李雙佳，朱曉峰

Noggin 是一種重要的胚胎蛋白發(fā)育基因［1］，廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼的發(fā)育、毛發(fā)的生長(zhǎng)、心臟中隔的形成［2，3］。有研究表明，Noggin 基因可以通過誘導(dǎo)神經(jīng)再生和局部新生發(fā)揮對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用［4］。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建重組pEGFP-N1-Noggin 真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，建立大鼠MCAO 局灶性腦缺血模型，進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植治療，觀察Noggin對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)微管結(jié)合蛋白MAP-2、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43 表達(dá)的影響，并對(duì)大鼠MCAO 模型進(jìn)行評(píng)分，探討Noggin 對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 新生24 h 之內(nèi)Wistar 鼠仔，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。重組大鼠pEGFP-N1-Noggin 質(zhì)粒由佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室劉爽博士惠贈(zèng)。Lipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen公司。兔抗大鼠Nestin 抗體、兔抗大鼠GAP-43 抗體、兔抗大鼠MAP-2 抗體，購(gòu)自Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的分離培養(yǎng)［5］常規(guī)分離新生Wistar 大鼠海馬，D-Hanks 液漂洗后充分剪碎，吸管吹打成單細(xì)胞懸液，以5×105/L 密度接種于NSCs 完全培養(yǎng)液(含DMEM/F12、bFGF、EGF、B27 和青鏈雙抗)，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，3 d后離心、半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)到7 d，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待形成大量100～200 個(gè)細(xì)胞左右的NSCs 球時(shí)，進(jìn)行胰酶消化傳代。細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原Nestin 表達(dá)。

1.2.2 重組質(zhì)粒PEGFP-N1-Noggin 轉(zhuǎn)染大鼠NSCs 轉(zhuǎn)染方法參考文獻(xiàn)［6］及Lipofectamine 2000說明書。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染2 d 后，按1/10 比例傳代，次日改用含G418(800 μg/ml)及10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液篩選，維持培養(yǎng)，3～5 d 換液一次，約7 d 左右陰性對(duì)照細(xì)胞全部死亡，將G418 濃度降為200 μg/ml 的維持濃度，約14 d 后出現(xiàn)細(xì)胞克隆。挑取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，命名為Noggin 組和空載組，分別擴(kuò)大培養(yǎng)，傳代建系。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)重組PEGFP-N1-Noggin 基因表達(dá)和Nestin 表達(dá)。

1.2.3 大鼠MCAO 模型的建立及鑒定 大鼠MCAO 模型的建立和具體操作參照線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的改進(jìn)方法［7］。大鼠MCAO 模型的鑒定參照Zea-Longa 方法在大鼠手術(shù)麻醉清醒后進(jìn)行5 分制評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0 分:無神經(jīng)功能損傷癥狀;1 分:動(dòng)脈栓塞對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展;2分:行走時(shí)向動(dòng)脈栓塞的對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn);3 分:行走時(shí)向栓塞動(dòng)脈的對(duì)側(cè)傾倒;4 分:不能自主行走，意識(shí)喪失。評(píng)分為以1～3 分者入選。TTC 染色:造模后2 d，大鼠以10%水合氯醛過量麻醉后仰臥位固定，快速開胸暴露心臟，從心尖部將16 號(hào)針頭插至主動(dòng)脈根部，血管鉗夾閉腹主動(dòng)脈，剪開右心耳放血。經(jīng)心臟快速灌注4 ℃生理鹽水250 ml 左右，直至流出液變清。立即斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，－20 ℃冰箱內(nèi)冷凍20 min 后連續(xù)切成厚2 mm的冠狀切片，約6～7 片。將其放入預(yù)先配制的2%TTC 溶液中，37 ℃避光孵育30 min，15 min 時(shí)腦片翻面一次，使均勻接觸到染色液。30 min 后觀察拍照，正常組織呈鮮紅色，壞死區(qū)不染色而呈蒼白色。

1.2.4 動(dòng)物分組及移植 將具有神經(jīng)功能缺失癥狀的大鼠隨機(jī)分為3 組:(1)生理鹽水移植組(NS組)(18 只，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6 只);(2)神經(jīng)干細(xì)胞/空載體移植組(空質(zhì)粒/NSCs 組)(18 只，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只);(3)神經(jīng)干細(xì)胞/Noggin 移植組(NOG/NSCs 組)(18 只，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6 只)。3 組按照移植時(shí)間(2 d、7 d、14 d)不同分為3 個(gè)亞組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6 只。利用大鼠腦立體定位儀進(jìn)行腦內(nèi)移植，移植時(shí)間為成模后3 d，移植部位為左側(cè)腦室(前囪后0.8-1.0 mm，頭尾正中線右側(cè)旁開1.8～2.0 mm，深度4.0～5.0 mm)。

