張會瓊，孫 思，張姣姣，王 怡，王鮮忠，張家驊

（西南大學動物科技學院重慶市牧草與草食家畜重點實驗室，重慶 北碚400716）

睪丸支持細胞的增殖能力是決定雄性動物生精能力的重要因素，促卵泡素（FSH）是調(diào)節(jié)睪丸支持細胞增殖最重要的激素。Walker 等[1]和我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，在睪丸支持細胞中，F(xiàn)SH 與受體結合后，能通過激活cAMP-PKA、Ca2+、ERK 等多條信號通路調(diào)節(jié)支持細胞的增殖，但具體影響哪些基因的表達還不清楚。細胞中的細胞周期素A（Cyclin A）控制著細胞DNA 合成的起始，其表達量的變化對于細胞周期的進程有著十分重要的影響[2]，Cyclin A2 主要表達于各類體細胞[3]，是細胞周期素依賴的蛋白激酶1（Cyclin-dependent kinases，Cdk1）及Cdk2 的調(diào)節(jié)亞基，啟動并控制著DNA 的復制[4]。FSH 是否可以通過影響CyclinA2 的表達進而影響睪丸支持細胞的增殖仍不清楚。本試驗利用體外培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細胞，研究FSH 是否通過cAMP、Ca2+內(nèi)流和ERK1/2調(diào)節(jié)CyclinA2表達的機制，為進一步認識FSH調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)仔豬睪丸支持細胞增殖的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實驗材料 DMEM／F-12 Hams、胎牛血清和VI 型膠原酶（Gibco 公司）；胰蛋白酶、FSH、Foskolin、U0126 和RP-cAMP（Sigma 公司）；Ca2+通道抑制劑Verapamil（ALEXIS），熒光定量PCR 試劑及SYBR GreenⅠ（Invitrogen）；RNApreP pure cell 總RNA提取kit 和TIANScript RT Kit（TIANGEN BIOTECH）；其余均為國產(chǎn)分析純，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。仔豬睪丸采自重慶本地2～3 周齡長白仔豬。

1.2 細胞培養(yǎng) 仔豬睪丸支持細胞的分離培養(yǎng)方法按我們前期建立的方法進行[5-6]。

1.3 不同濃度的FSH 對CyclinA2 mRNA 表達的影響 細胞培養(yǎng)至48 h 左右用不同濃度的FSH（0-100 ng/L）處理30 min，收集細胞提取RNA，檢測CyclinA2 mRNA 的豐度。

1.4 FSH 作用不同時間對CyclinA2 mRNA 表達的影響 細胞培養(yǎng)至48 h 左右用FSH（50 ng/mL）處理0，5，30，60，90 min，收集細胞提取RNA，檢測CyclinA2 mRNA 的豐度。

1.5 cAMP、Ca2+對FSH 誘導CyclinA2 mRNA 的豐度表達的影響 細胞培養(yǎng)至48 h 左右，用FSH（50 ng/mL）、Foskolin（10 μmol/L），RP-cAMP（10 μmol/L）或Ca2+通道抑制劑Verapamil（0.05 mg/mL）處理30 min，RP-cAMP 或Verapamil 在FSH 處理前2 h 加入，收集細胞提取RNA，檢測CyclinA2 mRNA 的豐度。

1.6 ERK1/2 對FSH 誘 導CyclinA2 mRNA 表達的影響 細胞培養(yǎng)至48 h左右，用FSH（50 ng/mL）、U0126（10 μmol/L）、FSH+U0126 處理30 min，并作空白對照，U0126 在FSH 處理前2 h 加入，收集細胞提取RNA，檢測CyclinA2 mRNA 的豐度。

1.7 熒光定量PCR 將收集的細胞用RNApreP pure cell 總RNA 提取kit 進行總RNA 提取，并通過電泳進行RNA 純度鑒定。用TIANScript RT Kit 進行逆轉錄反應，18S rRNA作為內(nèi)參照進行實時熒光定量PCR分析，每個樣品設3 個重復，具體方法按試劑盒的說明書進行。引物信息如表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計分析 每組數(shù)據(jù)設3 個重復，結果以X±SE表示，用SPSS 16.0 One way ANOVA 和Tukey′s post hoc test 進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 確定為差異顯著，圖中不同的字母表示差異顯著。

2 結果

2.1 不同濃度的FSH對CyclinA2 mRNA 表達的影響

從圖1 可以看出，在0-50 ng/mL 內(nèi)，隨著FSH 濃度的增加，CyclinA2 mRNA 的表達明顯增強（P＜0.05）；當FSH濃度為50 ng/mL，CyclinA2 mRNA的表達量與對照相比增加了8.58 倍，但是當FSH濃度增加到100 ng/mg 時，CyclinA2 mRNA 的表達量與加入FSH 前相比只增加了8.38 倍（P＜0.05）。

