彭友舜，韓占霞，李嘉明

(1河北科技師范學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，河北秦皇島，066600;2河北省蘆筍工程技術(shù)研究中心)

蘆筍(Asparagusofficinalis L.)，學(xué)名石刁柏，是百合科天門冬屬多年生草本植物，其營養(yǎng)價值高于一般蔬菜水果，在國際市場上被稱為“蔬菜之王”。藥理學(xué)研究表明蘆筍多糖對高脂血癥、糖尿病、癌癥等有一定療效［1］，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值［2～4］，而且大多數(shù)活性較小，在預(yù)防疾病上優(yōu)于其他化合物，具有廣闊的應(yīng)用前景。

植物多糖中含有色素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，對其活性造成影響，因此脫色是多糖的提取、分離、純化及結(jié)構(gòu)研究中的一個重要環(huán)節(jié)。目前多糖脫色多采用雙氧水法和活性炭吸附法，如盧國勇等［5］采用過氧化氫對魚腥草多糖脫色，楊培民等［3］利用活性炭對白花蛇舌草多糖溶液進(jìn)行脫色。雙氧水通過氧化色素實(shí)現(xiàn)脫色目的，容易造成多糖降解?；钚蕴?粉炭)有巨大的比表面積，對雜質(zhì)的吸附能力很強(qiáng)，脫色成本低，效果好，且不會影響提取物的生物活性［6］。受秦皇島長勝農(nóng)業(yè)科技有限公司委托，筆者進(jìn)行了單因素及均勻設(shè)計試驗(yàn)，對蘆筍多糖活性炭脫色的最佳工藝條件進(jìn)行研究，以期為蘆筍多糖工業(yè)化生產(chǎn)脫色工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆筍粗多糖，引自秦皇島長勝農(nóng)業(yè)科技有限公司蘆筍生產(chǎn)基地;粉末活性炭，引自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;牛血清蛋白CBBG250，引自西安周鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;考馬斯亮藍(lán)G-250，引自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;D-無水葡萄糖，引自中國藥品生物制品檢定所，批號為110833-200503;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

HZQ-QG恒溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司出品;722s可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司出品;FE-20精密pH酸度計，上海微川精密儀器有限公司出品;JA5003型電子天平，上海方瑞儀器有限公司出品;720060型和720110型手動單道可調(diào)式移液器，上海大龍醫(yī)療器械有限公司出品;雷磁pHS-3C型pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司出品;800型離心機(jī)，江蘇宏凱儀器廠出品。

1.3 方法

1.3.1 蘆筍粗多糖溶液的制備 稱取1 g蘆筍粗多糖粉末，加蒸餾水溶解定容至100 mL，即為質(zhì)量濃度10 g/L的蘆筍粗多糖樣品溶液。

1.3.2 脫蛋白率的測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用Bradford法［7］。

質(zhì)量濃度為0.10 g/L的考馬斯亮藍(lán)儲備液的制備:稱取0.100 g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為0.85的磷酸，用蒸餾水定容至1 L，搖勻，備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密移取 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL 的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次置于11個20 mL的具塞試管中，各加蒸餾水至1.0 mL，再分別加入質(zhì)量濃度為0.10 g/L的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5.0 mL，充分搖勻后，靜置15 min，于波長595 nm處測定溶液吸光度值。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液中蛋白質(zhì)含量的測定:精密量取樣品溶液1.0 mL，加入考馬斯亮藍(lán)儲備液5.0 mL，振搖，以1.0 mL水作為空白，靜置15 min后于595 nm處測定吸光度值。按(1)式計算脫蛋白率:

W1——脫蛋白率;C1——處理前溶液中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度;C2——處理后溶液中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.3.3 多糖保留率的測定 多糖的測定采用苯酚-硫酸法［8］。

質(zhì)量濃度為50.0 g/L的苯酚溶液的配制:精確稱取苯酚5.0 g，加入少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容后其置于棕色試劑瓶中備用。