1.2.5 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后腦缺血組織MAP-2、GAP-43 免疫組化檢測(cè) 分別于NSCs 移植后2 d、7 d、14 d 后，將大鼠麻醉后開胸，4 ℃4%多聚甲醛固定液250 ml 心臟灌注，灌注后快速取腦，并置于相同固定液中4 ℃固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，于前囪后1.5 mm 處冠狀位連續(xù)切片，切片厚度為6 μm，SABC-DAB 法免疫組化染色，免疫組化染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察，以缺血梗死組織周邊2 mm范圍內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞胞漿曾棕色表達(dá)為陽性細(xì)胞，每張切片在×200 鏡下分別隨機(jī)選區(qū)5 個(gè)視野，并計(jì)數(shù)視野內(nèi)的陽性細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)NSCs 形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)海馬NSCs 單細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，密度較均勻;2 d 后發(fā)現(xiàn)NSCs 自身克隆，以后克隆逐漸增大;到3 d 聚集成圓球形，漂浮生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶中，折光性好，大小不等;到7 d 克隆到數(shù)百個(gè)細(xì)胞，形成神經(jīng)球。此刻的神經(jīng)球立體感及折光性均強(qiáng)，邊界清晰。組成神經(jīng)球的細(xì)胞圓潤(rùn)飽滿，活力狀態(tài)好。細(xì)胞免疫熒光染色可發(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)神經(jīng)球有Nestin 陽性表達(dá)。

2.2 重組PEGFP-N1-Noggin 基因轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)干細(xì)胞觀察 共聚焦顯微鏡檢測(cè)重組PEGFP-N1-Noggin 基因轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)干細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)和Nestin 表達(dá)，共聚焦顯微鏡下綠色熒光蛋白為綠色，Nestin 表達(dá)為紅色，兩者重合為黃色，結(jié)果顯示PEGFP-N1-Noggin 轉(zhuǎn)入Nestin 標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)。

2.3 PEGFP-N1-Noggin 基因轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦缺血后免疫組化檢測(cè)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43 及微管結(jié)合蛋白MAP-2 在腦內(nèi)梗死灶周圍的表達(dá)。

2.3.1 移植后2 d、7 d、14 d 各組免疫組化檢測(cè)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43 在梗死灶周圍的表達(dá) 免疫組化檢測(cè)NOG 組、空質(zhì)粒組GAP-43 的蛋白表達(dá)，陽性細(xì)胞表達(dá)呈棕色，免疫組化顯示GAP-43 蛋白表達(dá)于胞漿和胞膜，呈棕褐色。梗死中心區(qū)無明顯陽性染色，梗死周圍可見陽性表達(dá)。陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)(個(gè)/×200 視野)×100%。移植后2 d、7 d、14 d 各組GAP-43 的表達(dá)逐漸增高，移植后2 d 表達(dá)為最低，在14 d 時(shí)表達(dá)最高，各時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表1);組間比較顯示NOG 組GAP-43 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)最高，NS 組GAP-43 表達(dá)最低(見表2)。

2.3.2 移植后2 d、7 d、14 d 各組免疫組化檢測(cè)微管結(jié)合蛋白MAP-2 在梗死灶周圍的表達(dá) 免疫組化檢測(cè)NOG 組、空質(zhì)粒組MAP-2 的蛋白表達(dá)，陽性細(xì)胞表達(dá)呈棕色，陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)(個(gè)/×200 視野)×100%。MAP-2 陽性表達(dá)反應(yīng)主要位于神經(jīng)元和樹突，以樹突表達(dá)尤為明顯。染色均勻，突起排列完整呈束狀。腦缺血后中心區(qū)幾乎無表達(dá)，樹突排列不齊，呈散在、斷裂狀，周邊區(qū)表達(dá)增強(qiáng)，粗大深染樹突增多，可見部分正常神經(jīng)元和樹突形態(tài)排列完整者與缺血神經(jīng)元相交織。移植后48 h、7 d、14 d NOG 組、空質(zhì)粒組的MAP-2 蛋白顯著高于NS 組(P＜0.05);并且NOG 組MAP-2 蛋白的表達(dá)顯著高于空質(zhì)粒組(P＜0.05);各組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)MAP-2 的蛋白表達(dá)于移植后2 d、7 d、14 d 逐漸增高各時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)GAP-43 蛋白的表達(dá)率(±s)%

