，CHEN Ke-ke1，F(xiàn)EI Jian-feng1，CHEN Xiao-e1，F(xiàn)ANG Xu-bo1，2，*，HU Dao-heng3
（1.School of Food Science and Pharmacy，ZheJiang Ocean University，ZhouShan 316004，Zhejiang，China；2.Joint Key Laboratory of Zhejiang Province for the Research of Fishery Processing Technology，Zhoushan 316004，Zhejiang，China；3.Zhoushan Putuo Xinxing Pharmachem Co.，LTD.，Zhoushan 316111，Zhejiang，China）

Rate of hydrolysis degree of for the papain was used as an index with processing shrimp as the raw material，trypsin was screened out from papain，pineapple proteinase，alkali protease and trysin.The technological parameter of hydrolysis degree was optimized by L9（34）orthogonal experimental design，the result for the solid-liquid ratio is1∶2.5，pH=7.5，add enzyme quantity6000U/g in 55℃enzyme solution under 5.0h，the hydrolysis degree can amount to 28.12%.will the hydrolyzed centrifuge，concentration，the spray drying the enrichment protein powder，measuring the contains moisture content3.21%3.05%，ash content，3.26%fat，protein 90.16%，can be as a condiment，feed additives，or as a complement to the functional food ingredients。

shrimp processing scraps；papain；hydrolysis；the orthogonal experiment；protein concentrate

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.010

2012-06-25

舟山市科技局項目（10332）；浙江海洋學院大學生創(chuàng)新性實驗項目資助

陳娜（1990—），女（漢），研究生，研究方向：海洋資源利用。

*通信作者：方旭波（1972—），男（漢），副教授，博士。