1.0 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取105℃下干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0.5 g，加少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，配得質(zhì)量濃度為5.0 g/L葡萄糖母液。用移液器精密移取5.0 mL葡萄糖母液至25 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精確移取0，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，依次置于6 個20 mL的具塞試管中，分別加蒸餾水至1.0 mL，之后加入質(zhì)量濃度為50.0 g/L的苯酚溶液1.0 mL及體積分?jǐn)?shù)為0.98的濃硫酸5.0 mL，將其充分搖勻后，放入85℃水浴鍋中加熱20 min，取出，冷卻至室溫，于波長490 nm處測定溶液吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制得多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液中多糖含量的測定:為消除待測液pH值對顯色的影響，測定前用稀鹽酸調(diào)節(jié)粗多糖溶液pH值為6.0。精密量取樣品溶液1.0 mL，加入質(zhì)量濃度為50.0 g/L的苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，充分搖勻后，放入85℃水浴鍋中加熱20 min，取出冷卻至室溫。另以1.0 mL蒸餾水加質(zhì)量濃度為50.0 g/L的苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL同上述操作(作為空白對照)，于490 nm處測定溶液吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出溶液中多糖濃度，并按(2)式計算多糖保留率:

W2——吸附結(jié)束后溶液中多糖保留率;C0——吸附前溶液中多糖的質(zhì)量濃度;Ct——吸附后溶液中多糖的質(zhì)量濃度。

1.3.4 脫色率的測定 取10 g/L蘆筍多糖溶液，以蒸餾水作參比進(jìn)行紫外全波長掃描，結(jié)果表明，該溶液無最大吸收波長。由互補(bǔ)色原理可知，溶液呈現(xiàn)的顏色是其吸收光的互補(bǔ)色。蘆筍粗多糖溶液為橙黃色，故該溶液主要吸收藍(lán)紫色波段可見光。因此對400～500 nm波長范圍內(nèi)每隔10 nm測定脫色率，計算所測定的脫色率平均值，以脫色率最接近該平均值的450 nm作為測定波長。并按(3)式計算脫色率:

W3——脫色率;A0——吸附前溶液的吸光度;At——吸附后溶液的吸光度。

1.3.5 綜合吸附效應(yīng)指數(shù)的計算 整合分析(meta-analysis)是對同一主題下多個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合的統(tǒng)計學(xué)方法，被認(rèn)為是目前最好的數(shù)量綜合方法，其統(tǒng)計量為效應(yīng)值。為客觀評價脫色脫蛋白方法的有效性，引入綜合吸附效應(yīng)指數(shù)ζ(0≤ζ≤1)，其物理意義為脫蛋白率、多糖保留率以及脫色率的加權(quán)和。ζ為一個無量綱的值，其值越大表明活性炭綜合處理能力越好。其計算方法如下:

ζi表征活性炭的綜合吸附效應(yīng)指數(shù);Wij為脫蛋白率(j=1)、多糖保留率(j=2)、脫色率 (j=3)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);X1，X2，X3分別表示脫蛋白、多糖保留、脫色能力的權(quán)重。由于本次研究旨在考察活性炭對多糖溶液的脫色能力，但需兼顧處理方法對脫蛋白及對多糖的保留能力，故依重要性設(shè)定其值依次為0.2，0.3，0.5。

1.3.6 蘆筍多糖活性炭脫色單因素試驗(yàn)

①溫度對活性炭吸附性能的影響分別取多糖溶液10.0mL置于三角瓶中，在活性炭質(zhì)量濃度為15 g/L，pH 值為6的條件下，設(shè)置脫色溫度分別為30，40，50，60，70，80 ℃，恒溫振蕩脫色60 min，離心，取上清液，測定吸光度，計算脫色率、多糖保留率、蛋白質(zhì)脫除率及綜合吸附效應(yīng)指數(shù)。

②時間對活性炭吸附性能的影響分別取多糖溶液10.0 mL置于三角瓶中，在溫度為70℃，活性炭質(zhì)量濃度為15 g/L，pH值為6的條件下，設(shè)置脫色時間分別為20，30，40，50，60 min，恒溫振蕩脫色，離心，取上清液，測定吸光度，計算脫色率、多糖保留率、蛋白質(zhì)脫除率及綜合吸附效應(yīng)指數(shù)，確定時間對活性炭吸附性能的影響。

③活性炭質(zhì)量濃度對活性炭吸附性能的影響分別取多糖溶液20.0 mL置于三角瓶中，在溫度為70℃，脫色時間為60 min，pH值為6的條件下，添加活性炭，使多糖溶液中活性炭的質(zhì)量濃度為5，10，15，20，25，30 g/L。恒溫振蕩脫色，離心，取上清液，測定吸光度，計算脫色率、多糖保留率、蛋白質(zhì)脫除率及綜合吸附效應(yīng)指數(shù)，確定活性炭質(zhì)量濃度對活性炭吸附性能的影響。

