葛永紅，李燦嬰，朱丹實(shí)，李穎琦，劉 婧

（1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

采后檸檬酸處理對蘋果青霉病的控制及其貯藏品質(zhì)的影響

葛永紅1，李燦嬰1，朱丹實(shí)1，李穎琦2，劉 婧2

（1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

以蘋果為原料，研究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸常溫浸泡處理對損傷接種擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）果實(shí)病斑擴(kuò)展的抑制效果及貯藏品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：離體條件下檸檬酸能夠抑制P. expansum的孢子萌發(fā)，其中以1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)效果最佳，1%檸檬酸處理顯著降低了損傷接種蘋果果實(shí)P. expansum病斑直徑；檸檬酸處理顯著提高了果實(shí)過氧化物酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶活性。此外，檸檬酸處理還有效延緩了果實(shí)質(zhì)量損失率的升高，抑制果實(shí)硬度、抗壞血酸含量、可滴定酸和可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降，且推遲了果實(shí)呼吸高峰的出現(xiàn)。

檸檬酸；蘋果果實(shí)；品質(zhì)；采后

蘋果（Malus domestica Borkh）屬躍變型果實(shí)，在采后貯藏、運(yùn)輸和銷售過程中很容易腐爛變質(zhì)，給生產(chǎn)者和經(jīng)營者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。果實(shí)的品質(zhì)劣變主要是由于水分蒸騰、果膠物質(zhì)降解、呼吸消耗等所致，同時營養(yǎng)物質(zhì)的消耗也在一定程度上降低了果實(shí)的抗病性。因此，延緩采后果實(shí)的衰老及病害控制是提高蘋果品質(zhì)及延長貯藏期的重要措施。貯運(yùn)過程中由擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是主要采后病害之一，目前最有效的方法還是依靠化學(xué)殺菌劑[2-3]。隨著人們對食品安全性和環(huán)境污染的重視，化學(xué)殺菌劑在果實(shí)采后病害防治中的應(yīng)用逐漸受到限制。采用安全、持續(xù)、廣譜和無環(huán)境污染的采后防腐保鮮措施已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[4]。

檸檬酸是果實(shí)體內(nèi)存在的一種重要有機(jī)酸，參與組織呼吸代謝等生理代謝過程，也是一種有效的非生物誘抗劑。已有研究報道，采后檸檬酸處理能夠延緩蠶豆[5]、芒果[6]、鴨梨[7]、棗[8]等果實(shí)的衰老進(jìn)程。采后檸檬酸處理抑制了馬鈴薯硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）引起的干腐病的發(fā)生[9]、甜瓜果實(shí)損傷接種互隔交鏈孢（Alternaria alternata）的病斑擴(kuò)展[10]。進(jìn)一步研究表明檸檬酸處理提高果實(shí)抗病性與提高果實(shí)β-1,3-葡聚糖酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性，促進(jìn)類黃酮、酚類和木質(zhì)素等抗性物質(zhì)的顯著積累密切相關(guān)[9-10]。有關(guān)檸檬酸處理對蘋果青霉病的控制及貯藏品質(zhì)的影響尚未見報道。

本實(shí)驗(yàn)以蘋果為原料，研究采后檸檬酸處理對P. expansum孢子萌發(fā)及損傷接種P. expansum果實(shí)病斑擴(kuò)展的影響，探索檸檬酸處理對果實(shí)抗氧化酶活性及貯藏品質(zhì)的影響，以期為檸檬酸在果蔬貯藏保鮮中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試青冠蘋果果實(shí)2013年8月采自甘肅省景泰條山農(nóng)場，在八成熟時采收，單果套發(fā)泡網(wǎng)袋后紙箱包裝當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室常溫貯藏待用（溫度（20±2）℃，相對濕度45%）。供試P. expansum分離自自然發(fā)病的蘋果果實(shí)，純化后在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)待用。

PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中。

檸檬酸（分析純） 天津永晟精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型分光光度計 日本島津公司；H-1850R型離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；GY-1型水果硬度計 杭州托普儀器有限公司；WYT-32型阿貝折光儀 廈門中村光學(xué)儀器廠；GXH-3051H型紅外CO2果蔬呼吸測定儀 北京均方理化科技研究所。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選擇大小一致、無機(jī)械損傷和病蟲害的果實(shí)，表面清洗后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、4%檸檬酸溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.05%的吐溫80）浸泡處理10 min，待晾干后包裝常溫貯藏待用（溫度（20±2）℃，相對濕度45%）。用清水處理作對照（CK），每處理15 個果實(shí)，重復(fù)3 次。

1.3.2 孢子懸浮液的配制

參照Bi Yang等[11]方法。取25 ℃條件下培養(yǎng)7 d的帶菌PDA平皿一個，加入含0.05%吐溫80的無菌水約10 mL，用玻璃棒刮下PDA平板上的病原菌孢子，然后轉(zhuǎn)入50 mL三角瓶中，在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15 s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計數(shù)板計數(shù)算出孢子懸浮液的孢子含量，最后稀釋至所需含量（1×105個/mL）。

1.3.3 孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

將配制好的P. expansum孢子懸浮液加入到經(jīng)滅菌的含有1%、2%、4%檸檬酸的馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PD）培養(yǎng)基中，然后在25 ℃條件下培養(yǎng)，當(dāng)對照孢子萌發(fā)數(shù)達(dá)到80%以上時，統(tǒng)計各處理孢子萌發(fā)數(shù)并計算孢子萌發(fā)率。

1.3.4 損傷接種

參照Bi Yang等[11]方法。各處理果實(shí)先經(jīng)75%酒精表面消毒，然后用滅菌鐵釘在果實(shí)赤道部位均勻刺孔4 個（深3 mm，直徑3 mm），晾干后分別取20 μL含量為1×105個/mL的P. expansum孢子懸浮液接種于孔內(nèi)，晾干后裝箱用PE膜包裝保濕，室溫貯藏第4天開始，每隔1d觀察發(fā)病率，并用十字交叉法測量病斑直徑，篩選出最佳檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 取樣方法

分別于1%檸檬酸和清水處理后0、2、4、6、8 d用直徑5 mm打孔器取皮下10～15 mm處果肉組織3 g，用錫箔紙包好，液氮冷凍后在-80 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 呼吸強(qiáng)度測定

用GXH-3051H型果蔬呼吸測定儀測定果實(shí)呼吸強(qiáng)度。取果實(shí)30 個，在果實(shí)貯藏第0、2、4、6、8天測定果實(shí)在12 min內(nèi)的CO2產(chǎn)生量，呼吸強(qiáng)度以mL CO2/（kg·h）表示。

1.3.7 可溶性固形物含量和硬度測定

參照曹建康等[7]的方法。用阿貝折光儀和硬度計在果實(shí)貯藏第0、2、4、6、8天測定果肉可溶性固形物含量和硬度。每個果實(shí)測4 個點(diǎn)（陽面、陰面各兩點(diǎn)），每處理用果實(shí)10 個，重復(fù)3 次。

1.3.8 可滴定酸和抗壞血酸含量測定

可滴定酸含量測定參照韓雅珊[12]方法并修改。10.0 g樣品磨碎，用已煮沸、冷卻的蒸餾水移入100 mL的容量瓶中定容，過濾。吸取濾液10 mL，加入2～3 滴1%酚酞指示劑，用標(biāo)定后的0.01 mol/L NaOH溶液滴定。果實(shí)可滴定酸含量以蘋果酸（換算系數(shù)為0.067）進(jìn)行計算。

抗壞血酸含量測定參照任亞琳等[13]方法。3.0 g果肉組織加5 mL預(yù)冷的100 mmol/L鹽酸充分研磨，在4 ℃、10 000×g條件下離心10 min，取上清液100 ?L加入2 mL 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）再加入0.5 mL蒸餾水在265 nm波長處測定其吸光度，并以抗壞血酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以每克鮮質(zhì)量的抗壞血酸質(zhì)量表示抗壞血酸含量。

