吳清華，王光志，馬云桐，裴瑾，康亞蘭

·品種品質(zhì)·

烏頭根際土壤細(xì)菌群落多樣性的PCR-DGGE分析

吳清華，王光志，馬云桐，裴瑾，康亞蘭

目的：研究不同生長期烏頭根際土壤微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。方法：采用PCR-DGGE技術(shù)，研究不同產(chǎn)地不同健康狀況的烏頭根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：健康與患病烏頭根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異性，且患病植株具有能引起植物患病的病原種。結(jié)論：患病植株改變了烏頭根際土壤的微生物細(xì)菌群落多樣性，致病菌的存在導(dǎo)致了烏頭植株的患病。根際土壤的健康狀況對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，根際微生物群落結(jié)構(gòu)的不同將導(dǎo)致植物對(duì)病原菌的抗性及品種差異。

烏頭；細(xì)菌；PCR-DGGE；群落結(jié)構(gòu)

烏頭Aconitum carmichaeli Debx.為毛茛科植物，子根附子為著名的川產(chǎn)道地藥材，其性熱、味辛，有毒，具有回陽救逆，補(bǔ)火助陽，祛風(fēng)散寒等功效，在四川彰明、江油等地栽培已有近千年的歷史。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中已有記載，烏頭為散寒止痛要藥，被列為攻治疾病的重要藥物。但是烏頭在栽培過程中，病害時(shí)有發(fā)生，且嚴(yán)重影響到附子的產(chǎn)量和品質(zhì)。

土壤是人類生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，與人類息息相關(guān)。土壤為各種生物及微生物提供生存空間，而土壤微生物是土壤形成和營養(yǎng)元素循環(huán)的主題，它參與有機(jī)質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)等多個(gè)過程[1,2]；同時(shí)也是轉(zhuǎn)化植物養(yǎng)料、代謝有機(jī)物質(zhì)和降解污物的驅(qū)動(dòng)力，在土壤肥力和生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的作用[3～5]。根際區(qū)是植物體與土壤物質(zhì)、能量交換的場(chǎng)所，植物根際土壤微生物功能的差異會(huì)對(duì)植物所需營養(yǎng)物質(zhì)的提供產(chǎn)生影響，而這些物質(zhì)的供給又將會(huì)影響到植物之間的競(jìng)爭[6]。已有實(shí)驗(yàn)證明，在植物種間高度競(jìng)爭的多培養(yǎng)條件下，土壤微生物對(duì)植物生長具有強(qiáng)烈的影響[7]。其中，有益和有害微生物相互拮抗，有害菌一旦占據(jù)統(tǒng)治地位，土壤的內(nèi)在平衡被打破，很容易發(fā)生土傳病害。有些根際土壤微生物甚至能夠引起植物發(fā)病。

土壤細(xì)菌是土壤微生物的一個(gè)重要組成部分，其數(shù)量的變化對(duì)土壤養(yǎng)分和植物的生長產(chǎn)生了重要的影響，因?yàn)橥寥乐屑?xì)菌無論在分解有機(jī)質(zhì)、促進(jìn)植物生長，還是在植物病害生物防治方面都發(fā)揮著比真菌更大的作用[8]。由于土壤中可培養(yǎng)的微生物不到1%，故傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法在對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性方面存在著很大的局限性，不能客觀的反應(yīng)樣品信息，從而導(dǎo)致微生物群落大量信息的流失。近幾十年來，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是PCR-DGGE的廣泛應(yīng)用，使得微生物群落多樣性分析得到一個(gè)很大的改善和提高，人們對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)也有更全面的認(rèn)識(shí)。本研究以烏頭道地產(chǎn)地江油根際土壤為研究對(duì)象，選取2012年2、3月份健康與患病土樣，探討不同產(chǎn)地健康與患病烏頭根際土壤細(xì)菌的差異，為揭示烏頭健康與患病植株根際土壤的微生物多樣性的差異，保證烏頭的健康發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

選取四川省江油市太平鎮(zhèn)、青蓮鎮(zhèn)、九嶺鎮(zhèn)、三合鎮(zhèn)、彰明鎮(zhèn)5個(gè)產(chǎn)區(qū)。于2011年3-5月間每月中旬分別采集健康與患病植株根區(qū)5-10cm的土壤樣品。參照《農(nóng)田土壤環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》NY/ T395-2000方法，按S形布點(diǎn)采樣，每個(gè)點(diǎn)按健康與患病植株分別進(jìn)行多點(diǎn)混合，混勻后經(jīng)四分法取1kg左右保留備用。將土壤置于保鮮袋，記錄樣品信息后帶回實(shí)驗(yàn)室，去除土壤中的動(dòng)植物殘?bào)w等雜質(zhì)，將新鮮土壤樣品用于DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 土壤總DNA的提取 按照土壤提取試劑盒（OMEGA）操作步驟進(jìn)行總DNA的提取，并對(duì)提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)。

