趙錦航，趙錦芝,李能麗,葛艷珊,釧愛祝,楊光莉,楊云慧

(云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,云南昆明650092)

0 引言

癌胚抗原（CEA）是1956年Gold 和Freedman首先從胎兒及結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤相關(guān)抗原,為分子量為180-200KD 的多糖蛋白復(fù)合物。主要存在于直腸，結(jié)腸癌組織和胚胎腸粘膜上。這種抗原也存在于2～6個月胚胎的胃腸、肝臟和胰腺組織中，故名癌胚抗原，也稱胚胎抗原(EA)或胎兒抗原（FA），可以在多種液體中檢出[1]。CEA 作為一種最常見的腫瘤標(biāo)記物，被廣泛用作各種消化系統(tǒng)腫瘤的診斷及檢測指標(biāo)，CEA 的測量對治療效果的觀察同樣有著不可忽略的作用，在臨床中對于腫瘤疾病的診斷、治療效果的判斷和預(yù)后情況都有非常重要的臨床意義[2～3]。

CEA 的檢測方法有酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、放射免疫分析法等，這些方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，但檢測過程需要耗費(fèi)較長的時間，樣品消耗量也比較大，并且需要昂貴的專用儀器，對檢測員的技術(shù)水平要求較高[4]。因此，迫切需要尋找一種價廉又便捷的免疫測定方法[5]。電化學(xué)免疫傳感器將免疫分析技術(shù)與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，在臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境和食品工業(yè)等方面都有重要應(yīng)用，并以其體積小、專一度強(qiáng)、靈敏度高、檢測快速方便、成本低和容易實現(xiàn)實時、在線、活體檢測等優(yōu)點，成為當(dāng)前研究的熱點之一[6]?？乖涂贵w在敏感膜上的結(jié)合和繼后的反應(yīng)引起電流發(fā)生改變，而且這種變化與待測抗原的濃度之間存在線性關(guān)系，因此可以實現(xiàn)對抗原濃度的檢測[7]。其中將抗原或抗體，固定到換能器表面稱為生物功能物質(zhì)的固定化，固定化技術(shù)是免疫傳感器的研究和開發(fā)中最為重要和關(guān)鍵的工作[8]。但由于一般常用固定材料固載抗原或抗體的量較少，從而影響免疫傳感器的靈敏度[9]。因此，開發(fā)新型納米材料，研制高靈敏免疫傳感器及建立快速的檢測癌胚抗原的方法具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值[10]。

該文將中空囊狀銀鈀鉑合金修飾電極表面，用于固定癌胚抗原抗體，構(gòu)建無標(biāo)記型癌胚抗原免疫傳感器。由于中空結(jié)構(gòu)比普通的納米材料具有更高的比表面積和反應(yīng)活性位點，大大增加導(dǎo)電能力、催化性能、吸附能力[13～14]。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

CHI660D 電化學(xué)工作站（中國上海辰華儀器有限公司），使用三電極體系，其中自制修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極；SK2200HP 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限司）；CS501型超級恒溫器（中華人民共和國重慶實驗設(shè)備廠）；FA1204B 電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；1KAMS3BASIC混旋儀；HJ-3 恒溫磁力攪拌器。

癌胚抗原定量檢測試劑盒（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）；人絨毛膜促性腺激素試劑盒（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）；甲胎蛋白測定診斷試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）。

聚乙烯吡咯烷酮 （K-30）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、殼聚糖、牛血清白蛋白（BSA）購于美國sigma 公司；鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、尿素購于天津市大茂化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、乙二醇購于成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；HNO3(1 ∶1)購于成都化學(xué)試劑廠；AgNO3、PdCl2、乙酰丙酮鉑購于昆明鉑銳金屬材料有限公司；醋酸、甘氨酸、丙氨酸購于中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司。試驗中所用的以上試劑均為分析純，所用的水均為二次蒸餾水。

1.2 銀鈀鉑合金的合成

取40 mL 乙二醇攪拌加熱至150℃，通N2在三頸燒瓶回流活化1 h，再加90 mg AgNO3,反應(yīng)1 h,再加60 mg PdCl2、130 mg 乙酰丙酮鉑，通N2攪拌反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，產(chǎn)物用乙醇、水各洗三次，最后分散到二次蒸餾水中。