1.3.9 質(zhì)量損失率的測定

參照任邦來等[14]的方法并修改。稱量法測量果實(shí)的質(zhì)量，采用差量法計算。每處理10 個果實(shí)，重復(fù)3 次。

1.3.10 抗性酶活性測定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活性的測定參照葛永紅等[10]方法。酶活性以每分鐘吸光度變化0.01為1 個活性單位（U），POD活性以U/g表示。

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性測定參照Ren Yaling等[15]方法。以每分鐘反應(yīng)體系吸光度變化0.01定義為1 個酶活性單位（U），APX活性以U/g表示。

過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測定參照Cao Jiankang等[16]方法。取3 g果肉，加入1 mL預(yù)冷pH 7.5的0.05 mol/L磷酸緩沖液（內(nèi)含50 mmol/L二硫蘇糖醇和1%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮）在冰浴中研成勻漿，12 000×g、4 ℃條件下離心20 min，收集上清液立即用于CAT酶活測定。CAT反應(yīng)體系包括粗酶液100 μL和3 mL 20 mmol/L的H2O2，以蒸餾水作參比。在240 nm波長處測定2 min時的樣品吸光度。CAT活性以U/g表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007計算標(biāo)準(zhǔn)誤差并作圖，SPSS V17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸處理對P. expansum孢子萌發(fā)的影響

P. expansum在培養(yǎng)24 h后孢子大量萌發(fā)，對照萌發(fā)率達(dá)到90%，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸處理均抑制了孢子萌發(fā)，其中以1%和2%檸檬酸處理的孢子萌發(fā)率與對照有顯著性差異，其中以1%檸檬酸處理的萌發(fā)率最低（圖1）。

圖1 檸檬酸處理對P. expansum孢子萌發(fā)的影響Fig.1 Effect of postharvest citric acid treatment on spore germination of P. expansum

圖2 采后檸檬酸處理對損傷接種P. expansum蘋果病斑直徑的影響Fig.2 Effect of postharvest citric acid treatment on lesion diameter in apple fruits inoculated with P. expansum

2.2 檸檬酸處理對損傷接種P. expansum蘋果果實(shí)病斑直徑的影響隨著貯藏時間的延長，接種蘋果果實(shí)病斑直徑逐漸增大，1%、2%和4%檸檬酸處理均降低了損傷接種蘋果果實(shí)P. expansum病斑直徑，其中只有1%檸檬酸與對照間有顯著性差異，高含量的檸檬酸沒有進(jìn)一步抑制果實(shí)病斑擴(kuò)展（圖2）。

2.3 檸檬酸處理對蘋果果實(shí)質(zhì)量損失率的影響

圖3 采后1 檸檬酸處理對常溫貯藏期間蘋果果實(shí)質(zhì)量損失率的影響Fig.3 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on weight loss in apple fruits during storage at room temperature

隨著貯藏時間的延長，對照和處理蘋果果實(shí)質(zhì)量損失率逐漸增加，但1%檸檬酸處理果實(shí)的質(zhì)量損失率明顯低于對照，在貯藏4、6、8 d后顯著低于對照，分別較對照組果實(shí)低43.6%、26.3%和39%（圖3）。

2.4 檸檬酸處理對蘋果果實(shí)呼吸強(qiáng)度的影響

圖4 采后1 檸檬酸處理對常溫貯藏期間蘋果果實(shí)呼吸強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on respiration intensity of apple fruits during storage at room temperature

蘋果屬于典型的呼吸躍變型果實(shí)，常溫貯藏過程中果實(shí)呼吸強(qiáng)度先升高后下降，在貯藏第4天出現(xiàn)峰值，但1%檸檬酸處理推遲了呼吸高峰的出現(xiàn)（圖4）。說明檸檬酸處理有利于延緩果實(shí)的衰老進(jìn)程。

2.5 檸檬酸處理對蘋果果實(shí)硬度和可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

整個常溫貯藏期間，處理和對照組果實(shí)硬度均呈逐漸下降趨勢，但檸檬酸處理明顯延緩了果實(shí)硬度的下降速率（圖5A）。果實(shí)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先升高后降低的趨勢，檸檬酸處理組果實(shí)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在貯藏前期低于對照，貯藏6d后高于對照（圖5B）。由此說明，檸檬酸處理在一定程度上延緩了果實(shí)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降。

