鄭翠玲，向 華，黃 元，陳 晶，王曉虎，宣 華

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州510640；2.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 唐山064003）

貓杯狀病毒（Feline Calicivirus，F(xiàn)CV）是貓科動(dòng)物的一種高度傳染性病原，能引起貓的口腔或上呼吸道感染，有的毒株還能導(dǎo)致跛行。高玉偉[1]等從我國(guó)野生動(dòng)物中分離到貓杯狀病毒（FCV），這表明貓杯狀病毒對(duì)野生珍稀動(dòng)物的健康造成了極大的威脅。

FCV屬于杯狀病毒科（Caliciviridae）杯狀病毒屬（Calicivirus）。盡管此類(lèi)病毒早已發(fā)現(xiàn)，但由于缺乏相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，導(dǎo)致對(duì)其分子生物學(xué)特性的研究進(jìn)展緩慢。貓杯狀病毒是杯狀病毒科中惟一可在體外成功培養(yǎng)的病毒[2]。隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多正鏈RNA病毒的研究取得重大進(jìn)展[3]。本研究旨在建立FCV感染性克隆，構(gòu)建嵌合載體，進(jìn)而研究其他杯狀病毒生物學(xué)特性和致病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞、質(zhì)粒及菌種 FCV病毒液和質(zhì)粒PFCV＋T由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存；La Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶AMVRT、限制性?xún)?nèi)切酶Sma I、Sph I Mlu I、DNA凝膠回收試劑盒均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；LipofectamineTM2 000 Reagent、LSTRIZol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；高純度質(zhì)粒提取純化試劑盒為T(mén)IANGEN公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)用MEM、新生小牛血清均為GIBOCOBRL公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì) 參照已經(jīng)獲得的FCV CH-GD株全基因組序列[4]，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增FCV全基因的2對(duì)引物，在其中1對(duì)引物中引入Sma I，Sph I酶切位點(diǎn)和T7啟動(dòng)子核心序列，在另1對(duì)引物中引入一個(gè)突變位點(diǎn)，形成一個(gè)新的酶切位點(diǎn)Mlu I，兩對(duì)引物序列如下：

P1：5′-CAGCCCGGGTAATACGACTCACTATAG TAAAAGAAATTTGAGACAATG-3′；P2：5′-GGAACGCGTGTCTATATGCAAGC-3；P3：5-GGAACGCGTGTCTATATGCAAGC-3′；P4：5′CTGCATGCTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCTGGGGTTAGGCGC-3′。引物由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 用已經(jīng)獲得的質(zhì)粒PFCV＋T為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。FCV長(zhǎng)片段P5.2的擴(kuò)增：反應(yīng)總體積為50μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5min，變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃5 min 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，最后72℃延伸10min。FCV短片段P2.6的擴(kuò)增：反應(yīng)總體積為50μL。預(yù)變性94℃30 s，退火57℃30 s，延伸72℃5min 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，最后72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.4 重組PCR 以PCR產(chǎn)物P5.2和P2.6混合液為模板，P1和P4為上下游引物，用重組PCR方法擴(kuò)增FCV的全基因組。反應(yīng)總體積為50μL。預(yù)變性95℃7min，變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃8min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，最后72℃延伸10min。重組PCR產(chǎn)物用酶切鑒定，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察酶切結(jié)果。

1.5 連接、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的鑒定 將鑒定正確的重組PCR產(chǎn)物與pMD20-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，并進(jìn)行陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的鑒定。陽(yáng)性質(zhì)粒命名為P′FCV＋T，其菌液送Invitrogen公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.6 體外轉(zhuǎn)錄 用Sma I酶將全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒P′FCV＋T切開(kāi)使其線(xiàn)性化，用RibomaxTM體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。1組加Ribom7G Cap Analog，2組不加Ribom7GCap Analog。

