侯洪烈，高慶田，羅永成，姜鳳華，馬海彬

（1.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，遼寧 丹東118003；2.遼寧省丹東市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧 丹東118000；3.遼寧省丹東市動物疫病控制中心，遼寧 丹東118000）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是目前引起母豬繁殖和仔豬呼吸道疾病的重要病原之一，很難清除和凈化。2012年12月，丹東市某豬場先后發(fā)生了以懷孕母豬流產(chǎn)、死胎，部分哺乳仔豬出現(xiàn)耳部發(fā)紺、神經(jīng)癥狀甚至死亡為特征的疾病。該發(fā)病場PRRSV的RT-PCR檢測，檢出率為100%（5/5），確診為豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）。其他豬場也有個別類似病例出現(xiàn)，檢測鄰近8個規(guī)模場PRRSV抗體的血清陽性率，結(jié)果在64.0%～95.4%之間；PRRSV的RT-PCR檢測陽性率為5.4%（2/37）。結(jié)果表明，丹東地區(qū)存在PRRSV感染，應(yīng)加強對豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的免疫，采取綜合措施，有效控制該病。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 Beckman Allegra 64型高速冷凍離心機,UNO-II型核酸擴增儀(Biometra公司),電泳儀,Thermo MK3酶標(biāo)儀，DS8000PC凝膠成像及分析系統(tǒng)(英國UVP公司)。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查 對發(fā)病規(guī)模化養(yǎng)豬場的免疫情況、生產(chǎn)繁殖和發(fā)病情況進行了調(diào)查。

1.3 血清學(xué)檢測

1.3.1 發(fā)病豬場及其鄰近場血清采集 對發(fā)病豬場及其鄰近場的種豬、后備豬、肉用豬及仔豬分別隨機采樣。耳靜脈無菌采集豬全血2mL，37℃放置1 h，待全血凝固并析出血清后，8 000 r/min離心4min，取上清液，-20℃保存，待檢。共采待檢血清2 835份。

1.3.2 試劑及檢測方法 PRRSV的ELISA抗體檢測：PRRS的ELISA抗體檢測試劑盒（美國IDEXX公司生產(chǎn)），檢測方法按其操作說明書進行，S/P值≥0.4為陽性。S/P值＜0.4為陰性。比較不同豬場的血清陽性率。

1.3.3 病原學(xué)檢測 隨機剖檢發(fā)病豬場及鄰近豬場疑似病死豬，無菌采取每頭病死豬肺門淋巴結(jié)或脾臟，共42份。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取1.5～2 g病料，加少量滅菌PBS(含青霉素、鏈霉素100 IU（ug）/mL)。無菌研磨至糊狀，取PBS按1∶4的體積比稀釋，分別在-20℃和37℃反復(fù)凍融3次，8 000 r/min（4℃）離心10min，取上清，-20℃保存，待檢。

試劑：TRIZol來自AutolabTech公司；DEPC來自Sigma公司；DL-2 000 DNA Marker來自Tiangen公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase Inhibitor、r Taq DNA聚合酶、dNTPs等，均購自Clontech公司。

引物由Novagen公司合成，序列如下：（PF）5′-CTG AGA CCA TGAGGTGGGCAA CT-3′；（PR）5′-CAT CACTGGCGTGTAGGTAATAGA AAAC-3′，擴增產(chǎn)物預(yù)期大小為748 bp。

病毒總RNA提?。喝?20℃保存的各病料上清液，按TRIZol LSReagent試劑盒（Invitrogen公司），按操作說明書提取病毒總RNA，15μLDEPC水溶解，-20℃保存待檢。

RT-PCR檢測：取10μLRNA，加1μL(20 pmoL/μL)下游引物、3.5μL dNTP(2.5mmoL/μL)、0.5μL Rnase Inhibitor(40 u/μL)、1μL LAMV、4μL 5×AMV Buffer，42℃水浴1～2 h，得cDNA模板，之后進行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為：10×PCRBuffer5μL、dNTPs 4μL、上下游引物各1μL、rTaq 0.6μL、cDNA 4μL、加水至50μL，反應(yīng)參數(shù)為95℃變性5min，94℃1min，58℃40 s，72℃50 s，共32個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取8μLPCR產(chǎn)物,1%瓊脂糖凝膠，100 V、30min電泳，觀察結(jié)果。

2結(jié)果

2.1 發(fā)病豬場流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果 發(fā)病豬場及其鄰近8個規(guī)?；i場都有防疫制度。發(fā)病豬場除因當(dāng)時發(fā)生其他疫情，未免疫豬繁殖與呼吸綜合征滅活苗外，其他免疫程序均與其他豬場大致相同。種豬免疫接種豬瘟兔化弱毒疫苗、口蹄疫疫苗、偽狂犬病滅活苗、豬繁殖與呼吸綜合征滅活苗、豬傳染性胃腸炎與流行性腹瀉二聯(lián)苗和鏈球菌苗,細小病毒疫苗僅在后備母豬免疫1次。肉豬均接種豬瘟、口蹄疫、豬肺疫和鏈球菌疫苗。