圖1 不同濃度的FS H 對C yclinA 2mR NA 表達的影響

2.2 FSH 作用不同時間對CyclinA2 mRNA 的影響

從圖2 可以看出，作用15 min 后，CyclinA2 的表達量增加了4.86 倍（P＜0.05）；30 min 時與對照相比，CyclinA2 的表達量增加了9.03 倍（P＜0.05）；此后CyclinA2 的表達量有所下降，到90 min 時，CyclinA2的表達量僅為對照的4.38 倍（P＜0.05）。

圖2 FS H 作用不同時間對C yclinA 2mR NA 的影響

2.3 cAMP、Ca2+在FSH 誘導支持細胞表達CyclinA2 mRNA中的作用 從圖3 可以看出，F(xiàn)orskolin 顯著促進了CyclinA2的表達，與對照相比增加了8.87倍（P＜0.05），但與單獨的FSH作用無顯著差異（P＞0.05）。Rp-cAMP、Verapamil 降低了FSH 誘導的支持細胞的CyclinA2 mRNA 的表達，與僅加入FSH 相比分別降低了27.97%、32.90%（P＜0.05），同時加入Rp-cAMP、Verapamil 抑制作用明顯增強，CyclinA2 mRNA 的表達量與僅加入FSH 相比下降了61.26%（P＜0.05），單獨添加Rp-cAMP、Verapamil 對CyclinA2 mRNA 的表達無明顯影響（P＞0.05）。

2.4 ERK1/2 在FSH 誘導CyclinA2 mRNA 表達中的作用 從圖4 可以看出，單獨添加ERK1/2 的抑制劑U0126 與空白相比對CyclinA2 的表達無顯著差異（P＞0.05），當U0126 與FSH 共同作用時顯著抑制FSH 誘導的CyclinA2 的表達，與僅有FSH 作用時相比降低了45.09%（P＜0.05）。

圖3 cA M P、C a2+在FS H 誘導支持細胞表達C yclinA 2mR NA 中的作用

圖4 ER K 1/2在FS H 誘導支持細胞表達C yclinA 2mR NA 中的作用

3 討論與結論

體內(nèi)試驗表明，F(xiàn)SH 能夠促進仔豬睪丸支持細胞的增殖[7-8]。本試驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH 以劑量和時間依賴的方式促進睪丸支持細胞CyclinA2 mRNA 的表達，并且在50 ng/mL、作用30 min 時到達高峰；隨著FSH濃度和作用時間進一步增加，其表達量反而呈下降趨勢，這可能與FSH 在不同濃度和時間的條件下激活cAMP-ERK1/2 等信號通路，而ERK1/2 在細胞周期中的活性具有一定的周期性有關[6-9]，這與FSH 能通過激活cAMP-PKA、Ca2+、ERK 等多條信號通路促進支持細胞的分裂增殖相一致[9]。

本試驗中添加cAMP促進劑Forskolin（10 μmol/L）使CyclinA2 mRNA的表達量增加，而加入cAMP 的抑制劑Rp-cAMP 則使CyclinA2 mRNA 的相對表達量下降，這表明FSH 通過影響細胞中cAMP 的水平，進而誘導了CyclinA2 的表達，這與我們前期的研究結果顯示細胞內(nèi)一定濃度的cAMP 能調(diào)節(jié)Rb 的磷酸化，進而影響細胞的增殖有關相一致[9]。

Ca2+內(nèi)流在FSH 調(diào)節(jié)睪丸支持細胞功能中發(fā)揮了重要作用[9]。本試驗中，在FSH 處理細胞前加入Ca2+通道抑制劑Verapamil 后，CyclinA2 mRNA 的表達量降低，這表明Ca2+可能參與了FSH 調(diào)節(jié)CyclinA2 mRNA 的表達過程。而同時添加Rp-cAMP 和Verapamil 后，CyclinA2 的表達量降低得更明顯，表明cAMP-PKA途徑和Ca2+通道途徑對FSH調(diào)節(jié)CyclinA2 mRNA 表達可能具有協(xié)同作用，這與我們前期試驗發(fā)現(xiàn)Rp-cAMP 和Verapamil 在ERK1/2 的激活和細胞增殖方面具有一定協(xié)同效應的結果相一致[9]。

試驗結果還發(fā)現(xiàn)，ERK1/2 的抑制劑U0126 顯著抑制了FSH 誘導CyclinA2 的表達，這表明ERK1/2 途徑也參與了FSH誘導CyclinA2 的表達。這可能是因為FSH能夠引起ERK1/2的磷酸化，而加入U0126后，阻斷了ERK1/2的活性，進而抑制Rb的磷酸化所致。我們前期的研究也表明，在仔豬睪丸支持細胞中，F(xiàn)SH主要通過MEK-ERK-RSK級聯(lián)的途徑激活ERK1/2，而且ERK1/2參與了細胞增殖的調(diào)節(jié)[9]。因此，F(xiàn)SH能夠誘導支持細胞產(chǎn)生較低水平的cAMP,cAMP 可以激活細胞內(nèi)的ERK1/2，活化的ERK1/2 可能影響Rb 磷酸化和后續(xù)翻譯水平，從而促進了CyclinA2 mRNA 的表達。

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