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)GAP-43 蛋白的表達(dá)率(±s)%

與NS 組比較* P＜0.05，△P＜0.01;與空質(zhì)粒組▽P＜0.05

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)MAP-2 蛋白的表達(dá)率(±s)%

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)MAP-2 蛋白的表達(dá)率(±s)%

與NS 組比較* P＜0.05，△P＜0.01;與空質(zhì)粒組▽P＜0.05

3 討論

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用NOG 基因修飾的外源性NSCs 移植治療大鼠局灶性腦缺血的目的是為了探討Noggin基因?qū)Υ笫缶衷钚阅X缺血后生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43及微管相關(guān)蛋白MAP-2 表達(dá)的影響。Noggin 基因作用腦缺血組織機(jī)制可能為內(nèi)源性神經(jīng)誘導(dǎo)作用:Noggin 基因是一種胚胎蛋白，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化有重要調(diào)控作用，調(diào)控成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)發(fā)生。內(nèi)源性神經(jīng)誘導(dǎo)作用Ngogin 的神經(jīng)誘導(dǎo)功能主要與其對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPs 的抑制作用有關(guān)［9］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transfomring growth factor bate，TGF-β)超家族，BMPs 是家族成員中最大的一族，至少包括20 個(gè)成員，其成員控制著如中胚層形成、左右對(duì)稱、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、體節(jié)和骨骼發(fā)育、肢體形成和腎、胃腸、肺、牙齒的發(fā)育等基本的發(fā)育過程［10，11］，包括發(fā)育期和成年后的各個(gè)時(shí)期［12］。Lim 證實(shí)，Noggin 與BMP4 共同調(diào)控成年室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的分化［13］。在體內(nèi)與離體研究均證實(shí)BMPs 可以明顯抑制神經(jīng)發(fā)生，BMPs 信號(hào)通過促進(jìn)室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞分化，而抑制神經(jīng)元的產(chǎn)生，純化的小鼠Noggin 蛋白則促進(jìn)離體神經(jīng)發(fā)生并抑制向膠質(zhì)細(xì)胞分化。異位Noggin 促進(jìn)移植入紋狀體室下區(qū)細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化生。提示室管膜Noggin 產(chǎn)生通過封閉內(nèi)源性BMPs 信號(hào)為鄰近的室下區(qū)細(xì)胞提供了促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的環(huán)境。

3.1 Noggin 對(duì)GAP-43、MAP-2 表達(dá)的影響生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)又稱作神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuromodulin，NeM)，是一種神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白，分子量約為46.7 kDa，分布于神經(jīng)元、再生的施旺細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，參與神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)及突觸發(fā)育形成、神經(jīng)細(xì)胞再生和突觸重構(gòu)。在突觸重建過程中，新生發(fā)芽末梢中GAP-43 含量顯著增高，只要有突觸重建，即使無軸突延伸，GAP-43 也會(huì)在高水平上表達(dá)。一旦突觸重建完成，GAP-43 mRNA 就下降至微量或無表達(dá)。因此，GAP-43 被認(rèn)為是神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)再生以及成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸重建和可塑性的分子標(biāo)志物［14］。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Noggin 的神經(jīng)干細(xì)胞移植組在移植后大鼠腦梗死灶周圍區(qū)GAP-43 表達(dá)較其他組顯著增加，提示Noggin 可以促進(jìn)梗死灶內(nèi)移植細(xì)胞和周圍細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)再生以及成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的突觸重建。

近年研究表明，微管結(jié)合蛋白-2(MAP-2)在神經(jīng)元發(fā)育、分化、可塑性方面起著主導(dǎo)作用。MAP-2主要存在于樹突和胞體，是細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)腦缺血非常敏感，常作為缺血誘導(dǎo)腦缺血損傷的標(biāo)記物，也有實(shí)驗(yàn)觀察到MAP-2 可調(diào)節(jié)突觸可塑性。研究顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有高度的可塑性，主要為神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)性變化。已證實(shí)可塑性存在于神經(jīng)元發(fā)育早期和成年后突觸構(gòu)成時(shí)期，與樹突及突觸的形態(tài)學(xué)變化有關(guān)，并受MAP-2 磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)，提示細(xì)胞骨架蛋白在神經(jīng)可塑過程中有重要作用［15］。研究表明，腦缺血后梗死中心區(qū)受損神經(jīng)元MAP-2 表達(dá)喪失，而相對(duì)完整的神經(jīng)元和缺血周邊區(qū)MAP-2 表達(dá)選擇性升高，此種改變與缺血后的神經(jīng)元恢復(fù)相對(duì)應(yīng)［16］。因此，MAP-2 可以作為促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)再生以及成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸重建和可塑性的分子標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Noggin 的神經(jīng)干細(xì)胞移植組，移植后大鼠腦梗死灶周圍區(qū)MAP-2 表達(dá)較其他組顯著增加，提示Noggin 可以促進(jìn)梗死灶內(nèi)移植細(xì)胞和周圍細(xì)胞MAP-2的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)再生以及成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸重建。