④pH值對活性炭吸附性能的影響分別取多糖溶液10.0 mL置于三角瓶中，在溫度為70℃，脫色時間為60 min，活性炭質(zhì)量濃度為15 g/L，設(shè)置pH值分別為5，6，7，8，9。恒溫振蕩脫色，離心，取上清液，測定吸光度度，計算脫色率、多糖保留率、蛋白質(zhì)脫除率及綜合吸附效應(yīng)指數(shù)，確定pH值對活性炭吸附性能的影響。

1.3.7 蘆筍多糖活性炭脫色均勻設(shè)計實(shí)驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對影響蘆筍多糖脫色效果的主要因素——溫度、時間、活性炭質(zhì)量濃度、pH值進(jìn)行均勻設(shè)計試驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 蘆筍多糖活性炭脫色均勻設(shè)計試驗(yàn)因素水平

1.3.8 蘆筍多糖活性炭脫色驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 分別取多糖溶液10.0 mL置于5個三角瓶中，在均勻設(shè)計試驗(yàn)最優(yōu)條件下進(jìn)行蘆筍多糖脫色試驗(yàn)，測定吸光度，計算脫色率、多糖保留率、蛋白質(zhì)脫除率及綜合吸附效應(yīng)指數(shù)。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 圖表中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值表示，ζ值由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值計算得到，數(shù)據(jù)處理軟件為 DPSV6.55，作圖軟件為 ORINGIN 8.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以牛血清蛋白質(zhì)量濃度(g·L－1)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆筍蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=1.450 0 x﹢0.290 0，R2=0.995 6(圖1);以多糖的質(zhì)量濃度(g·L－1)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆筍多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=2.897 4 x-0.001 0，R2=0.999 7(圖2)。

圖1 蘆芛蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 蘆芛多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 蘆筍多糖活性炭脫色單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溫度對活性炭吸附性能的影響 脫色率在脫色溫度在30～50℃范圍內(nèi)，隨溫度升高明顯增大，在50℃達(dá)到最大，后隨溫度升高緩慢下降;多糖保留率隨溫度增加呈先上升后下降趨勢，在60℃時達(dá)到最高;蛋白質(zhì)脫除率隨溫度增加呈先上升后下降趨勢，在70℃時達(dá)到最高;綜合吸附效應(yīng)指數(shù)隨溫度增加呈先上升后下降趨勢，在70℃時達(dá)到最大(圖3)。參考綜合吸附效應(yīng)指數(shù)，確定脫色溫度70℃為最佳脫色條件。

2.2.2 時間對活性炭吸附性能的影響 脫色率隨時間增加呈先上升后下降趨勢，50 min時達(dá)到最高;多糖保留率隨時間增加呈先上升后下降趨勢，在40 min時達(dá)到最高;蛋白質(zhì)脫除率在20～30 min呈上升趨勢，在30 min時達(dá)到最高，隨后達(dá)到平衡;綜合吸附效應(yīng)指數(shù)隨時間增加呈先上升后下降趨勢，在40 min時達(dá)到最大(圖4)。參考綜合吸附效應(yīng)指數(shù)，確定脫色時間40 min為最佳脫色條件。

圖3 溫度對活性炭吸附性能的影響

圖4 時間對活性炭吸附性能的影響

2.2.3 活性炭質(zhì)量濃度對活性炭吸附性能的影響 脫色率在活性炭的質(zhì)量濃度為5～25 g/L范圍內(nèi)，隨用量增加明顯增大，隨后達(dá)到平衡;多糖保留率隨用量增加呈不斷下降趨勢;蛋白質(zhì)脫除率隨用量增加而升高，在活性炭的質(zhì)量濃度為25 g/L時達(dá)到最高，隨后下降;綜合吸附效應(yīng)指數(shù)隨活性炭的質(zhì)量濃度升高而升高，在活性炭的質(zhì)量濃度為25 g/L時達(dá)到平衡(圖5)。參考綜合吸附效應(yīng)指數(shù)，確定活性炭的質(zhì)量濃度25 g/L為最佳脫色條件。

