舒 蕾，張曼麗，劉 杰，潘海波，劉 丹，張 勇，顏其貴，3

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術中心，四川 雅安625014；2.重慶太極藥用動植物資源開發(fā)有限公司，重慶涪陵408000；3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安625014）

大腸埃希菌也稱大腸桿菌，在畜牧生產(chǎn)中常引發(fā)豬大腸桿菌病，大腸桿菌病也是人畜共患的腸道細菌性傳染病，主要有仔豬黃痢、仔豬白痢及仔豬水腫等在規(guī)?；i場中發(fā)病率和死亡率均較高，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。因大腸埃希菌的血清型眾多，變異較大，濫用抗生素易誘發(fā)和傳播耐藥菌的特點[1-2]，使得大腸桿菌病防治十分困難。本試驗隨機采集川渝地區(qū)43個規(guī)模化豬場的仔豬腹瀉性病料，進行血清型鑒定及耐藥性監(jiān)測，旨在掌握各區(qū)域大腸埃希菌的流行血清型和耐藥性發(fā)展現(xiàn)狀，為制定治療方案和防制措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源 2011年11月-2012年5月，在川渝地區(qū)對隨機選擇的43個規(guī)?；i場進行病料采集。

1.1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、細菌生化鑒定管和藥敏紙片，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；MH培養(yǎng)基，購自英國OXOID公司；50種大腸埃希菌屬診斷血清，購自天津生物芯片技術有限責任公司；藥敏質(zhì)控菌株標準株ATCC 25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；其他試劑實驗室制備。

1.1.3 試驗儀器 儀器均為常規(guī)設備。

1.2 試驗方法

1.2.1病料采集 調(diào)查走訪川渝18個地區(qū)的43個規(guī)?；i場，根據(jù)流行病學調(diào)查后采集仔豬腹瀉發(fā)病豬的新鮮糞便合計300份，具體采集、保存方法參照文獻[3]進行。

1.2.2 細菌分離純化 取病料于麥康凱平板上劃線接種，37℃，培養(yǎng)18 h，挑取單個粉紅色菌落接種于伊紅美藍平板純化，37℃，培養(yǎng)18 h，挑取有紫黑色帶金屬光澤的單個菌落進行染色鏡檢，將符合大腸埃希菌鏡檢特征的接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃搖床擴大純培養(yǎng)。

1.2.3 生化鑒定 取純化后新鮮菌液分別接種TSI和細菌生化鑒定管，方法及判定結果參考文獻[4]進行。

1.2.4 血清型鑒定 將鑒定為大腸埃希菌的菌株進行玻片凝集試驗，方法及判定結果參照血清診斷試劑盒說明書進行。

1.2.5 耐藥性監(jiān)測 對鑒定為大腸埃希菌的菌株進行藥敏試驗，藥敏質(zhì)控參照標準株ATCC 25922進行，試驗采用美國臨床實驗室標準委員會CLSI[5]推薦的K-B法進行，結果判定依據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準進行。

2 結果

2.1 細菌的分離鑒定 280份病料中分離出273株大腸埃希菌，分離率為97.5%，273株大腸埃希菌的TSI及生化試驗結果均符合腸桿菌科細菌生化鑒定特征，即TSI出現(xiàn)斜面底層變黃、有氣體；生化鑒定分離菌可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、木糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，少數(shù)能發(fā)酵蔗糖，M.R試驗、吲哚試驗為陽性，尿素酶、枸櫞酸鹽、檸檬酸鹽、V-P試驗為陰性。

2.2 血清型鑒定 273株菌株中有205株定型，定型比例為75.09%。血清定型分別屬于：O1、O2、O6、O7、O8、O9、O11、O15、O18、O20等43個不同血清型，其中O138檢出率最高，為12.2%，其次是O20（6.83%）、O8（6.34%）、O60（5.85%）、O141（5.85%），共占定型比例為75.09%。

2.3 藥敏試驗

2.3.1 藥敏結果 16種臨床常用抗菌藥物中抑菌作用最強的為丁胺卡那霉素、頭孢他啶，敏感菌株分別占53.11%、49.45%，對氨芐西林、磺胺嘧啶、四環(huán)素呈高度耐藥，耐藥率均在80%以上，對其他藥物也表現(xiàn)出不同程度耐藥，結果見表1。

表1 273株大腸埃希菌對14種抗菌藥物的耐藥性

2.3.2 耐藥譜分析 對多重耐藥性分析結果（圖1）表明：試驗菌株對所試14種藥物表現(xiàn)出嚴重的多重耐藥，大部分菌株對5種及以上耐藥，總比例占86.45%，最高達14耐，大部分呈7耐、8耐及12耐，比例為35.53%，273株大腸埃希菌共有142種耐藥譜型。

