張 偉，高志強，李 寧，谷 強，凌鳳俊，喬彩霞，蒲 靜，張利峰，汪 琳，吳 丹，柏亞鐸，安 健，劉 環(huán)，賴平安，張鶴曉

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京 通州101113；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀100081；3.北京農(nóng)學(xué)院，北京 昌平102206）

豬痢疾（SD）的病原體是一種革蘭陰性的厭氧性螺旋體，先后命名為是由豬痢疾密螺旋體（T.h）、豬痢疾蛇形螺旋體（S.h）?，F(xiàn)在統(tǒng)一命名為豬痢疾短螺旋體（Brachyspira hyodysenteriae；B.h），目前豬痢疾密螺旋體這一名稱由于歷史的原因還被廣泛使用。該病是豬的一種腸道傳染病，以黏液性或黏液出血性腹瀉為特征[1]。在豬群中的發(fā)病率相當(dāng)高，病豬生長發(fā)育受阻，耗料增加，給各地養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計病豬的飼料消耗率為正常豬的2倍，而增重率僅為正常豬的1/2。根據(jù)1983年Lysons的統(tǒng)計，為控制豬痢疾在飼料中添加的藥物，每頭豬花費2.5～2.8美元[2]。根據(jù)Wood等（1988）的計算，豬痢疾豬群的飼料消耗，每頭上市豬要多花12.6美元，同時每頭豬還要多花費2.4美元。在美國估計每年由于豬痢疾而損失6 400萬美元[3]。

該病遍布五大洲50多個國家和地區(qū)。在我國，許多省、市都有該病的存在，并且一旦傳入豬群，若不采取嚴(yán)格的處理措施很難根除。1978年10月，上?？诎对趶拿绹M(jìn)口的451頭商品豬的檢疫中確診豬痢疾后，1979年初又在我國豬只中確診豬痢疾，并從國內(nèi)豬只分離得到豬痢疾短螺旋體純培養(yǎng)，引起我國獸醫(yī)界的重視，并被列入《中華人民共和國進(jìn)境一、二類傳染病》[4]。目前檢測中采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1207-2003《豬痢疾短螺旋體分離培養(yǎng)操作規(guī)程》進(jìn)行病原分離和鑒定，檢驗周期要兩周時間，并且要求嚴(yán)格的厭氧培養(yǎng)監(jiān)控，因此急需快速、敏感、特異性強的檢測方法以替代或者補充該規(guī)程。

本研究從動物檢疫的實際出發(fā)，建立了熒光PCR檢測方法用于豬痢疾短螺旋體的快速檢測?？s短了該病原的檢測周期，并為臨床診斷提供快速、敏感、特異性強的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及設(shè)備

1.1.1 菌株 研究過程中應(yīng)用到的菌株如表1所示。

表1 研究過程中應(yīng)用到的菌株

1.1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、dNTP等，購自Promega公司；細(xì)菌培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；脫纖馬血，購自北京希凱創(chuàng)新科技有限公司。

1.1.3 實時熒光定量PCR儀 LightCycler 2.0，Roche公司產(chǎn)品；ABI7900，ABI公司。

1.1.4 厭氧培養(yǎng)系統(tǒng) COY公司。

1.2 引物探針的設(shè)計、合成 選擇豬痢疾短螺旋體nox基因作為靶區(qū)域，設(shè)計引物和探針。引物長度為20個堿基左右，GC含量為50%～60%，引物內(nèi)無二級結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無互補序列，引物間的熔解溫度（Tm值）相差小于5℃。探針的長度在25個堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。引物、探針的名稱、序列及擴(kuò)增基因見表1。引物和探針由上海旭冠生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 熒光PCR反應(yīng)體系的建立 以豬痢疾短螺旋體Brachyspira hyodysenteriae（ATCC編號：31212）的DNA作為擴(kuò)增模板，對引物濃度，探針濃度，Mg2+濃度，Taq DNA聚合酶用量，循環(huán)參數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.1 引物和探針濃度的優(yōu)化 將篩選好的引物濃度從0.1μmol/L至0.8μmol/L以0.1μmol/L為間距遞增，探針濃度從0.025μmol/L至0.2μmol/L以0.025μmol/L遞增。對引物和探針不同濃度的配比進(jìn)行了比較。