1.7 體外轉(zhuǎn)染 用1μg的RNA和10μL脂質(zhì)體混合，分別加100μL Opti-MEMI細(xì)胞培養(yǎng)液，孵育30min，用800μLOpti-MEMI稀釋后加到事先準(zhǔn)備好的F81細(xì)胞上。37℃作用5 h，吸棄轉(zhuǎn)染液，加入含10%FCSMEM培養(yǎng)液（不含抗生素）。在37℃，5%CO2下培養(yǎng)24～48 h，觀(guān)察具有FCV致病特點(diǎn)的細(xì)胞病變（CPE）。同時(shí)作陰性、陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照設(shè)兩個(gè)：1個(gè)為正常培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)照，1個(gè)為不加帽狀物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細(xì)胞對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照病毒按100 TCID50接毒。觀(guān)察結(jié)果。

1.8 FCV感染性克隆的鑒定 將轉(zhuǎn)染后獲得的病毒液接種新的F81細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞100%出現(xiàn)病變時(shí)，收毒，再用獲得的病毒液接種新的F81細(xì)胞，如此連續(xù)傳5代。從最后一次收集的病毒液中提取病毒RNA。進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)。PCR產(chǎn)物用Mlu I酶切鑒定。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果 以質(zhì)粒PFCV＋T為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到2.6 kb和5.2 kb兩個(gè)片段，大小與預(yù)期相符。

2.2 重組PCR及酶切鑒定 用重組PCR方法擴(kuò)增FCV的全基因組。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得7.6 kb的目的條帶。用Mlu I酶酶切鑒定7.6 kb的條帶，1%瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)2.6 kb和5.2 kb的兩條帶，與預(yù)期相符。

2.3 質(zhì)粒的酶切鑒定 經(jīng)重組PCR擴(kuò)增獲得的FCV全基因片段與pMD20-T載體連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，提取重組質(zhì)粒，用Sma I單酶切鑒定質(zhì)粒。將獲得的正向連接質(zhì)粒命名為P′FCV＋T。用Mlu I酶單酶切鑒定質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果與預(yù)期值相符，得到一條10.3 kb的目的條帶。

2.4 體外轉(zhuǎn)錄 用RibomaxTM體外轉(zhuǎn)錄試劑盒Promega對(duì)線(xiàn)性化的質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用RNase-Free DNase去除冗余的DNA，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，RNA濃度為0.5μg/mL，轉(zhuǎn)錄成功。

2.5 體外轉(zhuǎn)染 將體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞。5′端加帽狀結(jié)構(gòu)的RNA所轉(zhuǎn)染的F81細(xì)胞48 h后出現(xiàn)典型的FCV感染病變，而5′端不加帽狀結(jié)構(gòu)的RNA所轉(zhuǎn)染的F81細(xì)胞則無(wú)病變發(fā)生（圖2、3、4、5）。

2.6 感染性克隆的鑒定 為確定病毒來(lái)源于全長(zhǎng)cDNA克隆，在5 121位引入一個(gè)突變，由此產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)Mlu I，構(gòu)建含有突變點(diǎn)的全長(zhǎng)cDNA克隆，基因序列測(cè)誘導(dǎo)突變成功。

3 討論

圖1 PCR及酶切鑒定

圖2 陰性對(duì)照：正常F81細(xì)胞（200×）

圖3 陰性對(duì)照：不加帽狀結(jié)構(gòu)（100×）

圖4（A，B）陽(yáng)性對(duì)照F81細(xì)胞（A：200×；B：400×）

圖5 轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞出現(xiàn)病變（A：400×；B：400×）

