徐富勇，孟 瑋，劉仁榮,*，徐 玲，裘雪梅，朱立鑫

（1.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330029）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇模擬表位的2 種融合蛋白的表達(dá)及其在無毒酶聯(lián)免疫吸附方法中的應(yīng)用

徐富勇1,2，孟 瑋1，劉仁榮1,*，徐 玲1，裘雪梅1，朱立鑫1

（1.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330029）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）的模擬表位（CDON），是從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中淘選出來的七肽，可模擬DON與抗DON抗體結(jié)合。為了在酶聯(lián)免疫吸附方法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）中用重組蛋白替代DON偶聯(lián)物，以期開發(fā)出能代替偶聯(lián)DON人工抗原的無毒檢測DON的ELISA方法，通過構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-CDON和pC89S4-CDON，并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分別表達(dá)和純化GST-CDON和pⅧ-CDON融合蛋白，比較測定2 種融合蛋白與抗DON抗體的結(jié)合效果。ELISA方陣滴定結(jié)果顯示：純化的融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。在間接競爭性ELISA中，當(dāng)以融合蛋白GST-CDON為包被抗原時，檢測限為31 ng/mL，線性范圍為31～500 ng/mL，IC50為194 ng/mL，加標(biāo)回收率為54.1%～65.4%，變異系數(shù)為6.28%～13.37%；當(dāng)以融合蛋白pⅧ-CDON為包被抗原時，檢測限為15 ng/mL，線性范圍為15～500 ng/mL，IC50為94 ng/mL，加標(biāo)回收率為81.7%～89.0%，變異系數(shù)為3.15%～7.55%。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；模擬表位；質(zhì)粒；噬菌粒

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又稱嘔吐毒素，是一種由鐮刀菌在寄主植物上生長過程中產(chǎn)生的雪腐鐮刀菌烯醇的脫氧衍生物[1]。已有研究證明，DON對人體和動物具有多種危害，包括對基因表達(dá)的影響[2-3]、對細(xì)胞的毒性[4-5]、對胚胎的毒性[6-7]以及對免疫系統(tǒng)的影響[8]等。DON可廣泛污染小麥和玉米等谷物，使用這些被污染的原材料加工成的食品和飼料對人類和動物的安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[9]。有數(shù)據(jù)顯示在北美[10]、中東非洲[11-12]、亞洲[13-14]和歐洲[15-16]等地均有DON的自然產(chǎn)生，可見DON的污染已經(jīng)遍及全球，因此預(yù)防及檢測DON的工作顯得尤為緊迫。

目前常用的檢測DON的方法有氣相色譜法[17-18]、高效液相色譜法[19-20]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-22]等，但這些方法都存在操作復(fù)雜、成本高和不能進(jìn)行便攜性檢測等問題。酶聯(lián)免疫吸附劑方法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）由于具有檢測速度快、靈敏度高、可定量、操作簡便和成本低等特點[23]，是一種有希望用于方便快速檢測DON的方法，但傳統(tǒng)ELISA方法中需要使用DON標(biāo)準(zhǔn)品合成人工抗原，由于DON對人體的危害性以及其標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴、獲取困難等原因，使得其推廣使用受到限制[24]。因此開發(fā)出一種能模擬DON反應(yīng)原性，以代替DON進(jìn)行檢測的無毒物質(zhì)十分必要。DON模擬表位具有無毒和低成本的特性，為解決上述問題提供了新的思路。本實驗在鄧舜洲等[17]成功淘選的DON模擬表位肽（CMRPWLQ，命名為CDON）的基礎(chǔ)上，利用質(zhì)粒pGEX-4T-1和噬菌粒pC89S4，構(gòu)建2種重組表達(dá)載體，表達(dá)GST-CDON融合蛋白以及展示有pⅧ-CDON融合蛋白的噬菌體顆粒，結(jié)合ELISA測定方法，驗證表達(dá)的融合蛋白的反應(yīng)原性，并進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，以期開發(fā)出DON人工抗原的替代品，并建立無毒的DON ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）和XL1-Blue來自本實驗室保存菌種；質(zhì)粒pGEX-4T-1為本實驗室自有，大小為4 969 bp，含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，具有氨芐青霉素抗性基因；噬菌粒pC89S4由第三軍醫(yī)大學(xué)萬瑛教授惠贈，大小為3 469 bp，含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，具有氨芐青霉素抗性基因；GST-resin上海點創(chuàng)生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG 美國Sigma公司；DON抗體由南昌大學(xué)許楊教授惠贈。

LB培養(yǎng)基：每1 L含10 g胰化蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl，pH 7.0。

