李維前，劉 霞，張守成

（1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院病理科，江蘇 徐州 221003；2.徐州市沛縣人民醫(yī)院病理科，江蘇 徐州 221600）

· 繼續(xù)教育 ·

去乙?；敢种苿?duì)乳腺癌細(xì)胞周期作用及分子機(jī)制的探討

李維前1，劉 霞1，張守成2

（1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院病理科，江蘇 徐州 221003；2.徐州市沛縣人民醫(yī)院病理科，江蘇 徐州 221600）

目的研究去乙酰化酶抑制劑（MS-275）對(duì)乳腺癌細(xì)胞（MCF7）周期的作用及機(jī)制。方法0.5、1.0、1.5 μmol/L MS-275作用MCF7細(xì)胞24 h，用噻唑藍(lán)（MTT）觀察不同濃度MS-275對(duì)MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)及周期；Westernblotting檢測(cè)MS-275對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果1.0 μmol/L濃度的MS-275對(duì)MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，1.0 μmol/L濃度以上明顯誘導(dǎo)阻滯乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞周期，明顯增加p21，p27基因的表達(dá)，明顯降低 CCND1、CDK4D基因的表達(dá)。結(jié)論一定劑量的MS-275抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)，可通過(guò)調(diào)控多個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞阻滯的發(fā)生與p21，p27基因表達(dá)的增加及CCND1、CDK4D基因表達(dá)的減少相關(guān)。

去乙?；敢种苿患?xì)胞周期；基因的表達(dá)；乳腺癌細(xì)胞

MS-275對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期作用的報(bào)告現(xiàn)有報(bào)道，本研究主要觀察MS-275對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞周期的影響，探討MS-275 對(duì)MCF7細(xì)胞周期發(fā)揮作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

MS-275、RPMI-1640、ECL顯色試劑盒購(gòu)買于北京中杉公司；P21，P27，CyclinD1鼠抗人單抗、抗CDK4多抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz；流式細(xì)胞儀、蛋白垂直電泳儀購(gòu)買美國(guó)Bio-Rad公司；乳腺癌細(xì)胞株MCF7由徐州醫(yī)學(xué)院病理生理教研室提供 。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF7細(xì)胞接種在RPMI-1640培養(yǎng)液（10﹪胎牛血清，青霉素、鏈霉素100U/mL），37℃、5%CO2孵箱內(nèi)貼壁傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞處理后分組，實(shí)驗(yàn)組分為0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275。對(duì)照組為等濃度的二甲基亞砜（DMSO）。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率

分組：A組試驗(yàn)組，分別給予0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275作用，B組設(shè)計(jì)為空白對(duì)照組。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)MCF7細(xì)胞周期

MCF7細(xì)胞單純用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)24 h后，依照設(shè)計(jì)分組作用24 h，PBS洗滌3次，70%的冷乙醇4℃以下凍存固定24 h，離心后棄乙醇（3000 r/min，10 min），再加入1 mL PBS制成細(xì)胞懸液固定后，加入RnaseA酶（終濃度為10 μg/mL），常溫放置30 min，用 50 μg/mL的 PI（碘化丙啶）染色，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行MCF7周期細(xì)胞檢測(cè)。

1.5 Western-blotting檢測(cè)P21、P27、CyclinD1、CDK4D蛋白的表達(dá)

Western-blotting檢測(cè)MCF7腫瘤細(xì)胞表面各基因的表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SAS 13.1統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用REGWQ法對(duì)方差分析有顯著性差異的資料進(jìn)行多組均數(shù)間的兩兩比較。設(shè)置檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 MS-275對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖影響

M T T比色法顯示不同濃度M S-2 7 5處理MCF7細(xì)胞24 h后，與溶劑對(duì)照組相比，0.5 μmol/L MS-275組細(xì)胞的抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），1.0 μmol/L MS-275處理的細(xì)胞抑制率明顯增加，且隨著MS-275作用濃度升高而作用加強(qiáng)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度的MS-275對(duì)MCF7細(xì)胞增殖的影響（±s，n=6）

表1 不同濃度的MS-275對(duì)MCF7細(xì)胞增殖的影響（±s，n=6）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#濃度組間兩兩比較，P＜0.05

MS-275（μmol/L）抑制率（%）對(duì)照組7.2±3.24 0.57.86±0.02 1.020.04±0.31*#1.526.47±0.28*#

2.2 MS-275對(duì)MCF7細(xì)胞的周期作用

0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275作用MCF7細(xì)胞24 h，與溶劑對(duì)照組相比較，0.5 μmol/L MS-275處理組細(xì)胞的周期無(wú)明顯差異，隨著MS-275作用濃度的逐步升高阻滯在G1期的細(xì)胞明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度MS-275對(duì)MCF7細(xì)胞周期的影響

2.3 Western-blotting檢測(cè)MS-275處理MCF7細(xì)胞P21，P27,CyclinD1、CDK4D的表達(dá)變化

圖2 Western-blotting檢測(cè)MS-275作用MCF7細(xì)胞后P21、P27、CyclinD1、CDK4D蛋白的表達(dá)量變化

0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275作用MCF7細(xì)胞24 h后，與溶劑對(duì)照組比較，0.5 μmol/L MS-275處理組細(xì)胞p21，p27，CCND1、CDK4D 蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯變化，1.0 μmol/L MS-275處理的細(xì)胞p21，p27,蛋白的表達(dá)量明顯增加，且隨著MS-275作用濃度的升高而升高（P＜0.05），CCND1、CDK4D蛋白的表達(dá)量明顯減少，且隨著MS-275作用濃度的升高而下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 討 論