3.2 移植Noggin 基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞治療局灶性腦缺血的應(yīng)用前景 Noggin 基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的多重功能提示其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療方面有一定的應(yīng)用前景。轉(zhuǎn)染了Noggin 基因后，由于Noggin 發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)誘導(dǎo)作用可增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療局灶性腦缺血的作用。我們應(yīng)用Noggin 基因修飾的NSCs 移植，可以促進(jìn)腦損傷區(qū)域生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43 及微管結(jié)合蛋白-2 表達(dá)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)再生的蛋白質(zhì)類合成條件［17］。雖然NSC移植治療缺血性腦損傷所致的神經(jīng)功能障礙還有很多問題需要解決，但NSCs 移植和轉(zhuǎn)基因治療已經(jīng)在動(dòng)物模型研究中取得了一定進(jìn)展，說明這是一種有著廣闊前景的治療策略，為某些難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來了希望。

［1］Smith W，Harland R.Expression cloning of noggin，a new dorsalizing factor localized to the spemann organizer in xenopus embryos［J］.Cell，1992，70(5):829－840.

［2］Reddi AH.Interplay between bone morphogenetic proteins and cognate binding proteins in bone and cartilage development noggin，chordin and DAN［J］.Arthritis Res，2000，3(1):1－5.

［3］Allen SP，Bogardi JP，Barlow AJ，et al.Misexpression of noggin leads to septal defects in the out flow tract of the chick heart［J］.Dev Biol，2001，235(1):98－109.

［4］Fan XT，Cai WQ，Yang Z，et al.Effect of antisense oligonucleotide of noggin on spatial learning and memory of rats［J］.Acta Pharmacol Sina，2003，24 394－397.

［5］朱曉峰.神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)與應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)出版社，2005.69－101.

［6］Wang XV，Zhang JT.Effects of ginsenoside Rgl on synaptic plasticity of freely moving and its mechanism of action［J］.Acta Pharmacol Sin，2001，22(7):657－662.

［7］王炳高，袁新顏，王守彪.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的改進(jìn)［J］.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，3(2):71－72.

［8］Chen JL，Yi Li，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intravenous Administration of bone marrow stromal cells after cerebral isehemla in rats［J］.Stroke，2001，32(4):1005－1011.

［9］KamataT，Daar I，Subleski M，et al.Xenopus BMP-2 is an early response gene to neural induction［J］.Brain Res Mol Brain Res，1998，57(2):201－210.

［10］Mehler MF，Mabie PC，Zhang D，et al.Bone morphogenetic protein in the nervous system［J］.Trends Neurosci，1997，20(7):309－317.

［11］Zhang Y，F(xiàn)eng X，We R，et al.Receptor-associated Mad homologues synergize as effectors of the TGF-beta response［J］.Nature，1996，383(6596):168－172.

［12］Hogan BL.Bone morphogenetic proteins:multifunctionnal regulators of vertebrate development［J］.Gene Dev，1996，10(13):1580－1594.

［13］Lim DA，Tramontin AD，Trevejo JM，et al.Noggin antagonizes BMP signaling to create a niche for adult neurogenesis［J］.Neuron，2000，28(3):713－726.

［14］Hassiotis M，Ashwell KW，Marotte LR，et al.GAP-43 immunoreactivity in the brain of the developing and adult walla［J］.Anat Embryol，2002;206(1):97－118.

［15］Colak D，Mori T，Gotz M，et al.Adult neurogenesis requires Smad4-mediated bone morphogenic protein signaling in stem cells［J］.J Neurosci，2008，28:434－446.

［16］Yamanouchi H，Jay V，Otsubo H，et al.Early forms of microtubule– associated protein are strongly expressed in cortical dysplasia［J］.AcuteNeuropathol，1998，95(5):466－470.

［17］Amar AP，Zlokovic BV，Apuzzom lJ.Endovascular restorative neurosurgery:A novel concept formolecular therapy of the nervous system［J］.Neurosurgery，2003，52(2):402－413.