3.1 關(guān)于感染性克隆的構(gòu)建 本研究的目的是構(gòu)建FCV的感染性克隆載體。FCV是目前除豬水皰疹病毒（自1959年美國(guó)最后一次發(fā)生以來(lái)，除在海洋哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)中仍有這種病毒存在外，就再未發(fā)現(xiàn)過(guò)這種病毒，國(guó)內(nèi)也未見(jiàn)報(bào)道）外，惟一可在細(xì)胞培養(yǎng)上增殖的杯狀病毒。因此構(gòu)建FCV感染性克隆對(duì)杯狀病毒的研究有十分重要的意義。Kyeong-OK Chang[5]成功恢復(fù)了具有感染性的豬的杯狀病毒。Jorg Oliver Thumfart[6]等采用體外轉(zhuǎn)錄的方法和構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒的方法，成功恢復(fù)了FCV病毒粒子。但國(guó)內(nèi)對(duì)此報(bào)道甚少。

鑒于FCV基因組比較長(zhǎng)，基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此在試驗(yàn)中采用先分段擴(kuò)增，再用重組PCR法擴(kuò)增全長(zhǎng)的策略。重組PCR技術(shù)的使用成功解決了用分段擴(kuò)增的各片段因無(wú)合適的酶切位點(diǎn)而無(wú)法用DNA聚合酶將其連接起來(lái)的難題。新引物序列上游序列中加入了單一的核酸內(nèi)切酶Sma I酶切位點(diǎn)和T7啟動(dòng)子的核心序列，下游引物序列中加入了核酸內(nèi)切酶Sph I的酶切位點(diǎn)。引物中引入的單一的核酸內(nèi)切酶，使FCV cDNA克隆能方便的進(jìn)行線(xiàn)性化，進(jìn)而進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染。T7啟動(dòng)子的引入保證了轉(zhuǎn)錄的正確起始。本研究構(gòu)建了FCV的感染性克隆，并對(duì)其病毒滴度進(jìn)行了測(cè)定，其致細(xì)胞出現(xiàn)病變的時(shí)間及病毒滴度與野生型FCV相比無(wú)差異。這說(shuō)明FCV感染性克隆構(gòu)建成功，為下一步研究其生物學(xué)特性、毒力因子、致病機(jī)理以及嵌合載體的構(gòu)建打下了基礎(chǔ)。

3.2 關(guān)于VPg蛋白 杯狀病毒基因組5′端無(wú)帽狀結(jié)構(gòu)，而是與小RNA病毒一樣具有VPg蛋白。但與小RNA病毒不同的是杯狀病毒的VPg為感染所必需。因而從FCV全長(zhǎng)cDNA克隆體外轉(zhuǎn)錄的病毒RNA是否需要VPg樣結(jié)構(gòu)才具有感染性是一個(gè)非常關(guān)鍵的問(wèn)題。本研究中將5′端加帽狀物組與5′端不加帽狀物組同時(shí)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染，結(jié)果5′端加帽狀物組在轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞48 h后出現(xiàn)典型的FCV感染病變，而未加帽狀物組則無(wú)病變出現(xiàn)。這表明5′端帽狀結(jié)構(gòu)可以代替VPg起作用。體外轉(zhuǎn)錄的FCV RNA加5′端帽狀結(jié)構(gòu)就具有感染性，而不加此結(jié)構(gòu)就不具有感染性。

[1]高玉偉，夏咸柱，扈榮良.獵豹與虎貓杯狀病毒的分離及其超變區(qū)基因比較研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（3）：179-182.

[2] 殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997：519-531

[3]祁國(guó)財(cái)，李平花，劉在新.反向遺傳學(xué)技術(shù)在新型疫苗研制中的應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34（10）：841-844.

[4]鄭翠玲，向華，宣華，等.貓杯狀病毒全基因組的克隆及序列分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010（3）：109-111.

[5] Kyeong-OK Chang，Stanislav S.Sosnovtsev，et al.Reverse genetic system for porcine enteric calicivirus，a prototype sapovirus in the caliciviridae[J].Journal of virology，2005，79（3）：1049-1416.

[6]Jorg Oliver Thumfart，Gregor Meyers.Feline calicivirus：recovery of wild-type and recombinant viruses after transfection of cRNA orcDNA constructs[J].Journal of virology，2002，76（12）：6398-6407.