李偉，胡波，李桂林，張在強，王擁軍

腦小血管病是最常見中老年、隱性、進展性腦血管病，它是導致血管性癡呆最重要的一個原因。動脈硬化是腦小血管病最常見病因。目前腦小血管病的研究，除了對環(huán)境因素和危險因素（高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、老齡等）的研究外，遺傳背景因素是腦小血管病致病機制的重要內(nèi)容，它作為一種復雜性狀性疾病具備了多基因易感性的特點[1-3]。雖然現(xiàn)有的研究結(jié)果不盡人意，但根據(jù)全基因組卒中研究（genomewide association studies of stroke，GWAS）[4-6]，

結(jié)合腦小血管病的病理生理，病理學變化結(jié)果提示——腦小血管病的易感基因選擇可以涉及以下幾個方面：①脂代謝調(diào)節(jié)通路[7]；②炎性及Rho相關通路[8-9]；③血腦屏障細胞間連接調(diào)節(jié)通路[10-11]；④小血管病病理表現(xiàn)膠原纖維高表達的調(diào)節(jié)通路[12]。本研究旨在探討動脈硬化性腦小血管病與候選易感基因相關性，構(gòu)建腦小血管病的預測模型，為腦小血管病致病機制和預防提供重要的基因背景證據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究對象來自首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院門診、住院部、腦血管病篩查門診及體檢門診，連續(xù)收集脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）樣本存入北京天壇醫(yī)院腦血管病基因庫。從2009年6月～2013年12月天壇醫(yī)院腦血管病基因庫樣本中隨機選出腦小血管病患者197例，大動脈粥樣硬化性腦血管?。ㄑ塥M窄率＞50%）患者198例，高血壓性腦出血患者200例，非卒中對照197例，共計792例。

腦小血管病入組標準[13]：符合腦小血管病磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRⅠ）或計算機斷層掃描（computed tomography，CT）影像學特點：①腦缺血性脫髓鞘改變；②腔隙性腦梗死；③血管周圍間隙擴大；④腦內(nèi)微出血。并排除：①有穿支動脈的父動脈和供血動脈粥樣硬化性狹窄或閉塞（大、中動脈＞50%的狹窄）證據(jù)的患者；②有心源性栓塞證據(jù)的患者；③有多發(fā)性硬化，血管炎，一氧化碳中毒及農(nóng)藥中毒性脫髓鞘，遺傳性白質(zhì)腦病，代謝性白質(zhì)腦病，化療，放療相關性腦白質(zhì)病證據(jù)的患者；④有動脈夾層、肌纖維營養(yǎng)不良、煙霧病等大血管病變證據(jù)的患者；⑤拒絕參加本項研究患者。

大動脈粥樣硬化性腦血管病入組標準[13]：①支持動脈粥樣硬化性指標［頸動脈內(nèi)膜中層厚度（intima-media thickness，ⅠMT）＞1.5 mm］；②頸動脈血管超聲和經(jīng)顱多普勒檢查提示頸部動脈或顱內(nèi)動脈狹窄率＞50%，或血管影像學檢查提示頸部動脈或顱內(nèi)動脈狹窄率＞50%；③影像學提示相應責任大動脈供血區(qū)表現(xiàn)分水嶺梗死，或皮層、小腦、腦干及皮層下梗死病灶直徑＞1.5 cm腦梗死；④臨床表現(xiàn)為非腔隙綜合征表現(xiàn)。排除標準：①心源性栓塞患者；②腦小血管病患者，或皮層下梗死及腦干梗死病灶直徑＜1.5 cm的患者；③有動脈夾層、肌纖維營養(yǎng)不良、煙霧病證據(jù)的患者；④拒絕參加本項研究患者。

高血壓性腦出血入組標準：明確的高血壓病史，影像學提示基底節(jié)區(qū)出血性改變，并排除動脈瘤，藥物相關性出血及血液系統(tǒng)疾病。

非卒中對照組入組標準：①MRⅠ或CT等影像學檢查沒有任何類型腦血管病表現(xiàn)；②沒有卒中或短暫性腦缺血發(fā)作病史；③無腦血管病相應癥狀和體征。

對腦小血管病、大動脈粥樣硬化（血管狹窄率＞50%）及高血壓性腦出血病例，進行病史采集，入院后測雙側(cè)肱動脈血壓，血生化檢查（包括血常規(guī)，血脂，空腹血糖，血肌苷，血尿素氮，超敏C反應蛋白，血漿同型半胱氨酸，紅細胞沉降率）；對腦小血管患者還進行了抗中性粒細胞抗體，心磷脂抗體，抗核抗體/免疫全套，糖化血紅蛋白檢測。所有研究對象都進行了頭影像學及相應的血管影像學檢查，需要鑒別心源性卒中患者均進行了超聲心動圖檢查，24 h動態(tài)心電監(jiān)測或多次心電圖檢查。

