朱 江，周立立，趙 亮，高燕軍，蔡 芫

細(xì)胞凋亡是一種以細(xì)胞DNA 早期降解為特征，具有特征性形態(tài)變化和生化改變的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，不同于細(xì)胞壞死過程［1］。在腦缺血性損傷發(fā)生發(fā)展過程中，損傷后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡主要來源于凋亡途徑［2］，凋亡神經(jīng)元的數(shù)量直接決定著神經(jīng)元壞死數(shù)量和缺血區(qū)域的面積，及時(shí)抑制凋亡是挽救凋亡前期神經(jīng)元的關(guān)鍵［3］。腦部缺血性疾病發(fā)生后，腦組織中自由基的過度產(chǎn)生是導(dǎo)致神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的主要因素。

依達(dá)拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)是一種有效的自由基清除劑。因其分子質(zhì)量小、脂溶性高，能阻斷氧化應(yīng)激，抑制脂質(zhì)過氧化［4］，給藥后可抑制自由基的產(chǎn)生，從而減輕腦缺血引起的組織損傷，臨床上主要用于腦缺血疾病的治療［5，6］。

本實(shí)驗(yàn)將依達(dá)拉奉應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，利用其清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化的藥理作用，探討自由基清除劑對大鼠延髓缺血神經(jīng)元、微血管的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與分組 SPF 級(jí)Wistar 成年健康雄性大鼠，220～260 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。72 只大鼠隨機(jī)分為3 組:假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組、缺血對照組。按時(shí)間點(diǎn)分為7 d、14 d 兩個(gè)亞組，每組6 只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 延髓缺血模型制備 結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈:10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎切斷，檢查無活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動(dòng)脈:大鼠俯臥固定，于后正中線第一頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第一頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入橫突孔內(nèi)凝閉椎動(dòng)脈3～4 s，檢查無活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的干預(yù)方法 假手術(shù)組只暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈，不做血管阻斷處理。實(shí)驗(yàn)組、缺血對照組均在阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈后立即開始治療。實(shí)驗(yàn)組每天腹腔注射依達(dá)拉奉兩次，時(shí)間間隔12 h，每次注射計(jì)量按3 mg/kg計(jì)算，到術(shù)后7 d 和14 d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死，取延髓。缺血對照組每天腹腔注射生理鹽水兩次，時(shí)間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。到術(shù)后7 d 和14 d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死，取延髓。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制作 應(yīng)用10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心臟，用連有輸液管的預(yù)先處理為鈍圓的針頭插入左心室內(nèi)，快速輸入溫生理鹽水(37 ℃)100 ml，同時(shí)用眼科剪剪破右心耳，此時(shí)血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛(0.1 mol 磷酸鹽緩沖液配成pH 7.4)灌流固定。灌流結(jié)束后取出延髓，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.2.4 Tunel 法操作步驟(1)組織切片至于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各20 min，用無水乙醇洗2×3 min，95%乙醇、90%乙醇各洗一次，每次3 min，蒸餾水洗兩次;(2)將組織切片置于蛋白酶K(20 μg/ml，pH 7.4)溶液中，室溫孵育15 min;(3)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗3 次;(4)擦干樣品周圍的水，滴加50 μl 的Tunel 反應(yīng)混合液溶液，在溫盒中37 ℃孵育60 min;(5)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗3 次;(6)擦干樣品周圍的水份，加入50 μl 的轉(zhuǎn)化劑-POD，在溫盒中37 ℃孵育30 min;(7)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗3 次;(8)加入50 μl 的DAB 底物溶液，室溫孵育10 min;(9)0.01 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗3次;(10)依次分別用70%、95%、100%乙醇脫水，干燥;(11)二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.5 尼氏染色主要步驟(1)組織貼片自然晾干;(2)無水乙醇+氯仿(1∶1)4 h;(3)100%乙醇(Ⅰ)3 min;(4)100%乙醇(Ⅱ)3 min;(5)95%乙醇3 min;(6)70% 乙醇3 min;(7)50% 乙醇3 min;(8)雙蒸水1 min;(9)1%甲苯胺藍(lán)染液，60 ℃恒溫箱內(nèi)染色50 min;(10)雙蒸水浸泡數(shù)遍;(11)50%乙醇1 min;(12)70%乙醇(含1%冰醋酸)數(shù)秒鐘，注意觀察切片分色情況;(13)95%乙醇(Ⅰ)1 min;(14)95%乙醇(Ⅱ)1 min;(15)100%乙醇(Ⅰ)1 min;(16)100%乙醇(Ⅱ)1 min;(17)二甲苯(Ⅰ)5 min;(18)二甲苯(Ⅱ)5 min;(19)中性樹膠封片。

1.2.6 神經(jīng)元計(jì)數(shù)及凋亡神經(jīng)元定量分析每只大鼠取3 張切片(片厚20 μm)，每張切片在400 倍光鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，輸入醫(yī)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)(MiVnt)進(jìn)行圖像處理。計(jì)數(shù)神經(jīng)元及凋亡神經(jīng)元，取其平均值為這只大鼠的神經(jīng)元及凋亡神經(jīng)元的細(xì)胞數(shù)。其中，凋亡神經(jīng)元在光鏡下呈現(xiàn)棕黃色［7］。