1.3.2 Mg2+濃度的優(yōu)化 應(yīng)用篩選好的引物探針，將Mg2+的濃度從1.0 mmol/L至5.0 mmol/L以0.5 mmol/L為間距遞增。對不同Mg2+濃度條件下的擴(kuò)增進(jìn)行了比較，其他反應(yīng)物的量同表2～3。

1.3.3 Taq DNA聚合酶的用量優(yōu)化 Taq酶用量（以單位U計）分別選取0.75 U、1.25 U和2.5 U三種用量。

1.3.4 循環(huán)參數(shù)優(yōu)化試驗 我們針對Roche Light Cycler熒光PCR檢測儀，對循環(huán)參數(shù)的各個方面都進(jìn)行了優(yōu)化試驗，以期達(dá)到最佳擴(kuò)增效率。在92℃/3 min的預(yù)變性之后，對該試驗中對變性溫度和時間、退火和延伸溫度及時間進(jìn)行了優(yōu)化試驗。我們主要比較了以下幾種循環(huán)條件的擴(kuò)增效率：方法A—92℃/10 s，60℃/1min，40個循環(huán)；方法B—92℃/15 s，60℃/30 s，40個循環(huán)；方法C—94℃/10 s，60℃/1min，40個循環(huán)；方法D—92℃/5 s，55℃/5 s，60℃/30 s，40個循環(huán)；方法E—92℃/5，55℃/10，65℃/30；40個循環(huán)。

1.3.5 擴(kuò)增時循環(huán)次數(shù)的確定 擴(kuò)增時，采用循環(huán)次數(shù)分別為40、45和50，比較擴(kuò)增結(jié)果的Ct值，進(jìn)而確定擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)。

1.4特異性試驗 提取Brachyspira hyodysenteriae（7株）和Brachyspira innocens、沙門菌、大腸桿菌、空腸彎曲菌和豬鏈球菌的DNA做為模板，采用優(yōu)化好的方法對提取的DNA進(jìn)行熒光PCR檢測，以確定檢測方法的特異性。

1.5 敏感性和重復(fù)性試驗 選取一株B.h（ATCC編號為：31212），參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1207-2003《豬痢疾短螺旋體分離培養(yǎng)操作規(guī)程》進(jìn)行純培養(yǎng)，收集純培養(yǎng)的B.h，用從豬場采集的豬糞作為載體，用pH值7.4的PBS作為稀釋液進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備模擬陽性標(biāo)準(zhǔn)品，采用細(xì)胞計數(shù)板計算每個稀釋度的病原數(shù)。稀釋后，得到B.h的濃度分別為105，104，103，102，101，1.0菌/200μL。模擬樣品按照建立的熒光PCR方法進(jìn)行檢測，每個樣品設(shè)置一個重復(fù)，以驗證試驗的重復(fù)性。

1.6 臨床樣品檢測 參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1207-2003《豬痢疾短螺旋體分離培養(yǎng)操作規(guī)程》對從北京周邊8家豬場的351份豬糞拭子樣品進(jìn)行病原分離及鑒定。采集的樣品同時按照建立的熒光PCR方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 引物和探針的設(shè)計 對設(shè)計的引物和探針經(jīng)BLAST驗證，表明可覆蓋所有已公布的豬痢疾短螺旋體的菌株。所合成的引物和探針見表2。

對引物探針篩選的結(jié)果為選取引物對U1 nox、L1 nox與探針PROBE nox 2的組合用于后續(xù)試驗。

表2 引物、探針的名稱、序列及擴(kuò)增基因片段

2.2 熒光PCR的反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 對各種反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，最適反應(yīng)總體積25μL（ROCHE 2.0）或50μL（ABI7900），其中模板5.0μL（ROCHE 2.0）或10μL（ABI7900）；最適的引物濃度均為0.2μmol/L，探針濃度均為0.1μmol/L，Mg2+濃度為3mmol/L，選定1.25 U Taq酶作為使用的Taq酶量；最適循環(huán)參數(shù)為方法D。

優(yōu)化后的特異性的擴(kuò)增曲線見圖1，從圖1可以看出，優(yōu)化后的反應(yīng)體系擴(kuò)增的Ct值相對較低，且升幅較高，同時具有良好的重復(fù)性。

圖1“nox組合”優(yōu)化后的特異性的擴(kuò)增曲線

2.3 特異性試驗 結(jié)果見圖2（a、b）。結(jié)果顯示兩種引物探針的組合針對7株從ATCC引進(jìn)的B.h均出現(xiàn)了特征性的擴(kuò)增曲線，其他幾株腸道致病菌結(jié)果均為陰性。由此證明方法有較強特異性。

