胡曉云，陳錦章，廖毓菁，黃靜，郭亞兵

·肝癌·

過表達(dá)富組氨酸糖蛋白質(zhì)粒在體外抑制MHCC-97H肝癌細(xì)胞增殖

胡曉云，陳錦章，廖毓菁，黃靜，郭亞兵

目的檢測原發(fā)性肝癌組織富組氨酸糖蛋白(HRG)的表達(dá)，及其在體外研究過表達(dá)富組氨酸糖蛋白質(zhì)粒對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。方法采用免疫組化法檢測8例肝癌組織HRG表達(dá)情況，采用Western blot法檢測11例手術(shù)切除的肝癌組織和癌旁組織HRG表達(dá)的差異；在人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染穩(wěn)定過表達(dá)HRG質(zhì)粒，使用流式細(xì)胞儀分析肝癌細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果8例原發(fā)性肝癌組織HRG表達(dá)量較非腫瘤組織明顯減少；另11例癌組織HRG表達(dá)量為（0.14±0.17），癌旁組織HRG相對表達(dá)量為（1.39±2.08），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；穩(wěn)定過表達(dá)HRG的人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H細(xì)胞增殖比例為（1.72±1.19）%，顯著低于對照組[（14.3±2.99）%，P＜0.01]。結(jié)論原發(fā)性肝癌癌組織HRG表達(dá)明顯減少，過表達(dá)HRG的腫瘤細(xì)胞增殖能力降低。

原發(fā)性肝癌；富組氨酸糖蛋白；細(xì)胞增殖；體外

富組氨酸糖蛋白（histidine-rich glycoprotein, HRG）是位于第3號染色體上的抑癌基因，分子質(zhì)量為67～75 kD，為一單鏈α2血漿糖蛋白。大多數(shù)HRG在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中合成，儲存于血小板的α顆粒中，受凝血酶激活釋放[1，2]。HRG可與眾多配體結(jié)合，從而行使多種功能[3]。有研究證明HRG有調(diào)節(jié)纖維蛋白生成、抑制可溶性免疫復(fù)合物形成、極化M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化、清除凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞、抗異常血管新生、抑制腫瘤生長和具有抗菌活性等作用[4～6]。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)HRG在多種腫瘤中的表達(dá)量下降，如纖維肉瘤、膠質(zhì)瘤、胰腺癌、乳腺癌等，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1，7，8]，缺乏HRG表達(dá)會增強(qiáng)纖維肉瘤及胰腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[8]。HRG能抑制小鼠膠質(zhì)瘤模型中腫瘤的形成及進(jìn)展[1]。有人認(rèn)為血液HRG水平可作為診斷早期肝癌的分子標(biāo)志物[9]。一項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)研究表明HRG表達(dá)與胰腺癌的總體生存期存在一定的正相關(guān)關(guān)系[7]。關(guān)于HRG在原發(fā)性肝癌腫瘤組織中表達(dá)情況的研究甚少，其在肝癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用尚未見報道。因此，本研究采用免疫組化方法，對8例肝癌組織HRG的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測；采用Western blot法檢測了11例手術(shù)切除的肝癌組織及癌旁組織HRG蛋白的表達(dá)差異，并進(jìn)行量化分析；最后采用5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）檢測法和流式細(xì)胞儀分析了穩(wěn)定過表達(dá)HRG的人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H細(xì)胞的增殖能力，以對HRG在肝癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒與試劑人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫；對照質(zhì)粒pEZ-M03-vector和過表達(dá)HRG質(zhì)粒pEZ-M03-HRG（EX-G0140-M03）均由上海吉凱基因公司合成。兔抗人HRG多克隆抗體購自美國Epitomics公司。鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，生物素標(biāo)記二抗工作液和DAB試劑盒購自Dako公司，化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）購自美國Bio-Rad公司；PVDF膜購自美國Millipore公司，LipofectaminTM 2000及EdU檢測試劑盒均購自美國Invitrogen公司，G418購自美國Sigma公司。

1.2 臨床病理組織獲取2012年11月至12月收集南方醫(yī)院住院行外科手術(shù)切除的肝癌組織和鄰近的肝組織8例，用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組化檢測。自2010年1月至2012年12月行外科手術(shù)切除的肝癌及癌旁組織11例，取肝癌組織時避開腫瘤中心壞死組織，癌旁組織取自距腫塊邊緣2 cm以外的肝組織，置-80℃凍存，用于提取組織蛋白。標(biāo)本的收集已獲得患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 肝癌組織HRG的檢測采用免疫組織化學(xué)染色法，將8例肝癌組織和鄰近的肝組織石蠟切片置于65℃烤箱中烤2 h，常規(guī)脫蠟至水，用蒸餾水洗3次。3%H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗，在pH 9.0 Tris-EDTA緩沖液中高壓修復(fù)抗原3 min，PBS沖洗，滴加多克隆抗HRG（1：75），4℃孵育過夜；PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，室溫孵育60 min；PBS沖洗，DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，蒸餾水洗滌，脫水、透明、封片。隨機(jī)觀察每張切片10個高倍鏡視野（400×），每個視野計數(shù)500～1000個細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞著色程度評分：無著色為陰性，淡黃色為弱陽性，棕黃色為陽性。