1.2.7 單寧酸-氯化鐵媒染法觀察微血管密度的變化 每只大鼠取3 張切片，采用Mivnt 圖像分析系統(tǒng)定量分析延髓微血管密度(microvesser density，MVD)。每張切片在100 倍光鏡下選5 個(gè)視野，計(jì)算MVD 值，取平均值作為該只大鼠延髓微血管的MVD 值。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織中神經(jīng)元數(shù)量的變化 通過對7 d、14 d 后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察，實(shí)驗(yàn)組及缺血對照組中神經(jīng)元的數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少。實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元減少幅度在各時(shí)段均低于缺血對照組。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元凋亡的幅度較缺血對照組的幅度低。與假手術(shù)組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表1、表2)。

2.2 各組腦組織中微血管密度(MVD)的變化通過對7 d、14 d 后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察，實(shí)驗(yàn)組及缺血對照組的微血管密度(MVD)值較假手術(shù)組均減少。但是，實(shí)驗(yàn)組MVD 數(shù)值減少的幅度低于缺血對照組。與假手術(shù)組相比較二者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表3)。

表1 各組大鼠腦組織中神經(jīng)元數(shù)量比較(±s)

表1 各組大鼠腦組織中神經(jīng)元數(shù)量比較(±s)

與假手術(shù)組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

表2 各組大鼠腦組織中神經(jīng)元凋亡數(shù)量比較(±s)

表2 各組大鼠腦組織中神經(jīng)元凋亡數(shù)量比較(±s)

與假手術(shù)組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

表3 各組大鼠腦組織中MVD 含量的比較(±s)

表3 各組大鼠腦組織中MVD 含量的比較(±s)

與假手術(shù)組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 討論

細(xì)胞凋亡是真核細(xì)胞常見的死亡形式，是機(jī)體為維持自身穩(wěn)態(tài)而進(jìn)行的。凋亡細(xì)胞在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)上常出現(xiàn)特征性改變，如DNA 斷裂、細(xì)胞核解體及凋亡小體形成等［8］。細(xì)胞凋亡的發(fā)生一方面與基因表達(dá)內(nèi)在性因素有關(guān)，更重要的則與自由基、興奮性氨基酸等外在性因素有關(guān)［9］，繼而引起遲發(fā)性神經(jīng)死亡［10］。

在延髓缺血后，出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量及微血管密度的減少。在缺血條件下，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生填充于壞死區(qū)域，從而進(jìn)一步影響到微循環(huán)，引起局部微循環(huán)障礙。進(jìn)一步加重神經(jīng)元的缺血，繼而引起遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，出現(xiàn)大量神經(jīng)元胞體凋亡。

通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，實(shí)驗(yàn)組延髓組織的神經(jīng)元減少的數(shù)量、凋亡神經(jīng)元的數(shù)量均低于缺血對照組，提示依達(dá)拉奉可通過清除自由基抑制神經(jīng)元凋亡從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。實(shí)驗(yàn)組中延髓組織內(nèi)微血管密度較缺血對照組高，說明依達(dá)拉奉在延髓缺血過程中通過清除自由基，減輕了微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)一步維持神經(jīng)元單元內(nèi)部的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，延髓缺血后由于自由基產(chǎn)生，改變了神經(jīng)元及微血管所處內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)病灶局部微循環(huán)改變，出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。依達(dá)拉奉通過清除自由基，抑制凋亡發(fā)生，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損害，改善了微循環(huán)障礙，發(fā)揮了對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

［1］陳力學(xué)，姜利人，劉寶松，等.全腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的時(shí)相和分布特征［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，3(28):531－534.

［2］蘭希發(fā)，姚文秀，郭 陽.腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制［J］.中國臨床康復(fù)，2003，7(19):2726－2727.

［3］李小剛，朱 克，李 楠，等.谷氨酸對鈣離子內(nèi)流和凋亡的影響及谷氨酸受體拮抗劑保護(hù)作用的研究［J］.中華老年心腦血管雜志，2001，3(2):122－125.

［4］Watanabe T，Tanaka M，Watanabe K，et al.Research and develepment of the free radical scavenger edaravone as a neuroprotectant［J］.Yakugaku Zasshi，2004，124(3):99－111.

［5］Yoshida H，Yanai H，Namkiy S，et al.Neuro protective effects of edaravone a novel free radical scavenger in cerebrovascular injury［J］.CNS Drug Rev，2006，12(1):9－20.

［6］Ding HY，Dong Q.The therapeutic effects of free radical scavenger edaravone on cerebral ischemia［J］.Cerebrovasc Dis Foreign Med Sci，2004，12(7):491－493.

［7］Blondeau N，Laurizen I，Widman C，et al.A potent protective role of lysophospho lipids against global cerebral ischemia and glutamate excite toxicity in neuronal cultures［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22(10):1205－1211.

［8］Chim KA，Drummond C，Coled J，et al.Effect of isoflurance on neuronal apoptosis in rats subjected to focal cerebral is chemia［J］.Anesth Analg，2004，98(3):798－805.

［9］陳 津，張如松.細(xì)胞凋亡機(jī)制概述［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29(4):886－889.

［10］尹昌林，熊建瓊，文 亮.Caspase-3 在缺血再灌注大鼠腦海馬神經(jīng)元凋亡中作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26(4):1245－1247.