2.6 檸檬酸處理對蘋果果實(shí)可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抗壞血酸含量的影響

圖6 采后1 檸檬酸處理對常溫貯藏期間蘋果果實(shí)可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）和抗壞血酸含量（B）的影響Fig.6 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on titratable acid (A) and ascorbic acid (B) contents in apple fruits during storage at room temperature

隨著貯藏時間的延長，果實(shí)可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸下降，檸檬酸處理果實(shí)可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于對照果實(shí)，但差異不顯著（圖6A）?？箟难岷侩S著貯藏時間的延長先降低后升高再降低趨勢，檸檬酸處理顯著維持了高水平的抗壞血酸，并且在第貯藏第6天出現(xiàn)峰值，高出對照36.5%（圖6B）。

2.7 檸檬酸處理對蘋果果實(shí)抗性酶活性的影響

圖7 采后1 檸檬酸處理對蘋果果實(shí)POD（A）、CAT（B）和APX（C）活性的影響Fig.7 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on POD (A), CAT (B) and APX (C) activities in apple fruits

整個貯藏期間，對照和處理果實(shí)POD活性呈先升高后降低趨勢，但檸檬酸處理顯著提高了蘋果果實(shí)POD活性，其中在貯藏第4天和第6天差異最顯著，分別高出對照52%和39.3%（圖7A）。檸檬酸處理也顯著提高蘋果果實(shí)CAT和APX活性，兩者均在貯藏第4天出現(xiàn)峰值，分別高于對照19.3%和22.2%（圖7B、C）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸均能抑制處理后損傷接種P. expansum蘋果果實(shí)的病斑直徑，其中以1%檸檬酸處理的抑制效果最佳。離體條件下檸檬酸對P. expansum的孢子萌發(fā)有明顯抑制作用，其中1%檸檬酸抑制率最大。葛永紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)，離體條件下檸檬酸處理抑制了A. alternata菌絲生長，其中以2%檸檬酸效果最佳。并且，2%檸檬酸處理能夠有效抑制處理后損傷接種A. alternata甜瓜果實(shí)的病斑直徑。由此表明，檸檬酸處理的質(zhì)量分?jǐn)?shù)會對其控制腐爛的效果產(chǎn)生明顯的影響，本實(shí)驗(yàn)所篩選1%檸檬酸處理對損傷接種病原物的抑制效果最佳，過高質(zhì)量分?jǐn)?shù)效果并不明顯。在馬鈴薯上的研究[9]也發(fā)現(xiàn)，檸檬酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病性與其質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)效果不明顯且產(chǎn)生藥害。采后蘋果酸誘導(dǎo)蘋果果實(shí)抗病性的研究[17]也發(fā)現(xiàn)高含量的蘋果酸并不能降低果實(shí)采后青霉病。這可能是高含量的有機(jī)酸影響了果實(shí)的呼吸或其他代謝。說明只有一定含量的檸檬酸才能有效啟動果實(shí)的防衛(wèi)反應(yīng)，更高含量并不能增加防衛(wèi)反應(yīng)的強(qiáng)度，并且檸檬酸的含量因果實(shí)和病原物的不同而存在明顯的差異。

檸檬酸處理對蘋果青霉病的抑制與其激活防御酶活性密切相關(guān)。據(jù)報道，多種防御酶在產(chǎn)品的抗病性反應(yīng)中具有積極的作用[18]。1%檸檬酸處理后果實(shí)體內(nèi)APX、POD和CAT活性顯著升高。在果實(shí)體內(nèi)POD參與木質(zhì)素的合成，以及細(xì)胞壁的交聯(lián)化反應(yīng)，從而加固細(xì)胞壁抵抗病原物的侵染[19-20]。此外，POD也參與細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除，避免活性氧的過量積累[19]。厚皮甜瓜果實(shí)上的研究也發(fā)現(xiàn)，采后檸檬酸處理誘導(dǎo)了果實(shí)體內(nèi)POD活性的升高，從而提高了果實(shí)的抗病性[10]。CAT專一地作用于H2O2，將H2O2分解為水和氧氣，從而降低了H2O2的積累，減少對寄主的傷害[20]。APX能夠經(jīng)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)分解H2O2為水分子[15]。越來越多的研究證明，抗氧化酶的協(xié)同作用比單一酶在植物抗氧化過程中更具重要性[9]。由此表明，檸檬酸處理提高蘋果果實(shí)的抗病性與體內(nèi)抗氧化酶活性的提高密切有關(guān)。檸檬酸誘導(dǎo)果實(shí)抗病性的提高還與活化果實(shí)體內(nèi)苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性提高和抗菌物質(zhì)的積累有關(guān)[9-10]。