1.3 癌胚抗原免疫傳感器的制備

1.3.1 電極預(yù)處理

將玻碳電極用金相砂紙打磨后，依次再用粒徑為0.3、0.1 和0.05 μm 的Al2O3粉在麂皮上打磨，然后依次用HNO3(1∶1)、無水乙醇和蒸餾水超聲清洗10 min。將電極取出用蒸餾水沖洗后置于室溫下晾干。

液硫脫氣效果達(dá)標(biāo)后，聯(lián)合裝置硫磺回收單元涉及液硫脫氣的設(shè)備如硫磺冷卻器(E-309)、液硫輸送管線等腐蝕現(xiàn)象大大減緩，腐蝕泄漏事件的發(fā)生率明顯降低，聯(lián)合裝置連續(xù)運(yùn)行周期增長，為裝置的平穩(wěn)運(yùn)行提供了有效保障[8]。

1.3.2 癌胚抗原免疫傳感器的制備

取4 μL 制備好的銀鈀鉑合金溶液、4 μL 0.5%殼聚糖溶液和4 μL 120 μg/mL 癌胚抗原抗體，混合均勻后，移取10 μL 混合液滴在處理好的玻碳電極表面，過夜。

用PBS 緩沖液溶液清洗，晾干后取10 μL 1%的BSA溶液滴在電極上在37℃恒溫培育1 h以封閉非特異性結(jié)合位點。然后用PBS 緩沖液清洗，制得癌胚抗原免疫傳感器。電極不用時，置于冰箱中4℃保存。

1.4 實驗原理及流程

以K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6為氧化還原探針，當(dāng)癌胚抗原與抗體沒有結(jié)合時，K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6探針響應(yīng)電流較大，當(dāng)癌胚抗原與抗體結(jié)合時，覆蓋了銀鈀鉑合金的催化活性位點并增加的電化學(xué)探針的傳質(zhì)阻力，引起K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6探針電流響應(yīng)的減小，通過測量培育不同CEA濃度時電極電流的變化情況，從而實現(xiàn)對CEA含量的測定。實驗原理圖見圖1。

圖1 傳感器的制備實驗原理圖Fig.1 Schematic diagram of the immunesensor

1.5 實驗方法

制備好的癌胚抗原免疫傳感器用PBS 緩沖溶液清洗后，晾干，取10 μL 不同濃度的CEA 滴加在傳感器界面上，于37℃下培育30 min。

該實驗在-0.1～0.5 V 電位范圍內(nèi)采用差示脈沖伏安法(DPV)，在含有5 mmol/L 鐵氰化鉀（0.01 mol/L PBS）的底液中，掃描速度4 mV/s，振幅50 mV,脈沖時間0.2 s,取樣間隔0.016 7 s，脈沖周期0.5 s。對癌胚抗原與抗體結(jié)合時引起K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6探針電流的變化進(jìn)行測定。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 中空囊狀銀鈀鉑合金納米顆粒的微觀形貌

用高倍透射電鏡觀察了中空囊狀銀鈀鉑合金顆粒的微觀形貌特征。由圖2可知中空囊狀銀鈀鉑合金顆粒的平均粒徑約為100 nm，粒子成中空囊狀，表明成功制備了中空囊狀銀鈀鉑合金納米顆粒。

圖2 中空囊狀銀鈀鉑合金顆粒的TEM 圖Fig.2 TEM image of saccate AgPdPt alloy

2.2 氧化還原峰電流與掃描速度的關(guān)系

改變不同的掃描速度，考查了電極在5 mmol/L 鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安行為，結(jié)果見圖3a (從內(nèi)至外掃描速度分別為20、40、60、80、100、120 mV/s)。從圖3b 中可以看出氧化還原峰電流與掃描速度的平方根成正比，說明電流受擴(kuò)散控制。

2.3 銀鈀鉑合金的催化作用

為考察銀鈀鉑合金的催化效應(yīng)，實驗比較了有無銀鈀鉑合金時，傳感器在鐵氰化鉀溶液中的響應(yīng)情況。

圖3 掃描速率對氧化還原電流的影響Fig.3 The relationship between the redox peak current and scanning rate