本項研究通過了倫理委員會醫(yī)學倫理批準，研究對象知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 候選基因單核苷酸多態(tài)性的選擇 候選基因選擇經(jīng)過兩個步驟：第一，根據(jù)文獻中報道的熱門單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP），以及美國國家生物技術(shù)信息中心（National in BiotechnologyⅠnformation，NCBⅠ）中頻率較高的錯義SNP（插入與缺失＞15%）和影響基因表達的調(diào)控5’端tag SNP；第二，根據(jù)第一次的選擇位點結(jié)合統(tǒng)計學分析結(jié)果，在位點P值＜0.01所對應的基因中，通過文獻及其基因功能的復習，重新遴選SNP位點。第一步驟共選擇19個基因55個SNP位點；第二步驟易感基因候選出4個基因，包括神經(jīng)損傷誘導蛋白2（nerve injury induced protein 2，NⅠNJ2）、水通道蛋白4（Aquapofins 4，AQP4）、細胞周期依賴性激酶抑制基因2A（inhibitor of cdk 4/alternative reading frame，ⅠNK4/ARF）、肌球蛋白輕鏈激酶基因（myosin light chain kinase，MYLK），15個SNP位點（表1）。

1.3 單核苷酸多態(tài)性檢測 抽取患者的靜脈血5 ml（肝素抗凝），小量全血基因組DNA快速提取試劑盒提取全血DNA（北京博邁德科技發(fā)展有限公司）。利用SNaPshot SNP分型技術(shù)對樣本進行SNP位點分型檢測。設計51對聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物用于擴增包含55個SNP位點的51個118～338 bp片段，也設計了55個緊鄰SNP位點的延伸引物用于單堿基延伸。引物設計用在線Primer 3軟件。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得，PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶（Promega公司）和外切酶Ⅰ（Epicentre公司）純化后，SNaPshot多重試劑盒進行延伸反應（ABⅠ公司）。延伸產(chǎn)物用蝦堿性磷酸酶純化后，在基因測序儀（ABⅠ3130xl，ABⅠ公司）上樣。SNP分型用基因分型軟件GeneMapper 4.0（Applied biosystems）分析。以上試驗由上海天昊生物有限公司協(xié)助完成。

1.4 統(tǒng)計方法 經(jīng)過年齡和性別校正后，SNP位點在5種遺傳模型下（共顯性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型、疊加模型）用SAS分析軟件進行相關性分析。應用阿凱克信息準則（The Akaike Ⅰnformation Criterion，AⅠC）計算各遺傳模型，選擇最小AⅠC值的遺傳模型。應用permutation多重檢驗進行校正。數(shù)量變量應用t檢驗，計數(shù)變量使用χ2檢驗，相關性分析采用Logistic回歸分析。本試驗采用SAS統(tǒng)計件軟Logistic模塊進行預測模型的分析，應用基尼指數(shù)（GⅠNⅠ）表現(xiàn)其效果。

表1 腦小血管病候選4個基因及15個單核苷酸多態(tài)性位點

2 結(jié)果

研究對象平均年齡為（58.05±11.5）歲。危險因素分析經(jīng)過年齡、性別校正后，可見糖尿病比例分別是動脈粥樣硬化性腦大血管病40.26%，腦小血管病29.53%，高血壓性腦出血19.29%，各組之間存在顯著性差異（P＜0.001）；高血壓腦出血組與腦小血管病組比較（P=0.02），大動脈粥樣硬化組與腦小血管病組比較（P=0.02）。高脂血癥和吸煙發(fā)生率在各組間也有顯著差異（P＜0.001和P=0.002），在大動脈粥樣硬化組發(fā)生率最高，兩兩比較顯示，大動脈粥樣硬化組高脂血癥發(fā)生率顯著高于高血壓腦出血組（P=0.001）和腦小血管病組（P=0.001）；大動脈粥樣硬化組吸煙率顯著高于高血壓腦出血組（P=0.003）和腦小血管病組（P=0.001）（表2）。

AⅠC值最小的SNP位點的遺傳模式是超顯性模型（overdominant model）（圖1）。腦小血管病與非卒中對照組個體差異性檢驗，MYLK基因rs2222823雜合子（A/T）的優(yōu)勢比（odds ratio，OR）為0.52，95%可信區(qū)間（conf i dence interval，CⅠ）為（0.35～0.79），P=0.002，校正P=0.031）；ⅠNK4/ARF基因rs2811712雜合子（C/T）的OR值為1.75［95%CⅠ（1.13～2.71），P=0.004，校正P=0.050］（表3，圖2）。腦小血管病與高血壓性腦出血患者差異性檢驗，rs2222823位點的P值為0.035。在腦小血管病與動脈硬化性腦大血管病患者差異性檢驗中，非糖尿病患者及飲酒患者在rs2222823位點P值分別為0.012和0.018；高脂血癥及飲酒患者在rs2811712位點P值分別為0.029和0.04。依據(jù)易感基因構(gòu)建腦小血管的預測模型的GⅠNⅠ值為0.442。