圖2a nox組合特異性試驗（7株B.h）

圖2b nox組合特異性試驗

2.4 敏感性和重復(fù)性試驗 對稀釋的陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品（105-1.0菌/200μL）進(jìn)行熒光PCR檢測，結(jié)果如圖3所示（擴(kuò)增曲線對應(yīng)的樣品濃度從左至右依次為105-1.0菌/200μL）。結(jié)果表明，熒光PCR對系列梯度稀釋的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，在B.h濃度為101菌/200μL時，有較弱的擴(kuò)增曲線，1.0菌/200μL濃度時無特異性擴(kuò)增曲線。故PCR對豬痢疾短螺旋體模擬樣品最低可檢測至B.h濃度101菌/200μL。

圖3 敏感性和重復(fù)性試驗

2.5 臨床樣品的檢測 對北京周邊8個豬場采集的351份豬糞拭子進(jìn)行檢測。結(jié)果如表3所示，與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定的符合率為100%。該方法的可以在4 h內(nèi)完成檢測，大大縮短了檢驗周期，與傳統(tǒng)的病原分離培養(yǎng)結(jié)果完全一致，證明該方法是一種快速、準(zhǔn)確、特異性強的的檢測方法。

表3 臨床樣品檢測

3 結(jié)論與討論

豬痢疾在豬群中的發(fā)病率很高，病豬生長發(fā)育受阻，耗料增加，給各地養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前除了病原分離外沒有特異性好、敏感性高的檢測方法在我國廣泛使用。由于該病的病原需要嚴(yán)格的厭氧培養(yǎng)條件，對于該病的研究還比較少。盡管經(jīng)典檢測方法仍為病原分離鑒定，但國內(nèi)外越來越多的實驗室均采用核酸檢測方法進(jìn)行病原檢測[1]。

本試驗選擇豬痢疾短螺旋體nox基因作為靶基因,設(shè)計引物和探針建立了豬痢疾短螺旋體熒光PCR檢測方法。用所建立的方法對以10倍梯度稀釋的豬痢疾短螺旋體培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示靈敏度可達(dá)101菌/200μL；重復(fù)性試驗結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好；建立的兩種豬痢疾短螺旋體熒光PCR檢測方法在檢測所收集的豬痢疾短螺旋體全部為陽性，但檢測其他細(xì)菌的結(jié)果為陰性，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。表明該方法敏感性高、特異性強。

用該方法對8個豬場采集的351份豬糞拭子進(jìn)行檢測。熒光PCR檢測方法與分離培養(yǎng)鑒定法的符合率為100%，并且檢驗周期為小于4 h，進(jìn)一步驗證了所建立的方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、特異性強的特點。

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)及鑒定的方法檢驗周期長，一般需要10 d左右的時間，并且由于豬痢疾短螺旋體是一種厭氧菌，分離培養(yǎng)需要嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，對實驗室的要求也非?？量?，操作復(fù)雜。大量的試驗數(shù)據(jù)表明，本試驗所建立的兩種熒光PCR檢測方法與傳統(tǒng)的病原分離培養(yǎng)鑒定法（金標(biāo)）在敏感性和特異性上無顯著差別。但與分離培養(yǎng)鑒定法相比其快速的特點就非常突出?？梢源蟠罂s短檢驗周期，同時可以有效地避免由于樣品采集、運輸過程中造成病原分離失敗的假陰性結(jié)果。

隨著熒光PCR技術(shù)被廣泛認(rèn)可。本試驗所建立的熒光PCR檢測方法可以在進(jìn)出境檢測以及日常的臨床疫病監(jiān)控和診斷中發(fā)揮更加積極地作用。

[1]David J，Hampson C，F(xiàn)ellstrom Jill Thomson.Swine Dysentery Diseasesof Swine 9th edit：895.

[2]Lysons R J，Lemcke R M.Swine dysentery：to isolate or to fluo?resce[J].Vet Rec.1983，112(9)：203.

[3]Wood E N，Lysons R J.Financial benefit from the eradication of swine dysentery[J].VetRec.1988，122(12)：277-279.

[4] 覃青松，金梅林，劉建杰，等.豬痢疾短螺旋體綜述[J].2002，297：306-310.