張明哲，陳吳健，張曉峰，陳笑梅，陳 曦，吳 蓉

酶連接探針雜交芯片特異性檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系

張明哲1，陳吳健1，張曉峰2，陳笑梅2，陳 曦1，吳 蓉3

（1.浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016；2.浙江出入境檢驗檢疫局，浙江 杭州 310016；3.杭州出入境檢驗檢疫局，浙江 杭州 310012）

酶連接探針雜交芯片是一種基于連接酶催化的探針雜交芯片技術(shù)，其原理是采用硫代引物保護法，利用Lambda DNA外切酶將多重聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物切割成單鏈。在氨基修飾的芯片上固定5’端探針，并與制備的產(chǎn)物單鏈進行雜交，加入熒光修飾的第2個探針與之前的探針進行酶連接反應(yīng)，從而實現(xiàn)高特異性、高通量檢測。結(jié)果表明：酶連接探針雜交芯 片技術(shù)檢測4 種轉(zhuǎn)基因水稻品系特異性好，靈敏度可達0.1%（m/m），可以應(yīng)用于進出口檢驗檢疫、食品安全監(jiān)測等領(lǐng)域。

酶連接探針雜交芯片；轉(zhuǎn)基因水稻；品系檢測

近年來，隨著各個國家對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實行檢驗檢疫和標識制度管理的加強，轉(zhuǎn)基因米制品一直是歐盟和其他一些國家關(guān)注的重點。2006年9月以來，已有法國、德國、意大利、奧地利和日本等7個國家因為轉(zhuǎn)基因大米污染對我國出口米制品采取了拒絕入境或撤架、召回等措施。歐盟在2008年4月15日起對中國出口的大米及其米制品采取保障性措施，要求由中方認可的實驗室對出口產(chǎn)品實施檢測，并出具統(tǒng)一的衛(wèi)生證書才能出口[1]。另一方面，我國對轉(zhuǎn)基因作物培育的投入也逐年增加，近年來具有良好生長性能的轉(zhuǎn)基因新品種不斷涌現(xiàn)，2009年農(nóng)業(yè)部審放了轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻“Bt汕優(yōu)63”等3個轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的安全證書[2]，因此加強進出口領(lǐng)域轉(zhuǎn)基因水稻品系檢測成為新的研究熱點。

轉(zhuǎn)基因品系特異性檢測[1]是通過分析外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實現(xiàn)的，由于每一個轉(zhuǎn)基因植物品系都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是低拷貝的，品系特異性檢測方法具有高度特異性和準確性，因此品系特異性檢測已經(jīng)成為目前轉(zhuǎn)基因檢測研究的重點。

以聚合酶 鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為代表的傳統(tǒng)檢測技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中已有了很大發(fā)展[3-5]，如轉(zhuǎn)基因水稻Bt63[6]、LLRICE62[7]、LLRICE601[7]、科豐6號[8]，轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2[9-11]，轉(zhuǎn)基因玉米MON531[12]、MON1445[12]、MON810[13-14]、Bt11[15-16]、GA21[17]、MON863[18-19]、T25[20]、NK603[21]、CBH351[22]和轉(zhuǎn)基因油菜GT73[23]等，但是這些方法大部分都是以單品系檢測為主。隨著轉(zhuǎn)基因品系的不斷增多，PCR檢測技術(shù)已經(jīng)無法滿足轉(zhuǎn)基因高通量檢測的需求[24-25]。

傳統(tǒng)的芯片檢測技術(shù)一般只做1次雜交，而且由于雜交的局限性，如探針設(shè)計不合理、退火溫度過低、洗滌條件不嚴格等情況，可能會出現(xiàn)非特異性雜交，導(dǎo)致芯片的背景信號高、出現(xiàn)大量假陽性現(xiàn)象。針對這種情況，本研究建立了一種高特異性的酶連接探針雜交芯片技術(shù)并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻品系檢測。酶連接探針雜交芯片是一種基于連接酶催化的探針雜交芯片技術(shù)，其原理是采用硫代引物保護法，利用Lambda DNA外切酶將多重PCR產(chǎn)物切割成單鏈。在氨基修飾的芯片上固定5’端探針，并與制備的產(chǎn)物單鏈進行雜交，加入熒光修飾的第2個探針與之前的探針進行酶連接反應(yīng)，從而實現(xiàn)高特異性、高通量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因水稻品系Bt汕優(yōu)63、科豐6號為中國檢驗檢疫科學(xué)研究院饋贈；轉(zhuǎn)基因水稻品系LLRICE62、LLRICE601，轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21、Bt176，轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40-3-2，轉(zhuǎn)基因油菜籽品系GT73、T45 歐洲標準局；非轉(zhuǎn)基因水稻、大豆和油菜籽購自國內(nèi)市場。

