孫虎芝，盧國民，任慧英

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島266109）

奶牛乳房炎是一種奶牛的多發(fā)病和常見病，是由多種致病微生物引起的局部病變，在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，加強(qiáng)對奶牛乳房炎的預(yù)防、診斷和治療顯得尤為重要。據(jù)報(bào)道，引起奶牛乳房炎的致病微生物共有100多種，分為接觸類傳染病原菌和環(huán)境病原菌兩大類[1]。接觸類病原菌包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌等；環(huán)境病原菌主要為大腸桿菌、酵母，以及皰疹病毒和口蹄疫病毒等[2]。細(xì)菌性病原常見金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌；化膿隱秘桿菌是一種小的，多形態(tài)的革蘭陽性的條件致病桿菌[3]，可引起夏季牧場干奶期奶牛的“夏季乳房炎”，而且會在蠅的協(xié)助下發(fā)生“牛-牛傳播”。此外，克雷伯氏菌菌屬、產(chǎn)氣桿菌屬、大腸埃希菌屬等細(xì)菌也可以引起發(fā)病。針對奶牛乳房炎的致病菌如何快速診斷尤為重要，這對及時治療奶牛乳房炎起著關(guān)鍵作用。

由于奶牛乳房炎病原繁多，不同的微生物需要不同診斷方法，因此診斷方法多種多樣。采用傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法需要進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)檢查及生化鑒定，鑒定程序繁瑣且耗時長。PCR診斷技術(shù)快速，但是由于奶牛乳房炎的病原種類多，無法根據(jù)臨床癥狀判斷疑似病原，針對單一病原的PCR診斷方法存在很大的盲目性。

瑞典國家獸醫(yī)研究所研制的鑒別培養(yǎng)基組合平板SELMA及SELMAPLUS，可用于臨床奶牛乳房炎的快速診斷，并可對金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐藥性檢測。本文對SELMA系列平板進(jìn)行介紹。

1 SELMA系列平板

SELMA平板有3個不同的檢測區(qū)域，SELMA PLUS平板有4個不同的檢測區(qū)域。每個區(qū)域含有不同的鑒別培養(yǎng)基，極大地方便了細(xì)菌性奶牛乳房炎的安全快速診斷。相應(yīng)區(qū)域的平板背面進(jìn)行了數(shù)字標(biāo)記。在SELMA平板上，“1”為牛血液瓊脂，含有七葉苷，所有的需氧性細(xì)菌可在此生長；“2”為麥康凱培養(yǎng)基，只有革蘭陰性菌方可生長；“3”為甘露醇鹽瓊脂，葡萄球菌屬及腸球菌屬的細(xì)菌可在此生長。在上面生長的黃色菌落還可以用于檢測葡萄球菌是否產(chǎn)生青霉素酶。在SELMA PLUS平板上，“1”及“2”同SELMA平板，“3”為PGUA瓊脂（PGUA為4-硝基苯吡喃葡萄糖苷，為β-D-葡萄糖苷酶的底物），用于鑒定大腸桿菌，“4”為甘露醇鹽瓊脂，同SLEMA平板上的“3”。

2 SELMA系列平板適用的病料

SELMA和SELMA PLUS選擇性培養(yǎng)基的成品均達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量檢測和產(chǎn)品品質(zhì)保證的標(biāo)準(zhǔn)，用于奶牛乳房炎病原的培養(yǎng)及分類。大多數(shù)情況下，臨床上急性的奶牛乳房炎由單一的細(xì)菌菌株引起，分離培養(yǎng)得到的菌落性狀一致。從亞臨床感染的奶牛乳房炎、黏膜、皮膚和傷口等處的樣本往往可同時分離到多種細(xì)菌，這種情況下，SELMA系列的平板顯然不適合進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)和分類，因?yàn)镾EMLA系列的平板上每種培養(yǎng)基僅占平板的1/3或1/4，這么小的區(qū)域很難區(qū)分單個菌落，而單個菌落的特征是鑒定細(xì)菌的重要依據(jù)，因此對于非牛奶樣本，推薦使用單獨(dú)的牛血液瓊脂平板進(jìn)行分離培養(yǎng)。

3 SELMA系列平板的使用方法

3.1 分離培養(yǎng) SELMA系列平板的蓋子內(nèi)側(cè)容易凝結(jié)冷凝水，使用前應(yīng)輕輕打開平板。輕輕晃動裝奶樣的試管，用10μL取菌環(huán)取樣后在每個區(qū)域上分別進(jìn)行劃線分離，按照數(shù)字的順序接種，首先在牛血液瓊脂上進(jìn)行。為便于正確診斷，每個平板只接種一個奶樣。接種后應(yīng)盡快將平板進(jìn)行37℃倒置培養(yǎng)18～48 h。培養(yǎng)18～24 h之后進(jìn)行第一次觀察，如果沒有細(xì)菌生長，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以檢查是否存在緩慢生長的細(xì)菌。