果實(shí)采收后依然是鮮活的個體，為維持其正常生理功能必然要消耗體內(nèi)的一些營養(yǎng)物質(zhì)，從而造成品質(zhì)的下降，而品質(zhì)劣變和果實(shí)衰老是限制果實(shí)貯藏的主要因素。這些品質(zhì)成分包括水分、香氣物質(zhì)、果膠物質(zhì)、糖、酸、抗壞血酸等[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘋果果實(shí)在貯藏期間硬度、可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抗壞血酸含量先升高后下降，呼吸強(qiáng)度升高出現(xiàn)呼吸高峰后開始下降，質(zhì)量損失率逐漸增加，說明果實(shí)逐漸進(jìn)入衰老階段，檸檬酸處理能夠有效減緩果實(shí)硬度、抗壞血酸含量、可滴定酸和可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降及質(zhì)量損失率的升高，并且推遲了果實(shí)呼吸高峰的出現(xiàn)，從而延緩果實(shí)采后衰老速率，延長了其貯藏時間。曹建康等[7]在鴨梨果實(shí)上的研究發(fā)現(xiàn)，采后檸檬酸處理有效延緩了貯藏過程中果實(shí)硬度、可溶性固形物、可滴定酸和抗壞血酸含量的下降。因此，檸檬酸處理能明顯保持果實(shí)品質(zhì)和增加耐貯性。

4 結(jié) 論

離體條件下1%檸檬酸顯著抑制了P. expansum的孢子萌發(fā)，顯著降低了損傷接種蘋果果實(shí)P. expansum病斑直徑。檸檬酸處理顯著提高果實(shí)POD、CAT和APX活性，同時還有效延緩了果實(shí)質(zhì)量損失率的升高，抑制果實(shí)硬度、抗壞血酸含量、可滴定酸和可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降，并且推遲了果實(shí)呼吸高峰的出現(xiàn)，從而延緩果實(shí)采后衰老速率，延長了其貯藏期。

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Effect of Postharvest Citric Acid Treatment on Controlling Blue Mould and Preserving the Quality of Apple Fruits during Storage

GE Yong-hong1, LI Can-ying1, ZHU Dan-shi1, LI Ying-qi2, LIU Jing2
(1. College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety, Bohai University, Jinzhou 121013, China; 2. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Apple (cv. Qingguan) fruits which had been wounded and artificially inoculated with Penicillium expansum were subjected to dipping treatments with different concentrations of citric acid and subsequent storage at room temperature in order to investigate the inhibition of lesion development and the preservation of apple fruit by citric acid treatment. In vitro test indicated that citric acid inhibited spore germination of P. expansum, and 1% citric acid showed the highest inhibitory rate. In vivo test indicated that 1% citric acid was the optimal concentration for controlling blue mould of apple fruits. Postharvest citric acid treatment significantly increased the activities of peroxidase (POD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX), delayed the increase in weight loss and the decreases in hardness and the contents of titratable acid, ascorbic acid and soluble solid, and postponed the respiration peak in apple fruits.

citric acid; apple fruit; quality; postharvest

TS255.3

A

1002-6630（2014）22-0255-05

10.7506/spkx1002-6630-201422050

2014-04-11

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31160405）；渤海大學(xué)博士啟動基金項(xiàng)目（bsqd201405）；遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目（LNSAKF2013021）

葛永紅（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣哔A藏與保鮮。E-mail：geyh1979@163.com