1.2.2 基因組DNA的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物對(duì)R518/F357-GC擴(kuò)增16SrDNA基因V-3區(qū)。

土壤DNA擴(kuò)增16SrDNA基因V-3區(qū)擴(kuò)增引物：F357:5`-TAC GGG AGG CAG CAG-3`

R518:5`-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3`

GC-F357:5`-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGGG TAC GGG AGG CAG CAG-3`

降落PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃變性5min；94℃變性1min，58℃1min，72℃40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.3 DGGE檢測(cè) 采用Bio-Rad Laboratories Inc對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。采用10%的聚丙烯酰胺制備梯度為30%～65%的變性劑。PCR產(chǎn)物每孔加樣15μL，在恒溫60℃，120V電泳300min[9]。電泳結(jié)束后，對(duì)凝膠進(jìn)行銀染顯色，拍照。切膠回收目的條帶DNA，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，最后將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物委托大連寶生物有限公司測(cè)序。

將測(cè)序所得序列在NCBI的Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，并將所測(cè)細(xì)菌序列采用Sequence進(jìn)行提交，找出與目的片段相似度高的菌種。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Quantity One軟件對(duì)DGGE條帶進(jìn)行數(shù)字化分析，計(jì)算樣品中可檢測(cè)到的DGGE條帶數(shù)，采用STATA10.0軟件進(jìn)行聚類分析，采用CLUSTALX與MEGA15.0軟件對(duì)細(xì)菌測(cè)序菌種作系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康與患病烏頭細(xì)菌DGGE結(jié)果

圖1 細(xì)菌DGGE圖譜（一）

圖2 細(xì)菌DGGE圖譜（二）

如圖1和圖2所示：壤、青蓮鎮(zhèn)患病土壤、彰明鎮(zhèn)患病土壤、九嶺鎮(zhèn)患病土壤和三合鎮(zhèn)患病土壤；11-20號(hào)分別為四月份太平鎮(zhèn)健康土壤、青蓮鎮(zhèn)健康土壤、彰明鎮(zhèn)健康土壤、九嶺鎮(zhèn)健康土壤、三合鎮(zhèn)健康土壤、太平鎮(zhèn)患病土壤、青蓮鎮(zhèn)患病土壤、彰明鎮(zhèn)患病土壤、九嶺鎮(zhèn)患病土壤和三合鎮(zhèn)患病土壤；21-30號(hào)分別為五月份太平鎮(zhèn)健康土壤、青蓮鎮(zhèn)健康土壤、彰明鎮(zhèn)健康土壤、九嶺鎮(zhèn)健康土壤、三合鎮(zhèn)健康土壤、太平鎮(zhèn)患病土壤、青蓮鎮(zhèn)患病土壤、彰明鎮(zhèn)患病土壤、九嶺鎮(zhèn)患病土壤和三合鎮(zhèn)患病土壤。

從圖1和圖2得到細(xì)菌的DGGE電泳圖譜，可以看出烏頭根際土壤微生物在不同的生長期和健康狀況不同的情況下，其微生物多樣性也存在著差異；結(jié)果也表明選取的細(xì)菌DGGE條件能將大部分相同片段的DNA條帶分開，該實(shí)驗(yàn)條件選取適合。圖片可知，烏頭患病根際土壤微生物多樣性要比健康根際土壤豐富，月份的不同其微生物多樣性也存在著差異。

2.2 健康與患病烏頭植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的DGGE分析

將切膠回收的20個(gè)細(xì)菌目的片段DNA在NCBI的Genbank上作核酸序列的Blast比對(duì)，找出與該目標(biāo)細(xì)菌片段相似度高的細(xì)菌菌種，結(jié)果可見表1。