組蛋白去乙?；敢种苿┲饕ㄟ^(guò)控制DNA纏繞在組蛋白的松緊程度來(lái)發(fā)揮作用，而組蛋白的乙酰化酶和去乙?；钢饕峭ㄟ^(guò)組蛋白乙?；负徒M蛋白去乙?；竵?lái)實(shí)現(xiàn)[1-2]。抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡的途徑失控進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡變。組蛋白去乙?；敢种苿┛赏ㄟ^(guò)提高染色質(zhì)特定區(qū)域組蛋白乙酰化酶，選擇性地恢復(fù)腫瘤抑制因子和其它抗癌基因的表達(dá)，增強(qiáng)調(diào)控細(xì)胞凋亡、分化相關(guān)蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化，成為一類新型的抗腫瘤藥物，研究熱點(diǎn)。MS-275是苯甲酰氨類衍生物（Benzamidesderivative），最近新合成的組蛋白脫乙?；敢种苿3-4]，已被證實(shí)對(duì)部分腫瘤有效應(yīng)且已應(yīng)用在臨床實(shí)驗(yàn)中，它能選擇抑制組蛋白去乙?；?，腫瘤細(xì)胞作用強(qiáng)，在人體內(nèi)穩(wěn)定性好毒副作用相對(duì)較小，且使高度?；慕M蛋白聚集 ，也能通過(guò)微生物設(shè)計(jì)合成，實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞分裂 ，間接地抑制血管生成因子的表達(dá)，幫助阻斷對(duì)腫瘤的血液供應(yīng)進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化凋亡。

本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)MS-275 可以抑制MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)，并使 MCF7細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。并且表明0.5 μmol/L MS-275作用MCF7細(xì)胞對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，抑制率無(wú)明顯差異，1.0 μmol/L MS-275作用MCF7對(duì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)周期效應(yīng)顯著且抑制率顯著增加，表現(xiàn)出一定劑量相關(guān)性。p21 和p27是調(diào)控細(xì)胞周期至關(guān)重要的關(guān)鍵基因，位于p53基因下游的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子，p21又稱WAF1/CIP1，p27蛋白是CKI中的一種,在真核細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要的作用,是一種廣譜的周期蛋白依賴激酶抑制劑,主要通過(guò)抑制CDK的活性,來(lái)阻斷細(xì)胞周期中G1、S期的轉(zhuǎn)換,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控.同時(shí), 被認(rèn)為是細(xì)胞周期中G1期向前發(fā)展的抑制劑。介導(dǎo)了TGF誘導(dǎo)的細(xì)胞在G0/G1期的休眠且通過(guò)C端與PCNA相互作用，阻斷PCNA活化DNA聚合酶的活性達(dá)到抑制DNA的合成進(jìn)一步使細(xì)胞周期停滯，因而被認(rèn)為是一種抑癌基因。p27基因還參與了細(xì)胞分化,器官發(fā)育大小、細(xì)胞凋亡等重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑。研究已證實(shí)細(xì)胞周期進(jìn)程受到一系列Cyclin D/cdk精密調(diào)控，而P21、P27又是這個(gè)進(jìn)程中與Cyclin D/cdk形成緊密結(jié)合的關(guān)鍵基因。例如，P21結(jié)合了cdk就能抑制它的作用，抑制cdk導(dǎo)致的Rb磷酸化，CDK激酶是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要因素，是細(xì)胞周期運(yùn)行的引擎分子。目前發(fā)現(xiàn)，至少存在12種CDK激酶，即CDK1至DK12。主要生物學(xué)作用是使得細(xì)胞由分裂間期向分裂期轉(zhuǎn)化，分裂間期時(shí)內(nèi)部的轉(zhuǎn)化并以復(fù)合物形式出現(xiàn)[5-9]，同時(shí)，P27也能與Cyclin D結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的周期變化，其過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖分化紊亂最終惡變，由于組織分化程度差異致使不同腫瘤中陽(yáng)性檢出率表現(xiàn)不同，在分化較差的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量較高。在本研究中我們發(fā)現(xiàn) 1.0 μmol/L 濃度的MS-275 對(duì)MCF7細(xì)胞有明顯的抑制生長(zhǎng)效應(yīng)且具有量效關(guān)系，1.0 μmol/L濃度之上可顯著阻滯MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)乳腺癌之p21。

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Deacetylase inhibitor to breast cancer mitotic cycle function and molecularmechanism discussion

LI Wei-qian1,LIU Xia1,ZHANG Shou-cheng2
(1. Department of pathology the third affi liated hospital of xuzhou medical college, Jiangsu Xuzhou 221003,China; 2. Department of pathology peixian people’s hospital of xuzhou city,Jiangsu Xuzhou 221600,China)

Objective Study the deacetylase inhibitor MS-275 to the breast cancer MCF7 cell cycle function and the mechanism. Methos 0.5、1.0、1.5 μmol / L MS-275 affects the MCF7 cell 24 hours, observes different density MS-275 with MTT to the MCF7 cell's growth inhibitory action; flow cytometry examination cell growth and the cycle; Westernblotting examine MS-275 to the mammary gland cancer cell cycle related gene expression..Results1.0 μmol/L density MS-275 has the obvious growth inhibitory action to the MCF7 cell, and presents certain quantity effect relations, may induce the mammary gland cancer cell MCF7 mitotic cycle above the 1.0 μmol/L density to hinder obviously, may strengthen the p21, p27 gene obviously the expression, reduces CCND1, the CDK4D gene expression obviously.ConclusionCertain dosage’s MS-275 suppresses breast cancer MCF7 cell’s growth, may through regulate many mitotic cycle related gene induction mammary gland cancer cell mitotic cycle to hinder, the cell hinders occurrence and p21, p27 gene expression increase and CCND1, CDK4D gene expression reduced related.

Deacetylase inhibitor; Mitotic cycle; Gene expression; CDK4D;Breast cancer Cell

R735.1

A