圖4為不同修飾電極測定鐵氰化鉀的DPV曲線，其中a為殼聚糖/銀鈀鉑合金修飾電極對鐵氰化鉀的響應(yīng)曲線，曲線b為空玻碳電極（GCE）對鐵氰化鉀的響應(yīng)，從圖中可以看出銀鈀鉑合金納米顆粒對鐵氰化鉀具有優(yōu)異的催化性能，能夠有效地放大響應(yīng)信號。

圖4 不同修飾電極在5 mmol/L 鐵氰化鉀底液中的DPV 曲線a為殼聚糖銀鈀鉑合金修飾電極；b為空玻碳電極Fig.4 The DPV voltammograms of different electrodes at potassium ferricyanide solution(5 mmol/L).a.AgPdPt/chit/GCE;b.Bare GCE

2.4 實驗條件優(yōu)化

2.4.1 培育時間的選擇

抗原-抗體免疫結(jié)合的程度與時間有關(guān)，考察了37℃條件下抗原培育時間對電極響應(yīng)電流的影響，實驗發(fā)現(xiàn),培育30 min時,抗原-抗體反應(yīng)已達(dá)平衡(如圖5)，從圖中可以看出30 min 及以后出現(xiàn)近似平臺。因此選擇30 min 作為培育時間。

圖5 不同CEA 培育時間對電極的影響Fig.5 The effect of incubation time on the response current of immunosensor

2.4.2 固定抗體濃度的優(yōu)化

固定抗體的量對電極的靈敏度和檢測范圍有很大影響，因此該文對抗體濃度進(jìn)行了優(yōu)化。濃度優(yōu)化范圍為12 μg/mL～600 μg/mL。從圖6中可以看出120 μg/mL時電極的響應(yīng)斜率最大，靈敏度最高。因此實驗選取120 μg/mL 作為固定抗體的濃度。

2.5 癌胚抗原免疫傳感器的響應(yīng)性能

圖7為在最優(yōu)條件下癌胚抗原免疫傳感器在不同濃度的CEA溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選取的最優(yōu)條件下，氧化峰電流與CEA 濃度在0.5 ng/mL～80 ng/mL 之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為I(μA)=-0.271 1(log c)+1.778 8,相關(guān)系數(shù)為0.989 0，檢測下限為0.17 ng/mL。

2.6 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

考察了該電化學(xué)傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。用同一根電極對同一濃度連續(xù)測定3次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%，說明重現(xiàn)性良好。循環(huán)掃描CV 100 圈以后，還原峰電流達(dá)到初始的94.25%，說明穩(wěn)定性良好。

圖6 抗體濃度對響應(yīng)曲線線性斜率的影響Fig.6 The effect of antibody concentration on the linear slope

圖7 癌胚抗原免疫傳感器的校正曲線Fig.7 The calibration curve of the immunosensor to CEA

2.7 傳感器的選擇性

為了考察傳感器的選擇性，在所選擇的優(yōu)化條件下，在含有40 ng/mL 的CEA溶液中，分別加入了牛血清蛋白、丙氨酸、人絨毛促性腺激素（HCG），共3 種干擾物質(zhì)進(jìn)行干擾試驗。測得的氧化峰電流I干擾+CEA與沒有干擾物時測得的氧化峰電流ICEA的比值見表1，由表1可看出此傳感器具有良好的抗干擾能力。

表1 傳感器的抗干擾測試Tab.1 Possible interference tested with the immunosensor

2.8 回收率

為了考察傳感器的實用性，用其測定了在稀釋的人血清中CEA 的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2?；厥章试?9.37%～105.45%之間。說明該傳感器可用于CEA 的檢測。

表2 傳感器的回收率Tab.2 The recovery of immunosensor

3 小結(jié)

該實驗利用中空囊狀銀鈀鉑合金修飾電極構(gòu)建一種新型的無標(biāo)記CEA 免疫傳感器，通過優(yōu)化條件，提高了CEA 傳感器的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性，使傳感器具有更寬的線性范圍，較低的檢測下限，為CEA 的檢測提供了一個較好的方法。

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