3.2 生長觀察 檢查平板上細(xì)菌的生長狀況時，在反射光下可觀察到細(xì)小的菌落，用半透明的光線可觀察細(xì)菌的溶血性。如果牛血液瓊脂上沒有細(xì)菌生長或者有少量生長，說明奶樣中細(xì)菌量極少，沒有必要進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)菌學(xué)檢測。

3.3 不同細(xì)菌的鑒別 所有的有氧細(xì)菌能夠在牛血液瓊脂上生長。鏈球菌只在牛血液瓊脂上生長。葡萄球菌和腸球菌在牛血液瓊脂和甘露醇鹽瓊脂上生長。革蘭陰性菌在牛血液瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基和PGUA瓊脂上生長。甘露醇鹽瓊脂用于區(qū)別金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌；麥康凱培養(yǎng)基用于鑒別革蘭陰性菌；PGUA瓊脂用于區(qū)分大腸桿菌和克雷伯氏菌屬的細(xì)菌。

3.3.1 革蘭陽性菌 （1）葡萄球菌屬：葡萄球菌屬的細(xì)菌可分為金黃色葡萄球菌（為凝固酶陽性）和凝固酶陰性葡萄球菌，均可在牛血液瓊脂和甘露醇鹽瓊脂上生長。金黃色葡萄球菌的典型特點(diǎn)是在牛血液瓊脂上形成雙層溶血環(huán)，而凝固酶陰性葡萄球菌沒有此現(xiàn)象。圍繞金黃色葡萄球菌菌落內(nèi)層的溶血環(huán)透明，外層溶血環(huán)不透明。在甘露醇鹽瓊脂上，金黃色葡萄球菌因?yàn)槟芾酶事洞迹势渚渲車呐囵B(yǎng)基變成黃色，而凝固酶陰性葡萄球菌菌落周圍通常沒有這種顏色變化。葡萄球菌屬的細(xì)菌易產(chǎn)生青霉素酶導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥性。青霉素酶又稱β-內(nèi)酰胺酶，可水解β-內(nèi)酰胺類抗生素，包括青霉素G；氨基青霉素類，如氨芐西林、阿莫西林、匹氨西林；羧基青霉素類，如羧芐西林、替卡西林等；及脲基青霉素類，如呋芐西林、美洛西林等。因此，在SELMA系列平板上分離到葡萄球菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)行青霉素酶試驗(yàn)可直接評價細(xì)菌的耐藥性，為臨床治療奶牛乳房炎提供依據(jù)。金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌均應(yīng)進(jìn)行青霉素酶產(chǎn)生試驗(yàn)，方法如下。

當(dāng)觀察到甘露醇鹽瓊脂上菌落周圍的瓊脂變黃后，將頭孢噻吩藥敏紙片貼放于黃色的菌落上。將平板置37℃孵育15～20min，如果紙片顏色由粉紅色變?yōu)樯罴t色則說明該菌株產(chǎn)生青霉素酶。藥敏紙片顏色觀察最好從平板背面進(jìn)行。有的時候，紙片的顏色變化不完整，只有菌落貼到紙片上的位置才會出現(xiàn)小紅點(diǎn)。需要注意的是，青霉素酶試驗(yàn)只能在僅含有一種菌落的情況下采用。該試驗(yàn)不能在牛血液瓊脂上進(jìn)行，也不能在葡萄球菌屬以外的細(xì)菌菌落上進(jìn)行，因?yàn)槠渌鷮俚募?xì)菌也會使甘露醇鹽瓊脂變黃。

如果甘露醇鹽瓊脂上的菌落沒有變黃，即為凝固酶陰性葡萄球菌，那么青霉素酶的產(chǎn)生試驗(yàn)需要在載玻片上做。將頭孢噻吩藥敏紙片放于載玻片上，用微量的無菌蒸餾水或生理鹽水濕潤，然后用接種環(huán)從牛血液瓊脂上挑取菌落涂抹到藥敏紙片上，放在37℃的環(huán)境下孵育，在15～30min內(nèi)觀察紙片的顏色變化，紙片從粉紅色變?yōu)樯罴t色說明細(xì)菌產(chǎn)生青霉素酶，重要的是孵育的全過程需要在濕潤的條件下進(jìn)行，因此通常將其放在空的培養(yǎng)皿里。