1.4 肝癌及癌旁組織HRG檢測采用Western blot法，提取組織蛋白后，測定蛋白質(zhì)濃度，制備上樣標(biāo)本，加樣，行蛋白質(zhì)凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移、封閉、分別加入兔抗人HRG多克隆抗體（1：100）、鼠抗人β-actin單克隆抗體（1：1000），4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的抗兔、抗鼠二抗（1：2500），室溫孵育1 h，TBST洗膜后，行化學(xué)發(fā)光檢測（LAS 4000 mini，美國GE公司）。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)HRG的肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建利用LipofectaminTM 2000介導(dǎo)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將對照質(zhì)粒pEZ-M03-vector和過表達(dá)HRG質(zhì)粒pEZ-M03-HRG分別轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞株MHCC-97H細(xì)胞，24 h后1:1傳代至6孔板，換用含800μg/ml G418的培養(yǎng)基，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將加壓篩選14 d后的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至1個細(xì)胞/200μl，以每孔10個細(xì)胞接種于6孔板，用含800μg/ml G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 w（每3天更換培養(yǎng)基），待肉眼可見克隆出現(xiàn)后，挑選單克隆細(xì)胞至24孔板培養(yǎng)，換用500μg/ml G418的培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞增殖檢測在肝癌細(xì)胞中加入10 μM EdU試劑，孵育2 h，收集細(xì)胞至流式管，洗滌、離心，每管加入100 μl的固定液、混勻，室溫避光孵育15 min，洗滌、離心，每管加入1×皂素溶液100 μl、混勻，每管加入500 μl EdU反應(yīng)混合物、混勻，室溫避光孵育30 min，洗滌，上流式細(xì)胞儀（FACS Canto II，美國BD公司）分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，采用兩樣本t檢驗(yàn)比較對照組與實(shí)驗(yàn)組HRG表達(dá)水平的差異，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織HRG表達(dá)情況在8例肝癌組織中幾乎無HRG表達(dá)，而在其臨近的非腫瘤組織中表達(dá)量相對較高，HRG染色呈黃褐色陽性顆粒，不均一地分布于非腫瘤組織的細(xì)胞漿中（圖1）。

圖1 原發(fā)性肝癌癌組織和其臨近的非腫瘤組織HRG的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色法，400×）

經(jīng)Western blot法檢測，在11例肝癌患者，與癌旁肝組織比，肝癌組織HRG表達(dá)明顯減少，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行量化比較，發(fā)現(xiàn)癌旁組織HRG/β-actin比值為（1.39±2.08），而癌組織為（0.14±0.17），兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 肝癌和肝旁肝組織HRG表達(dá)差異比較

2.2 過表達(dá)HRG質(zhì)粒體外抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力分別篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pEZ-M03-vector和過表達(dá)HRG質(zhì)粒pEZ-M03-HRG（EX-G0140-M03）的肝癌細(xì)胞株MHCC-97H細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)和Western blot法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞HRG表達(dá)水平，如圖3A所示，轉(zhuǎn)染pEZ-M03-HRG質(zhì)粒后MHCC-97H肝癌細(xì)胞HRG表達(dá)顯著上調(diào)，而在轉(zhuǎn)染pEZ-M03-vector質(zhì)粒的MHCC-97H肝癌細(xì)胞幾乎檢測不到HRG表達(dá)。隨后，使用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞株的體外增殖能力，結(jié)果如圖3B所示，過表達(dá)HRG能抑制MHCC-97H細(xì)胞的體外增殖能力，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，對照組增殖細(xì)胞比例為（14.3±2.99）%，過表達(dá)HRG組增殖細(xì)胞比例為（1.72±1.19）%，進(jìn)行統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞比，過表達(dá)HRG的MHCC-97H細(xì)胞體外增殖能力明顯變慢，兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。