圖1 大腸埃希氏菌對常用抗菌藥物的多重耐藥譜

3 討論與分析

3.1 仔豬常因飼養(yǎng)管理不良，衛(wèi)生條件差，環(huán)境溫差變化等綜合應激因素引起仔豬抵抗力降低而誘發(fā)腹瀉。所以，針對規(guī)模化豬場應改善飼養(yǎng)管理，減少應激發(fā)生；產(chǎn)前母豬可進行疫苗免疫，通過泌乳使仔豬獲得母源抗體；積極進行藥物敏感性監(jiān)測，選擇有效抗菌藥物預防；加強環(huán)境消毒，防止耐藥菌株的交叉?zhèn)鞑ズ透腥?；選擇使用黃芪多糖等，增強動物機體抵抗力，減少疾病發(fā)生；運用微生態(tài)制劑改善腸道微環(huán)境，避免正常菌群發(fā)生紊亂。

3.2 大腸埃希菌血清型較多是導致臨床采用商品細菌疫苗防疫效果不佳的主要因素之一。國外已有報道過主要流行血清型，如O8，O9，O20，O45、O64，O101，O138，O139，O141，O147，O149和O157等[6]，在本次調(diào)查中273株大腸埃希菌分屬43種血清型，其中O138、O20、O8、O60、O141、O7、O38檢出率較高，共占46.83%（96/205）。本次試驗結果與上海地區(qū)優(yōu)勢血清型（O149、O111和O60）[7]、廣東省優(yōu)勢血清型（O8、O64）[8]、重慶市優(yōu)勢血清型（O101、O8、O20、O64、O45和O149)[9]、四川及廣西地區(qū)優(yōu)勢血清型（O8、O20、O60、O98、O141、O138和O139）[10]相比較得出，同一時期不同地區(qū)、同一地區(qū)不同時期優(yōu)勢血清型也具有較大差異。本次試驗的鑒定結果，有助于掌握本地區(qū)大腸埃希菌血清型流行狀況，為更好防控提供科學依據(jù)。

3.3 對273株大腸埃希菌的耐藥性監(jiān)測結果為：氨芐西林、磺胺嘧啶、四環(huán)素這幾類抗菌藥物存在高耐藥性，耐藥率均超過90%，丁胺卡那霉素及頭孢他啶是較為敏感的藥物，其他藥物存在不同程度的耐藥；這與李金良等[11]報道的西南地區(qū)規(guī)?；i場大腸埃希菌的耐藥性具有一致性，其中慶大霉素(67.77%)、頭孢唑啉（51.65%）、丁胺卡那霉素（30.04%）的耐藥率較田國寶等[10]報道的四川地區(qū)和魏雅靜等[12]報道的西南地區(qū)有明顯的增高；頭孢唑啉的耐藥狀況較孫曉鍇[9]報道的重慶地區(qū)也有明顯的加?。?6.45%的試驗菌株至少對5種藥耐藥，豬源大腸埃希菌呈多重耐藥現(xiàn)象，同等耐藥程度的分離菌有多種耐藥譜型，耐藥譜型在增寬，這同林居純等[13]對我國不同地區(qū)大腸埃希菌有多重耐藥的結論一致。

耐藥性監(jiān)測的結果真實反應了川渝各地域豬場在抗菌藥物的使用上具有一致性，臨床不合理或濫用抗菌藥物有利于耐藥菌的篩選和擴散，給獸醫(yī)工作者帶來巨大考驗。此次對四川和重慶地區(qū)豬源大腸埃希菌的耐藥性監(jiān)測結果為臨床防治大腸桿菌病有著重要的參考意義。

3.4 近年來，“超級細菌”、“速成雞”的出現(xiàn)，是對畜牧行業(yè)的警鐘和巨大考驗。選擇“綠色治療”細菌性疾病是行業(yè)之福、民心所向。中藥為天然植物，具有殘留低、毒副作用小、藥效時間長、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，中獸藥在獸醫(yī)臨床施藥中越發(fā)具有優(yōu)勢，其療效也被公眾所認可，劉玉芹等[15]用板藍根、連翹、敗醬草等及其復方配伍可以有效治療仔豬大腸埃希菌性腹瀉；另外，國內(nèi)外已有利用噬菌體治療大腸桿菌病，并取得較好療效[15-16]。噬菌體作為天然抗菌制劑，可以感染并裂解相應的細菌，具有不良反應小、不易產(chǎn)生抗藥性、無殘留、低成本等優(yōu)點[17]，因而，噬菌體有望成為抗生素的替代品在臨床中得以應用。因此，中獸藥的運用和噬菌體制劑的研發(fā)為大腸埃希菌的耐藥問題打開了另一扇窗。

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