DNeasy Plant Mini Kit DNA提取試劑盒凱杰生物技術(shù)有限公司；引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成；dNTP、Buffer、TaqDNA聚合酶、內(nèi)切酶寶生物工程（大連）有限公司；無水乙醇、異丙醇、NaOH（均為分析純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall micro21R臺式冷凍離心機、Nano Drop 3300核酸測定儀、MAXQ6000搖床 美國Thermo Scientific公司；S-1000 PCR儀 美國BioRad公司；Imager HP核酸電泳及凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha公司；HS-800D數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；XS104電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Pixsys5500點樣儀 美國Cartician Tech公司；LS300掃描儀 瑞士Tecan集團公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；真空泵Auto Science公司；HR2860研磨機 荷蘭Philips公司。

1.3 方法

1.3.1 材料制備

將轉(zhuǎn)基因水稻Bt汕優(yōu)63、科豐6號、LLRICE62、LLRICE601研磨至粉末狀（0.2 mm左右），并按表1混合轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的材料，分別獲得含量為5%、1%、0.1%、0.01%（m/m）的轉(zhuǎn)基因樣品。

表1 樣品制備Table 1 Sample preparation

1.3.2 DNA提取

取100 mg上述制備樣品，置于1.5 mL離心管中；加入裂解液及RNA酶后65 ℃水浴30 min；冰上極冷后20 000×g離心5 min取上清液；加入濾柱1（QIAshredder maxi spin column）20 000×g離心2 min后取下清液；與1.5 倍體積洗脫緩沖液1（Buffer AP3/E）混勻后，加入濾柱2（DNeasy maxi spin column）中，6 000×g離心1 min棄下清液；加入洗脫液2（Buffer AW），20 000×g離心2 min；將濾柱2置于1.5 mL離心管中，加入溶解液，室溫孵育5 min后6 000×g離心1 min；得到純化DNA，測定濃度。

1.3.3 引物和探針

實驗所用的引物來自于文獻[26]，探針由本實驗室設(shè)計合成。探針分為固定探針和雜交探針，其中固定探針進行氨基修飾并固定在芯片上，雜交探針則進行磷酸-Cy3修飾。由于涉及到專利和知識產(chǎn)權(quán)保護，引物和探針序列在本實驗中不公開。

1.3.4 多重PCR擴增

以轉(zhuǎn)基因樣品中提取的DNA為模板，同時加入多對引物進行復(fù)合PCR擴增，對復(fù)合PCR各引物添加量、Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶用量進行優(yōu)化，建立最優(yōu)反應(yīng)模式。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.5 DNA芯片制備及DNA雜交

點樣固定模板：在醛基片上點樣固定 陽性探針（15 ?mol/L）及氨基修飾的探針（30 ?mol/L）。水化8 h，70 ℃干燥2 h，分別用2×檸檬酸緩沖液、0.5%十二烷基硫酸鈉洗液洗2 次，每次5 min，水洗2 次，每次5 min，吹干芯片于4 ℃保存，備用。

產(chǎn)物酶切：取約8 ?g多重PCR產(chǎn)物進行酶切以制備單鏈產(chǎn)物。酶切體系：8 ?g PCR產(chǎn)物、1 ?L Lambda E酶（DNA外切酶）、5 ?L 10×buffer、水補足至50 ?L。同時設(shè)對照組，37 ℃酶切。72 ℃滅活0.5 h，加入40 ?L異丙醇后離心純化，取上清液。

單鏈產(chǎn)物雜交：將單鏈產(chǎn)物與雜交液混合后與探針陣列雜交。48 ℃孵育30 min，室溫靜置10 min。用洗液洗5 min，水洗5 min，吹干，待用。

雜交探針：將終濃度為2.5 ?mol/L的探針與雜交液混合后，取1 ?L與探針陣列雜交。48℃孵育30 min，室溫靜置10 min。用洗液洗5 min，水洗5 min，吹干，待用。