Super Optimal broth with Catabolite Repression（SOC）培養(yǎng)基：每1 L含有20 g胰化蛋白胨、5 g酵母提取物、0.5 g NaCl、0.19 g KCl、3.6 g葡萄，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

Wellwash versa洗板機(jī)、Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司；Milli-Q Synthesis超純水制備儀美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 原核表達(dá)載體pGEX-CDON及pC89S4-CDON的構(gòu)建

DON模擬表位肽為CMRPWLQ，對應(yīng)堿基序列TGTATGCGGCCTTGGCTTCAG。分別在其5’末端加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的4堿基黏性末端，由此設(shè)計并合成寡核苷酸單鏈T11和T12；另外在其5’末端分別加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的4堿基黏性末端序列，設(shè)計并合成T13和T14。

T11：5’-GATCCTGCATGCGTCCTTGGCTCCAGC-3’

T12：5’-TCGAGCTGGAGCCAAGGACGCATGCAG-3’

T13：5’-AATTCTGCATGCGTCCTTGGCTCCAG-3’

T14：5’-GATCCTGGAGCCAAGGACGCATGCAC-3’

將T11、T12、T13和T14加dd H2O分別配成20 nmol/mL的寡核苷酸單鏈溶液，取T11和T12各10 μL混勻，置于PCR儀中，99 ℃保溫5 min后緩慢降至室溫，得到雙鏈T11、T12，-20 ℃保存。同方法制得雙鏈T13、T14，-20 ℃保存。取5 μL pGEX-4T-1質(zhì)粒，加入11 μL dd H2O、2 μL酶切緩沖液、BamHⅠ和XhoⅠ各1 μL，混勻后37 ℃雙酶切4 h，按照PCR純化試劑盒所述步驟純化酶切產(chǎn)物。取5 μL pC89S4噬菌粒同法純化酶切產(chǎn)物。T11、T12與雙酶切后的pGEX-4T-1在T4 DNA連接酶作用下16℃連接8 h，乙醇沉淀法純化，連接液全量電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，加入SOC培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)1.5 h后涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素（Amp）的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落用于擴(kuò)增細(xì)胞、質(zhì)粒提取。提取的質(zhì)粒依次用Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ進(jìn)行單酶切，時間3 h，之后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。T13、T14與雙酶切后的pC89S4在T4 DNA 連接酶作用下16℃連接8 h，乙醇沉淀法純化，連接液全量電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，加入SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1.5 h后涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素及40 μg/mL四環(huán)素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落用于擴(kuò)增細(xì)胞、質(zhì)粒提取。提取的質(zhì)粒依次用Xba Ⅰ、EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行單酶切，時間3 h，之后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。經(jīng)酶切驗證正確的重組質(zhì)粒送上海生工測序。

1.3.2 GST-CDON融合蛋白表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pGEX-CDON轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21（DE3）后，劃線接種至含50 μg/mL Amp的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)至單菌落長出，挑取單菌落接種至20 mL（50 μg/mL Amp）LB液體培養(yǎng)中。37℃、220 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期后，按1%接種量接種至250 mL LB（50 μg/mL Amp）培養(yǎng)液中， OD600nm達(dá)到0.6后加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）至終濃度為1 mmol/L，于25℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，用10 mL冰上預(yù)冷過的GST裂解緩沖液重懸菌體。冰浴超聲破碎細(xì)胞，超聲后菌液于4 ℃、13 000 r/min離心30 min。收集上清液即為GST-CDON融合蛋白的粗提液，使用GST-resin純化GSTCDON，用6 mL含6 mmol/L還原型谷胱甘肽的洗脫緩沖液洗脫融合蛋白，粗提液和洗脫液同時進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。

SDS-PAGE選用12%的分離膠和5%的濃縮膠，取10 μL樣品加10 μL 2×SDS上樣緩沖液，在沸水中加熱3～5min后取出置于冰上冷卻；加樣后調(diào)節(jié)電流至10 mA，待樣品接觸分離膠后，調(diào)節(jié)電流至30 mA，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶遷移至距離凝膠底端約1 cm時即可停止電泳；將膠從玻璃板中取出后置于盛有染色液的培養(yǎng)皿中，染色1 h，倒入脫色液，1 h換液1 次，直至膠的背景清晰，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄實驗結(jié)果。

采用Bradford法測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。取10支試管，0號為空白，1～6號作標(biāo)準(zhǔn)曲線，7～9為洗脫液。往各試管中分別加入0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL 1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，然后補(bǔ)充去離子水至0.1 mL。最后往各試管中加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250。4 min后測定各樣品在595 nm波長處的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度A595nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度，計算出樣品的蛋白質(zhì)含量。分別以純化的20、10、5、2.5 μg/mL GST-CDON融合蛋白為包被抗原、磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）包被為空白對照，用ELISA方法測定其與稀釋度為1∶200 0的抗DON抗體的結(jié)合能力。