2.2.4 pH值對活性炭吸附性能的影響 脫色率受pH值影響較小，在pH值為7時出現(xiàn)拐點(diǎn)，呈下降趨勢;多糖保留率在pH值為5～6時增加顯著，隨后呈緩慢增加趨勢;蛋白質(zhì)脫除率隨pH值增大呈先升高后降低趨勢，在pH值為7時達(dá)到最高;綜合吸附效應(yīng)指數(shù)隨pH值增加呈先升高后降低趨勢，在pH值為7時達(dá)到最大(圖6)。參考綜合吸附效應(yīng)指數(shù)，確定最佳脫色條件為pH值為7。

圖5 活性炭質(zhì)量濃度對活性炭吸附性能的影響

圖6 pH值對活性炭吸附性能的影響

2.3 蘆筍多糖活性炭脫色均勻設(shè)計實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1設(shè)定的因素水平，利用DPSV6.55軟件進(jìn)行均勻設(shè)計試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表2，各因變量與各自變量標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)關(guān)系見表3，對模型以綜合吸附效應(yīng)指數(shù)為目標(biāo)函數(shù)進(jìn)行求解見表4。

以綜合吸附效應(yīng)指數(shù)為目標(biāo)函數(shù)，對試驗(yàn)結(jié)果(表2)進(jìn)行偏最小二乘建模。采用偏最小二乘二次多項(xiàng)式回歸分析，其模型如下:

通過對回歸系數(shù)絕對值(表3)進(jìn)行比較，4個因素對綜合吸附效應(yīng)指數(shù)的影響程度的相對由大到小的順序?yàn)?活性炭質(zhì)量濃度，時間，溫度，pH值。

對模型以綜合吸附效應(yīng)指數(shù)為目標(biāo)函數(shù)進(jìn)行求解，確定各變量最優(yōu)值(表4)。

表2 蘆筍多糖活性炭脫色的均勻設(shè)計試驗(yàn)結(jié)果

表3 蘆筍多糖活性炭脫色各因變量與各自變量標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)關(guān)系

2.4 蘆筍多糖活性炭脫色驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在活性炭的質(zhì)量濃度為25 g/L，時間60 min，溫度80℃，pH值為5.6最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，綜合指標(biāo)為0.682 4(脫色率為67%，脫蛋白率89%，多糖保留率56%)，與模型所得的目標(biāo)函數(shù)(0.655 8)誤差為3.9%，認(rèn)定該模型有效。

表4 蘆筍多糖活性炭脫色最佳提取條件

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，以活性炭為脫色劑，考察活性炭用量、時間及溫度等因素對多糖脫色效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素影響順序由大到小依次為:活性炭的質(zhì)量濃度，時間，溫度，pH值。其最佳脫色工藝條件為:活性炭的質(zhì)量濃度25 g/L，時間60 min，溫度80℃，pH值為7.0。在此條件下，脫色率為67%，脫蛋白率89%，多糖保留率56%，綜合吸附效應(yīng)指數(shù)為68.24%。我國蘆筍資源豐富，且其具有較高的營養(yǎng)價值?；钚蕴糠üに嚭唵?、成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)的需要，研究其脫色工藝對于蘆筍多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)，確保蘆筍保健食品的原料供給充足和高品質(zhì)。

［1］ 陳旋，張翼，張劍波.植物多糖的研究進(jìn)展［J］.中國新藥雜志，2007，16(13):1 000-1 005.

［2］ 孫春艷，趙伯濤，郁志芳，等.蘆筍的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國野生植物資源，2004，23(5):1-5.

［3］ Mabel MJ，Sangeetha P T，Hatel K，et a1.Physicochemical characterization of fructooligosaccharides and evaluation of their suitability as a potential sweetener for diabe tics［J］.Carbohydrate Research，2008，343(1):56-66.

［4］ Kooh N，Jeong H J，Choi JY，et al.Inhibition of tumor necrosisfactorα-induced apoptosis by Asparagus cochinchinensis in Hep G2cells［J］.Journal of Ethnopharmacology，2000，73(1/2):137-143.

［5］ 盧國勇，孟江，廖華衛(wèi).魚腥草多糖雙氧水脫色工藝研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22(3):671-673.

［6］ 孔凡利，張名位，于淑娟，等.荔枝多糖活性炭脫色方法研究［J］.食品科技，2008(6):115-117.

［7］ Bradford MM.Arapid and sensitivemethod for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72(7):248-254.

［8］ 鐘方曉，任海華，李巖.多糖含量測定方法比較［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(8):1 916-1 917.