3 討論

本研究表明MYLK基因和ⅠNK4/ARF基因的兩個SNP位點，rs2222823和rs2811712，與腦小血管疾病顯著相關。SNP位點rs2222823位于MYLK基因啟動子的tagSNPs的區(qū)域，rs2811712位與ⅠNK4/ARF基因的5’端區(qū)域，均位于這兩個基因的重要功能結(jié)構(gòu)區(qū)域，具有決定基因功能的重要意義，因此提示腦小血管病與MYLK基因和ⅠNK4/ARF基因密切相關。在SNP位點rs2222823（MYLK基因）雜合基因型（T/A）對腦小血管疾病有保護作用，而在位點SNP rs2811712雜合基因型（C/T）對腦小血管病有促進作用。

圖1 不同遺傳模型下AIC值的比較注：*：rs2811712；**：rs2222823；AIC：阿凱克信息準則

表2 研究對象的基本信息情況

表3 性別和年齡校正后腦小血管病與非卒中對照在超顯性遺傳模式下相關性分析

圖2 rs2222823與rs2811712不同基因型的OR值情況注：OR：優(yōu)勢比

2007年Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)MYLK基因與動脈粥樣硬化疾病相關。2009年Su等[15]研究發(fā)現(xiàn)激活的肌球蛋白輕鏈激酶具有增強血管內(nèi)皮通透性的作用[16]。最近多個研究發(fā)現(xiàn)ⅠNK4/ARF基因與衰老[17-18]和老年疾病如心肌梗死、卒中、2型糖尿病密切關聯(lián)[19-20]。動脈硬化性腦小血管病為一種動脈硬化微血管病變，其中血-腦屏障通透性增加是其重要的病理生理變化。因此，這些研究均提示MYLK和ⅠNK4/ARF基因與血腦屏障功能障礙和動脈硬化有關。Burton等研究者多項研究表明ⅠNK4/ARF基因SNP位點rs1333049區(qū)域與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和卒中密切相關[21-23]。而本研究結(jié)果顯示NK4/ARF基因rs2811712位點與腦小血管病的卒中亞型有關，這可能是由于種族差異導致的不同的SNP位點結(jié)果。但同樣說明在染色體9p21.3區(qū)域的ⅠNK4/ARF基因與卒中相關，很可能與腦小血管病有關。在5種遺傳模型基因型分析中AⅠC值最低的是超顯性模型。雖然在卒中很少觀察由于超顯性模型易致病性的報道，但許多研究中發(fā)現(xiàn)了超顯性遺傳模式與疾病相關[24]，如癌癥的一些研究中表明，在超顯性模型下某些基因的多態(tài)性與癌癥密切相關[25-26]。因此，將來需要深入研究在超顯性遺傳模型下腦小血管病易感基因的作用。

在理論上可能導致這種雜合子偏倚的原因有以下幾種情況：從技術(shù)上講，可以是由使用不準確的限制性內(nèi)切酶造成的，而本試驗應用的基因分型技術(shù)不會造成這種情況。從分子學角度，它可能是具有非常強大的主導性的變異等位基因，使雜合子具有等同于純合子效果。在統(tǒng)計學角度，由于變異純合子在病例和對照組相對樣本較少，變異純合子比較雜合子的效果可能會存在選擇性偏倚，簡單的說，就是統(tǒng)計力度不夠，不能反映變異純合子的真實效果，只能通過更大的研究樣本予以糾正。在預測模型評估方面，模型預測效果可以用GⅠNⅠ值來衡量，GⅠNⅠ越接近1，說明模型的表現(xiàn)越好，而本研究GⅠNⅠ值偏低，并且由于沒有大樣本來驗證這些結(jié)果，模型的表現(xiàn)可能非常不穩(wěn)定。所以單純應用基因型預測復雜性狀性疾病的預測模型具有很大局限性，也就是說，復雜性狀性疾病預測模型構(gòu)建除涵蓋易感基因外，還需要增加危險因素等因子才能增強預測模型的力度。另外，本研究樣本例數(shù)相對較小，下一步仍需要更大樣本量驗證這兩個SNP位點與腦小血管病的關系。

總之，MYLK和ⅠNK4/ARF基因與中國人群中動脈硬化性腦小血管病有顯著相關性，MYLK基因rs2222823雜合子（A/T）有減緩腦小血管病患病率作用，而ⅠNK4/ARF基因rs2811712雜合子（C/T）對腦小血管病的患病率具有促進作用。預測模型需要增加更多的變量來加大模型的效度。

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