酶連及NaOH處理：采用T4連接酶反應(yīng)體系，室溫孵育60 min；0.3 mol/L NaOH室溫洗滌芯片5 min，用洗液洗5 min，水洗5 min，吹干，掃描雜交結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性分析

利用醛基片PCR芯片檢測不同的轉(zhuǎn)基因水稻品系Bt汕優(yōu)63、科豐6號、LLRICE62、LLRICE601，并應(yīng)用轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21、Bt176、轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40-3-2、轉(zhuǎn)基因油菜籽品系GT73、T45進行特異性分析，結(jié)果如圖1所示。圖1A中1、2、12號位點出 現(xiàn)陽性信號，分別對應(yīng)為大米內(nèi)源基因GOS、Bt汕優(yōu)63品系和陽性對照，其余位點均為陰性。其他水稻品系（圖1B～D）只在其1、12號位點和對應(yīng)的品系位點出現(xiàn)陽性雜交信號。因此，酶連接探針雜交芯片技術(shù)檢測4 種轉(zhuǎn)基因水稻品系的特異性較好，同時背景信號值和特異信號值均比較穩(wěn)定，檢測結(jié)果準確可靠。

圖1 酶連接探針雜交芯片檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系的特異性分析Fig.1 Specificity of the enzyme-linked probe hybridization chip for different genetically modified plants

2.2 靈敏度

圖2 酶連接探針雜交芯片檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系的靈敏度分析Fig.2 Sensitivity of the enzyme-linked probe hybridization chip for different genetically modified contents

在本實驗中，利用酶連接探針雜交芯片進行靈敏度分析，檢測結(jié)果如圖2所示，GOS基因的信號值基本穩(wěn)定，能有效滿足芯片靈敏度檢測的需要。而對Bt汕優(yōu)63品系的基因檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因含量為5%、1%、0.1%的樣品均有陽性信號出現(xiàn)，含量為0.01%的樣品無陽性信號出現(xiàn)。3 次重復(fù)檢測顯示，0.1%的檢測結(jié)果基本穩(wěn)定，與其他3個品系基因芯片檢測結(jié)果相似，因此認為本實驗中酶連接探針雜交芯片的靈敏度為0.1%。

3 討 論

本研究通過2 次雜交，使得只有與2 條探針都匹配的序列才能雜交，然后通過T4 DNA連接酶形成磷酸二酯鍵，再通過NaOH變性洗滌，就能夠把所有未形成磷酸二酯鍵以及非特異性雜交的片段都洗去，從而保證了檢測的特異性。本研究建立的酶連接探針檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系的檢測方法特異性好，靈敏度達到0.1%，可以在進出口檢驗檢疫、食品安全監(jiān)測等領(lǐng)域進行應(yīng)用。

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Event-specific Detection of Genetically Modified Rice Using Enzyme-Linked Probe Hybridization Chip

ZHANG Ming-zhe1, CHEN Wu-jian1, ZHANG Xiao-feng2, CHEN Xiao-mei2, CHEN Xi1, WU Rong3
(1. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Hangzhou 310016, China; 2. Zhejiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hangzhou 310016, China; 3. Hangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hangzhou 310012, China)

The enzyme-linked probehybridization chip is a method based on ligase-hybridizing probe chip technology with the principle of using thio-primers for protection, and using Lambda DNA exonuclease to cut multiple PCR amplicons into single products. 5’-End probe chain is fi xed in the amino-modified chip, and hybridized with the single-chain product by adding the fl uorescent-modif i ed probe for the enzyme-linked reactions with the anterior probe in order to achieve highly specif i c, parallel and high-throughput detection. In this study, the enzyme-linked probe hybridization chip could effectively detect genetically modif i ed rice with high specif i city and the sensitivity limit was 0.1%. This chip can be used by the entryexit inspection and quarantine authorities and be applied for food safety testing.

enzyme-linked probe hybridization chip; genetically modified rice; event-specific detection

Q783

A

1002-6630（2014）08-0222-04

10.7506/spkx1002-6630-201408044

2013-07-31

浙江省科技廳重大科技專項重點農(nóng)業(yè)項目（2011C12023）；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2011IK249）；

浙江省科技廳公益性項目（2011C22065）；浙江出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（ZK200958）

張明哲（1982—），男，高級農(nóng)藝師，博士，研究方向為分子生物學(xué)和植物檢疫。E-mail：mzzhang429@163.com