1.3.3 pⅧ-CDON融合蛋白表達(dá)及純化

將重組噬菌粒pC89S4-CDON轉(zhuǎn)化感受態(tài)XL1-Blue后，劃線接種至含50 μg/mL Amp的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)至單菌落長出，挑取單菌落接種至20 mL（50 μg/mL Amp）LB液體培養(yǎng)中。37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.3，加入KM13輔助噬菌體超感染，37℃靜置水浴30 min。按1%接種量接種至250 mL LB（50 μg/mL Amp）培養(yǎng)液中，OD600nm達(dá)到0.6后加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，于25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)液于4℃、5 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入總體積1/6的200 g/L聚乙二醇8000、2.5 mol/L NaCl溶液，冰浴1 h。再于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用2 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖鹽溶液（tris buffer saline，TBS）（pH 7.5）溶解后，加入總體積1/6的200 g/L聚乙二醇8000、2.5 mol/L NaCl溶液，冰浴1 h，于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用2 mL 50 mmol/L TBS（pH 7.5）溶解后再于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，收集上清液。Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，并分別以20、10、5、2.5 μg/mL純化的pⅧ-CDON融合蛋白為包被抗原、PBS包被為空白對照，用ELISA方法測定其與稀釋度為1∶2 000的抗DON抗體的結(jié)合能力。

1.3.4 ELISA方陣滴定實驗

將純化后的GST-CDON和pⅧ-CDON融合蛋白用PBS稀釋至20、10、5、2.5 μg/mL，分別取100 μL加至酶標(biāo)板中，0.01 mol/L的PBS作為陰性對照，于37℃恒溫箱中孵育2 h。以PBS-T20為清洗液，洗板機(jī)洗板3 次，5%脫脂乳37 ℃條件下封閉1 h。PBS-T20洗板4 次，加入100 μL稀釋度為1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000的抗DON抗體，于37 ℃恒溫箱中孵育45 min。然后PBS-T20洗板4 次，加入100 μL 1∶3 000的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，37 ℃孵育45 min。接著用PBS-T20洗板5 次，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液顯色10 min后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定其在450 nm波長處的吸光度。

1.3.5 間接競爭ELISA及標(biāo)準(zhǔn)曲線

將GST-CDON和pⅧ-CDON融合蛋白用PBS稀釋至滴定好的濃度，分別取100 μL加至酶標(biāo)板中，0.01 mol/L的PBS作為陰性對照，于37 ℃恒溫箱中孵育2 h。使用PBS-T20洗板3 次，加入5%脫脂奶粉320 μL，于37 ℃恒溫箱中封閉1 h。使用PBS-T20洗板3 次，分別加入質(zhì)量濃度為1 000、500、250、125、62.5、31、25 ng/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，再加入50 μL滴定至稀釋度的抗DON抗體，于37 ℃恒溫箱中孵育45 min。使用PBS-T20洗板4 次，加入100 μL稀釋度為1∶4 000的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，于37 ℃恒溫箱中孵育45 min。使用PBS-T20洗板5 次。TMB顯色液顯色10 min后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測定450 nm波長處的吸光度。按下式計算結(jié)合率：

式中：A為添加有DON標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度；A0為未加DON標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度；A1為陰性對照的吸光度。

以DON標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，繪制以融合蛋白GST-CDON和pⅧ-CDON作為包被抗原的競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 樣品加標(biāo)回收率的測定

稱取6 份陰性玉米粉樣品各5 g，添加DON標(biāo)準(zhǔn)品分別為100、200、400、800、1 600、3 200 ng/g。使用去離子水提取樣品中的DON，混勻10 min。樣品于10 000 r/min離心10 min后收集上清液，用已建立的間接競爭ELISA方法測定每份上清中的DON含量，每份樣品重復(fù)測定3 次，計算其平均加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體pGEX-CDON的構(gòu)建

退火寡核苷酸鏈與質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接純化后，電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。從單菌落擴(kuò)增出來的細(xì)胞中提取重組質(zhì)粒后，用XhoⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行單酶切，酶切驗證正確的重組質(zhì)粒經(jīng)過測序，結(jié)果顯示其序列與預(yù)期一致，證明表達(dá)載體pGEXCDON構(gòu)建成功。同理證明表達(dá)載體pC89S4-CDON構(gòu)建成功。2 個重組質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1所示。