（2）鏈球菌屬：大多數(shù)情況下，所有的鏈球菌都能夠在18～24 h內(nèi)在牛血液瓊脂上形成可見菌落。β-溶血性鏈球菌，例如無乳鏈球菌，常在菌落周圍形成透明的溶血環(huán)[5]。α-溶血性鏈球菌，例如停乳鏈球菌，在菌落周圍形成草綠色的溶血環(huán)。乳房鏈球菌也可以形成草綠色溶血環(huán)，故不能與其他鏈球菌區(qū)分開來。腸球菌有時可以在甘露醇鹽瓊脂上形成小的菌落并且使培養(yǎng)基變黃。但是，鏈球菌的菌落普遍比較細(xì)小，從形態(tài)上容易與腸球菌區(qū)別。

（3）化膿隱秘桿菌：化膿隱秘桿菌經(jīng)過18～24 h的培養(yǎng)，在反射光下勉強(qiáng)可見針尖大小的菌落。在半透明條件下可能會觀察到微弱的不透明溶血環(huán)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，菌落更易于觀察，小的溶血環(huán)更加清晰。

3.3.2 革蘭陰性菌 大腸菌群在培養(yǎng)4～6 h后就可在牛血液瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基形成小菌落。只有大腸桿菌和克雷伯氏菌屬的細(xì)菌會在麥康凱培養(yǎng)基上形成紫紅色的菌落。溶血性大腸桿菌在牛血液瓊脂上產(chǎn)生透明的溶血環(huán)。克雷伯氏菌屬的細(xì)菌比大腸桿菌的菌落更黏稠，當(dāng)用接種環(huán)挑取菌落時，常產(chǎn)生菌落的拉絲現(xiàn)象。

大腸桿菌和克雷伯氏菌屬的細(xì)菌在SELMA PLUS平板上很容易區(qū)分。大腸桿菌在PGUA瓊脂上會使菌落周圍的瓊脂變成黃綠色。當(dāng)PGUA瓊脂上有大量的大腸桿菌生長時，整個PGUA瓊脂都變?yōu)辄S綠色，少量大腸桿菌生長時，只有菌落周圍才變色。在PGUA瓊脂上生長的克雷伯氏菌屬的細(xì)菌則不會引起培養(yǎng)基的顏色變化。

假單胞菌屬在牛血液瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基和PGUA瓊脂上可形成具有典型焦糖味的灰綠色發(fā)光的菌落，這一點(diǎn)與其他細(xì)菌相比具有典型的鑒別意義。奇異變形桿菌常在牛血液瓊脂上進(jìn)行彌漫生長，而在其他的區(qū)域上則可見單個菌落，且不引起培養(yǎng)基顏色變化。

3.3.3 其他細(xì)菌 除上述的細(xì)菌外，尚有多種細(xì)菌可引起奶牛乳房炎，例如芽孢桿菌屬和腸桿菌科的某些菌種。芽孢桿菌的菌落相對較大而且邊緣不整齊，通常具有溶血作用，有時可能會在甘露醇鹽瓊脂上生長。酵母通常在牛血液瓊脂上生長，但有時經(jīng)過48 h培養(yǎng)之后也會在甘露醇鹽瓊脂上生長。牛棒狀桿菌通常被認(rèn)為是不致病的，常從乳房炎樣本中分離到。經(jīng)過48 h培養(yǎng)后會在牛血液瓊脂上形成不溶血、干燥的白色菌落。

各種奶牛乳房炎病原的鑒別見表1。

表1 各種奶牛乳房炎病原的鑒別

4 其他說明

SELMA系列平板由瑞典國家獸醫(yī)研究所研制。SELMA和SELMA PLUS平板倒置冷藏的保存期為2個月。青霉素酶試驗(yàn)所用的頭孢噻吩紙片的保存期為1年。如果無法通過SELMA系列平板判定檢測結(jié)果，應(yīng)將平板或牛奶樣本送往獸醫(yī)細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步的檢測。對分離到的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，可有效指導(dǎo)臨床用藥。SELMA系列平板方便了奶牛乳房炎的快速、便捷的準(zhǔn)確診斷。

[1]甘露.奶牛乳房炎病原菌PCR快速鑒定及牛源地衣芽孢桿菌感染小鼠乳房炎模型的研究[D].蕪湖：安徽師范大學(xué)，2012.

[2]劇慧棟.奶牛乳房炎主要致病菌的相關(guān)研究[D].石家莊：河北師范大學(xué)，2012.

[3]趙敬翠，李杰，劉耀川，等.化膿隱秘桿菌的特性及化膿隱秘桿菌病的防治[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009，11：92-93.

[4]陳海兒，陳群英，張慧萍.無乳鏈球菌213株標(biāo)本分布及耐藥性分析[J].中國藥物與臨床，2013，02：252-254.

[5]Bengt Ekberg.SELMA，SELMA PLUS[EB/OL].http：//www.sva.se/en/Service-and-products/Substrate production/SELMA-and-SELMA-PLUS，2011-09-15/2013-11-22.