表1 四川江油烏頭根際土壤細(xì)菌種類

經(jīng)鑒定結(jié)果得出這20個(gè)細(xì)菌菌種主要來源于4門（綠菌門、擬桿菌門、變形菌門、藍(lán)藻門）3綱（δ-變形菌綱、鞘脂桿菌綱、藍(lán)藻綱）5目（黃色單胞菌目、根瘤菌目、脫硫弧菌目、假單胞菌目、顫藻目）4科（鞘脂桿菌科、叢毛單胞菌科、脫硫弧菌科、假單胞菌科）7屬（假單胞菌屬、芽孢八疊球菌屬、從毛單胞菌屬、脫硫弧菌屬、鞘脂桿菌屬、桿菌屬、顫藻屬）。體現(xiàn)出了烏頭根際土壤微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性及豐富性。

3 討論

本研究采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)烏頭不同產(chǎn)地、不同生長狀況及不同月份的根際土壤進(jìn)行細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析。DGGE圖譜表明由于生長季節(jié)及生長狀況的不同，微生物細(xì)菌群落的多樣性存在較大的差異，但是，他們都存在一個(gè)共同點(diǎn)，即烏頭的生長狀況與細(xì)菌的多樣性存在著密切關(guān)系。生長良好的烏頭土壤細(xì)菌多樣性少于患病烏頭土壤細(xì)菌，可能是由于患病烏頭土壤細(xì)菌抑制了正常植株的生長，加快了烏頭幼苗的死亡。

根際土壤細(xì)菌PCR測(cè)序結(jié)果表明，患病土壤除具有和健康植株相同的細(xì)菌屬外，還具有自己獨(dú)特的菌數(shù)如X1，X5。經(jīng)測(cè)序鑒定發(fā)現(xiàn)這些獨(dú)特的DNA片段分別為綠膿桿菌（p.aeruginosa）、果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌是一種常見的病菌，其分布于土壤、空氣，水等環(huán)境中，致病力較低但抗藥性強(qiáng)的病菌；果膠桿菌也是一種能引起黑脛病、細(xì)菌性軟腐病的致病菌，廣泛存在于自然界中。經(jīng)DGGE研究發(fā)現(xiàn)，健康與患病烏頭根際土壤在微生物多樣性方面具有較高的相似性，而且有大部分細(xì)菌是NCBI收錄的未培養(yǎng)的物種。

本研究就選取3～5月份烏頭根際土壤微生物細(xì)菌進(jìn)行微生物群落的動(dòng)態(tài)變化研究，這也是烏頭生長的代表性月份，尤其是到了5月份，大部分患病烏頭都被藥農(nóng)除去，故選取還是具有研究意義的。由于微生物種類較多，本研究單一選取細(xì)菌來分析并不能代表整個(gè)微生物群落的結(jié)構(gòu)，這是本研究的不足之處。在烏頭地上部分生長旺盛的3～5月，土壤細(xì)菌繁殖也比較旺盛。隨著病蟲害種類的不斷增加和土傳病害等因素的影響，患病烏頭根際土壤細(xì)菌的種類也在增加，從而使烏頭根際物質(zhì)分泌活動(dòng)降低。在某種層面上烏頭細(xì)菌種類與根際分泌物存在著很大的關(guān)系，但是具體的根際微生物與根系分泌物的協(xié)同作用機(jī)理尚不明確，還需作進(jìn)一步的研究，從而為烏頭的健康發(fā)展提供參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯: 胡慧玲）

PCR-DGGE analysis of bacterial community diversity in rhizosphere soils of Wutou

WU Qing-hua, WANG Guangzhi, MA Yun-tong, PEI Jin, KANG Ya-lan//(Pharmacy College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine;State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China)

Objective:Study the structural differences of Wutou rhizosphere soil microbial bacterial communities in different growing season.Method:PCR-DGGE technology was applied to research the change of Wutou rhizosphere soil bacterial communities of different habitats and different health status of Wutou.Result:Difference can be detected between Wutou rhizosphere soil bacterial communities of health and illness Wutou, and diseased plants had pathogens which can cause illness of plants.Conclusion:Diseased plants change Wutou rhizosphere soil microbial bacterial communities, and existed pathogens induce the plant disease. The health status of the rhizosphere soil microbial community structure have signifcant impact on the rhizosphere microbial community structure differences which will lead to plant resistance to pathogens and species differences.

Wutou; bacteria; PCR-DGGE; community structure

R 282.5

A

1674-926X(2014)01-002-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.30901962）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

吳清華（1986-），女，助教，從事中藥品種、質(zhì)量和資源開發(fā)方向研究Tel:13980037435 Email:lingduweixiaoi@sina.cn

王光志（1976-），男，博士，教授，從事中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)與資源利用研究 Email:346211525@qq.com

2013-08-14