發(fā)病豬場的繁殖障礙情況：調(diào)查86胎，發(fā)病24胎，發(fā)病率27.9%（24/86）；總產(chǎn)仔數(shù)1 067，病死仔數(shù)357，死亡率33.5%（357/1 067）。母豬產(chǎn)出活仔、死仔和木乃伊胎兒，胎膜污灰、腐臭。母豬產(chǎn)后發(fā)情周期紊亂，甚至屢配不孕，反情率80%（36/45）。初產(chǎn)仔豬出現(xiàn)弱仔、畸形胎兒和先天性震顫，個別腹瀉，常于生后1～3 d死亡。

病理剖檢變化：病死仔豬淋巴結(jié)腫大、充血和出血，淋巴濾泡出血和壞死。胸腔有大量清亮或渾濁積液,有的有纖維素狀滲出物。間質(zhì)性肺炎，肺淤血，邊緣肝變。腎表面、實質(zhì)、髓質(zhì)針尖大出血斑點，腦水腫。組織學(xué)檢查：肺嗜中性粒細胞浸潤，腦干呈亞急性單核細胞性腦炎和血管周圍炎，小血管周圍“血管套”。

2.2 鄰近豬場PRRS血清學(xué)檢測 檢測鄰近8個豬場2 835份血清,陽性2 390份,PRRS抗體平均陽性率84.9%，各豬場的抗體陽性率在64.0%～95.4%之間，結(jié)果詳見表1。

表1 鄰近豬場PRRSV血清抗體檢測結(jié)果

不同豬場PRRSV血清抗體陽性率u檢驗結(jié)果見表2。由表2可見，甲、乙場與平均數(shù)差異極顯著（|u（uc）|≥2.58），即極顯著地低于平均數(shù)；丙、戊、庚場也與平均數(shù)差異極顯著（|u（uc）|≥2.58），即極顯著地高于平均數(shù)；丁、己、辛場與平均數(shù)差異不顯著（|u（uc）|＜1.96）。總之，這鄰近的8個豬場豬的PRRS免疫水平參差不齊。

表2 鄰近豬場PRRSV血清陽性率比較

2.3 發(fā)病及鄰近豬場RT-PCR檢測 發(fā)病場PRRSV的RT-PCR檢測陽性率為100%（5/5）；鄰近豬場疑似病死豬隨機采取的病料37份，檢出PRRSV核酸陽性2份,檢出率為5.4%（2/37），結(jié)果詳見表3。

表3 鄰近豬場PRRSV的RT-PCR檢測結(jié)果

3 小結(jié)和討論

3.1 采取綜合防制措施 由于PRRS屬免疫抑制病,并存在豬只長期隱性感染的可能,要控制該病必須采取綜合性防制措施。出現(xiàn)疫情后，立即封鎖發(fā)病豬場，淘汰陽性豬。及時清洗和消毒豬舍及環(huán)境，母豬流產(chǎn)的胎衣、死胎及病死豬嚴格做好無害化處理，產(chǎn)房徹底消毒。加強飼養(yǎng)管理，防止繼發(fā)感染。提高豬只的免疫力，對發(fā)病豬場周圍的豬群緊急接種PRRS滅活疫苗。

3.2 預(yù)防其他病原的感染 某些疾病的感染，如豬圓環(huán)病毒2型等免疫抑制性疾病，可引起PRRS的免疫失敗。雖然本次試驗沒對這類病原進行確診，但如何預(yù)防此類免疫抑制性疾病的感染，是有效提高PRRSV免疫效果的重要環(huán)節(jié)之一。

3.3 制定科學(xué)的免疫程序 結(jié)果證明，雖然檢測的豬場均進行過PRRS免疫，但是抗體滴度水平參差不齊，可能養(yǎng)殖場缺乏獸醫(yī)專業(yè)人員，自主免疫不到位等，造成了對PRRS免疫認識不足的漏免現(xiàn)象，最終導(dǎo)致臨床發(fā)病。所以，應(yīng)在疫病監(jiān)測結(jié)果基礎(chǔ)上制定科學(xué)的免疫程序，嚴格防疫。

3.4 病毒感染監(jiān)測很必要 PRRSV具有廣泛的抗原變異能力，這種變異性不僅表現(xiàn)于不同基因型的PRRSV之間，而且表現(xiàn)于同一基因型的PRRSV不同分離株之間，不同毒株之間抗原的交叉保護是有限的，由于PRRSV各分離株之間存在著廣泛的抗原多樣性，根據(jù)某一PRRSV分離株制備的疫苗是不可能有效地保護豬群對抗具有抗原差異的PRRSV野毒株的感染[2]。而由于基因變異,PRRSV毒力明顯增強,會給生豬生產(chǎn)造成嚴重損失[3]。另外，目前使用的豬藍耳病免疫抗體檢測試劑盒不能區(qū)分野毒抗體和免疫抗體。所以，加強該病毒感染監(jiān)測十分必要。

3.5 藥物預(yù)防 選擇對PRRS及其他病毒性疾病均有一定效果的某些藥物進行藥物預(yù)防。如中藥銀翹散：主要成分為金銀花、連翹、淡豆豉、薄荷、荊芥穗等，按每噸飼料添加2～3 kg連喂5～6 d。此外，PRRSV的一個重要生物學(xué)特征是主要攻擊宿主的單核巨噬系統(tǒng)，可導(dǎo)致免疫抑制甚至失敗，所以，可選擇黃芪多糖、氟苯尼考、替米考星、強力霉素等藥物以預(yù)防PRRS引起的并發(fā)或繼發(fā)感染。

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