圖3 過表達(dá)HRG對肝癌細(xì)胞株MHCC-97H細(xì)胞體外增殖能力的影響

3 討論

本研究證實(shí)HRG在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)。以往研究證明HRG在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)[1，2，8]，HRG在肝癌中的表達(dá)情況沒有專門的文獻(xiàn)報道，Rolny C et al采用組織芯片技術(shù)檢測了HCC組織中HRG的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其較正常肝組織明顯減少，但未對HRG在肝癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用行專門的探討。研究證實(shí)HRG通過下調(diào)PIGF的表達(dá)，使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞發(fā)生極化和血管正?；瑥亩l(fā)揮抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用[4]。Tugues S et al研究表明在缺乏HRG表達(dá)的小鼠纖維肉瘤和胰腺癌腫瘤模型中，小鼠正常的脈管系統(tǒng)和造血系統(tǒng)并沒有任何的異常，但較野生型小鼠腫瘤生長速度和轉(zhuǎn)移加快，出現(xiàn)腫瘤內(nèi)異常血管增多和M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞增多等現(xiàn)象十分明顯[8]。這兩個研究團(tuán)隊(duì)的研究都表明HRG能夠使M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化到具有抑制腫瘤效應(yīng)的M1型，從而使由M1型細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、IL-12、CXCL-9、IFN-α等）增加，刺激和促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞的產(chǎn)生，加強(qiáng)抗腫瘤免疫作用[4，8]。也有研究表明在HRG缺陷的小鼠會出現(xiàn)T細(xì)胞運(yùn)動減弱及其與抗原遞呈細(xì)胞的相互作用受影響，從而影響了機(jī)體的免疫反應(yīng)。綜上，HRG的抗異常血管增生、使腫瘤血管正?；翱鼓[瘤免疫等作用能從總體上發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和改善化療藥物的灌注?？梢奌RG在多種腫瘤中表達(dá)下降，給腫瘤的生長轉(zhuǎn)移營造了一個合適的微環(huán)境，但這種改變對機(jī)體正常的脈管系統(tǒng)并沒有造成影響[4，10，11]。有研究進(jìn)一步證實(shí)HRG存在時能夠在FGF-2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到caspase-3的活性，表明內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡可能是HRG抗血管新生的機(jī)制之一[12]。然而，HRG在肝癌中的表達(dá)為什么會下調(diào)？國際上沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報道，國內(nèi)有文獻(xiàn)提及可能是肝細(xì)胞受損影響HRG的分泌[13]，但是在沒有損害肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)腫瘤中，HRG的表達(dá)量仍較正常低，可見這種觀點(diǎn)并不全面，其表達(dá)下調(diào)的機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。

我們通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HRG蛋白的肝癌細(xì)胞株MHCC-97H細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HRG過表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的體外增殖能力。Karrlander M et al在膠質(zhì)瘤新生小鼠體內(nèi)注入共同表達(dá)PDGF和HRG質(zhì)粒（在52只動物中，成瘤率34%）或單獨(dú)表達(dá)PDGF質(zhì)粒（在38只動物中，成瘤率42%），發(fā)現(xiàn)兩者成瘤率雖有差別，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.514）[1]。該研究沒有與單獨(dú)注射空白質(zhì)粒的小鼠進(jìn)行比較，也沒有對高表達(dá)HRG腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤性進(jìn)行評估，所以還是存在一定的局限性。已有研究證明HRG能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，能夠清除凋亡和壞死的細(xì)胞，具有增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)等作用[1，3，14，15]，這為我們探討HRG是否具有影響腫瘤細(xì)胞的成瘤性奠定了一定的理論基礎(chǔ)，而HRG是否能夠降低人肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力，仍然是需要進(jìn)一步探討的問題。

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（收稿：2014-06-06）

（校對：陳從新）

Overexpression of histidine-rich glycoprotein plasmids inhibits cell proliferation of MHCC-97H cells in vitro

Hu Xiaoyun，Chen Jinzhang，Liao Yujing，et al.Department of Infectious Diseases and Hepatology Unit，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong Province，China

ObjectiveTo investigate the expression of histidine-rich glycoprotein（HRG）in hepatocellular carcinoma（HCC）and its impact on HCC cell proliferation.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of HRG in 8 HCC specimens and Western blot to evaluate the expression of HRG in 11 surgical cancerous and its non-cancerous specimens.The cell proliferation was analyzed by flow cytometry after stable overexpression of HRG in MHCC-97H cells.ResultsDeclined expression of HRG was found in all 8 cancerous tissues as compared to the non-tumor tissues；Similar results were obtained in 11 pairs of HCC and its paracarcinoma tissues；The relative expression of HRG/β-actin was（1.39±2.08）in para-carcinoma tissues，and（0.14± 0.17）in tumor tissue，with a significant difference between them（P＜0.05）；The cell proliferation of MHCC-97H cells overexpressing HRG was remarkably inhibited as compared with the mock cells[（1.72±1.19）%vs.（14.3± 2.99）%，P＜0.01].ConclusionHRG is down-regulated in HCC and HRG overexpression can inhibit HCC cell proliferation in vitro.

Hepatocellular carcinoma；Histidine-rich glycoprotein；Cell proliferation；In vitro

510515廣州市南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院感染病科肝臟腫瘤中心(胡曉云，廖毓菁，黃靜，郭亞兵)；腫瘤內(nèi)科（陳錦章）

胡曉云，女，26歲，碩士研究生。主要從事肝癌基礎(chǔ)研究。E-mail：huxiaoyun143@163.com

郭亞兵，E-mail：gyabing@126.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.06.018