2.2 GST-CDON融合蛋白表達(dá)及純化

圖2 GST-resin純化GST-CDON融合蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the fusion protein purified by GST-resin

由圖2可知，在目的蛋白出現(xiàn)在27 ku處，與GSTCDON的預(yù)期分子質(zhì)量相符，洗脫液電泳后只有一條明顯條帶。經(jīng)Bandscan 5.0軟件分析，純化后的融合蛋白占重組菌株中對應(yīng)融合蛋白總表達(dá)量的97%，Bradford法測得蛋白質(zhì)量濃度為0.37 mg/mL。ELISA實驗證實純化后的GSTCDON融合蛋白可高效地與抗DON抗體結(jié)合（圖3）。

圖3 GST-CDON融合蛋白與抗DON抗體的結(jié)合效果Fig.3 Binding capacity of GST-CDON with anti-DON antibody

2.3 pⅧ-CDON融合蛋白表達(dá)及純化

圖4 pⅧ-CDON融合蛋白與抗DON抗體的結(jié)合效果Fig.4 Binding capacity of pⅧ-CDON with anti-DON antibody

經(jīng)測定，純化得到pⅧ-CDON融合蛋白質(zhì)量濃度為1.02 mg/mL。經(jīng)ELISA實驗證實純化后的pⅧ-CDON融合蛋白可高效地與抗DON抗體結(jié)合（圖4）。

2.4 ELISA方陣滴定實驗及標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 ELISA方陣滴定結(jié)果Table 1 Results of checkerboard titration

由表1可知，當(dāng)2 種融合蛋白的包被質(zhì)量濃度均為5 μg/mL時、抗DON抗體濃度為1∶2 000時，反應(yīng)的吸光度都符合間接競爭性ELISA的實驗要求。2 種融合蛋白包被質(zhì)量濃度相同更利于結(jié)合率及加標(biāo)回收實驗效果的比較。

圖5 間接競爭性ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curves of indirect competitive ELISA

由圖5可知，當(dāng)以融合蛋白GST-CDON為包被抗原時，間接競爭ELISA的檢測限為31 ng/mL，線性范圍為31～500 ng/mL，DON半抑制濃度（IC50）為194 ng/mL，曲線擬合回歸方程為Y=112.25-9.21（lnX）；當(dāng)以融合蛋白pⅧ-CDON為包被抗原時，檢測限為15 ng/mL，線性范圍為15～500 ng/mL，IC50為94 ng/mL，曲線擬合回歸方程為Y=114.16-15.79（lnX）。

2.5 加標(biāo)回收率

表2 GST-CDON作為包被抗原時玉米樣品DON加標(biāo)回收實驗結(jié)果Table 2 Recovery of DON from spiked corn detected by ELISA using GST-CDON as coating antigen

表2 GST-CDON作為包被抗原時玉米樣品DON加標(biāo)回收實驗結(jié)果Table 2 Recovery of DON from spiked corn detected by ELISA using GST-CDON as coating antigen

DON加標(biāo)量/（ng/g）3 2001 600800400200100平均回收率/%54.159.558.465.464.962.1標(biāo)準(zhǔn)偏差/（ng/g）7.236.763.674.484.286.44變異系數(shù)/%13.3711.356.286.856.6010.37

如表2所示，GST-CDON作為包被抗原時，玉米樣品DON的平均回收率為54.06%～65.4%，變異系數(shù)為6.28%～13.37%。pⅧ-CDON作為包被抗原時，玉米樣品DON的回收率為81.7%～89.0%，變異系數(shù)為3.15%～7.55%（表3）。DON加標(biāo)量/（ng/g）3 2001 600800400200100

表3 pⅧ-CDON作為包被抗原時玉米樣品DON加標(biāo)回收實驗結(jié)果Table 3 Recovery of DON from spiked corn detected by ELISA using pⅧ-CDON as coating antigen

3 結(jié) 論

本研究在成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-CDON及重組噬菌粒pC89S4-CDON作為表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，成功表達(dá)了2 種融合蛋白GST-CDON和pⅧ-CDON。pGEX-4T-1載體可表達(dá)融合蛋白中的GST標(biāo)簽，外源蛋白與GST形成的融合蛋白可以通過偶聯(lián)有谷胱甘肽的樹脂和瓊脂糖等材料進(jìn)行純化，本實驗利用GST-resin純化的融合蛋白純度可達(dá)到97%。噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)勢是能夠?qū)⒍嚯牡谋硇图捌浠蛐徒⒅苯訉?yīng)關(guān)系，即將外源DNA通過分子克隆技術(shù)插入到適當(dāng)?shù)氖删w載體上，使外源DNA對應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)。在絲狀噬菌體展示系統(tǒng)的10 種衣殼蛋白中，表達(dá)的融合蛋白通常展示于噬菌體衣殼蛋白pⅧ或pⅢ上。pC89S4是一種噬菌粒，它是集合了質(zhì)粒和絲狀噬菌體的有利特征于一體的載體，帶有M13和質(zhì)粒的復(fù)制起始位點，在輔助噬菌體KM13的幫助下，裝配成重組噬菌體顆粒。

ELISA方陣滴定結(jié)果顯示表達(dá)的2 種融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性，同時滴定結(jié)果也顯示，在包被質(zhì)量濃度及抗體濃度相同的情況下，pⅧ-CDON融合蛋白與抗DON抗體的結(jié)合效果要優(yōu)于GST-CDON。由于pⅧ蛋白在噬菌體上的拷貝數(shù)高，因此在重組噬菌體上高密度展示融合蛋白的反應(yīng)原性更好，而GST-CDON融合蛋白在表達(dá)過程中容易形成包涵體，超聲破碎菌體時亦會使部分蛋白失活，也降低了其反應(yīng)原性。間接競爭性ELISA中，當(dāng)以融合蛋白GST-CDON為包被抗原時，檢測限為31 ng/mL，線性范圍為31～500 ng/mL，IC50為194 ng/mL，加標(biāo)回收率為54.1%～65.4%，變異系數(shù)為6.28%～13.37%；當(dāng)以融合蛋白pⅧ-CDON為包被抗原時，檢測限為15 ng/mL，線性范圍為15～500 ng/mL，IC50為94 ng/mL，加標(biāo)回收率為81.7%～89.0%，變異系數(shù)為3.15%～7.55%。由此可以得出，相比于GST-CDON，pⅧ-CDON與抗體反應(yīng)的靈敏度更高、特異性也更好，但目前的研究結(jié)果顯示加標(biāo)回收率偏低，可能是由于融合蛋白的構(gòu)象在包被和洗板的過程中有所變化，造成與抗體的結(jié)合性能改變引起的。因此擬進(jìn)一步優(yōu)化抗原的包被條件，并篩選穩(wěn)定蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定劑，在方法成熟后進(jìn)行實際樣品的測定和比較，以期研制出更適用于作為DON人工抗原的替代品，建立無毒素的免疫學(xué)檢測方法。

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Application in Non-Toxic ELISA of Expression of Deoxynivalenol Mimotope Fusion Protein

XU Fu-yong1,2, MENG Wei1, LIU Ren-rong1,*, XU Ling1, QIU Xue-mei1, ZHU Li-xin1
(1. School of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China; 2. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330029, China)

Deoxynivalenol (DON) mimotope, designated as CDON, is a mimicking epitope (CMRPWLQ) screened from a phagedisplayed random peptide library. In order to replace DON conjugated toxin with non-toxic recombinant protein in ELISA, two novel expression vectors, which were designated as plasmid pGEX-CDON and phagemid pC89S4-CDON, were used to produce GST-CDON and pⅧ-CDON fusion proteins in E. coli. After purification, both GST-CDON and pⅧ-CDON fusion proteins showed good reactogenicity with an anti-DON antibody in a competitive inhibition ELISA test. When GST-CDON was used as coating antigen, the linear range of the competitive inhibition ELISA was 31–500 ng/mL with an IC50value of 194 ng/mL, and spiked recoveries were 54.1%–65.4%, with coefficient of variation of 6.28%–13.37%. The detection limit was 31 ng/mL. Upon using pⅧ-CDON as coating protein, the linear range of the competitive inhibition ELISA was 15–500 ng/mL with an IC50value of 94 ng/mL, and spiked recoveries were 81.7%–89.0%, with coefficient of variation of 3.15%–7.55%. The detection limit was 15 ng/mL. ELISA analysis and comparison showed that the reactogenicity and specificity of pⅧ-CDON binding to anti-DON antibody were better than that of GST-CDON fusion protein. Therefore, pⅧ-CDON is promising for establishing an ELISA without the application of the toxic mycotoxin conjugate.

deoxynivalenol; mimotope; plasmid; phagemid

Q819

A

1002-6630（2014）08-0198-06

10.7506/spkx1002-6630-201408039

2013-07-04

江西省自然科學(xué)基金項目（20122BAB214006）；江西省教育廳科技項目（GJJ13573）

徐富勇（1987—），男，碩士，研究方向為生物轉(zhuǎn)化與加工。E-mail：xfyong@sina.com

*通信作者：劉仁榮（1969—），男，教授，博士，研究方向為生物技術(shù)。E-mail：lilirenrong@hotmail.com