高向陽，高遒竹，王長青，劉要衛(wèi)

（1.鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002）

微波消解-電導率法快速測定花葉滇苦菜中粗蛋白

高向陽1,3，高遒竹2，王長青3，劉要衛(wèi)1

（1.鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002）

建立一種快速、簡便測定食品中蛋白質(zhì)的方法，以鄭州地區(qū)花葉滇苦菜為樣品，以硝酸-過氧化氫混酸為消解劑，利用微波技術進行快速消解，將蛋白質(zhì)中的氮轉化為NH4+。根據(jù)單因素試驗確定中性甲醛的用量后，用中性甲醛將弱酸根NH4+轉化為強酸H+，以NaOH標準溶液進行電導滴定。結果表明，花葉滇苦菜干基樣品中粗蛋白的平均含量為20.16%，平行測定的相對標準偏差為2.5%（n=6）。與標準方法對比測定，經(jīng)F檢驗和t檢驗表明這2 種測定方法無顯著性差異，置信度為95%，結果令人滿意。該方法具有快速、簡便、準確、節(jié)省試劑、污染小、不需要指示劑等優(yōu)點。

花葉滇苦菜；微波消解；電導率；粗蛋白

花葉滇苦菜（Sonchus asper (L.) Hill.），又稱續(xù)斷菊，菊科植物，苦苣菜屬，1 a或2 a生草本。分布于國內(nèi)外各地，生于田野、果園、荒山、草地及河灘[1]，野生資源十分豐富，是人們喜愛采集的常見野菜。研究[2]表明，花葉滇苦菜中必需氨基酸含量分布合理，適宜人體吸收利用。

蛋白質(zhì)是重要的營養(yǎng)指標，是生命活動的物質(zhì)基礎，分析蛋白質(zhì)及氨基酸含量是開發(fā)食品資源，進行食品質(zhì)量管理和改善食品生產(chǎn)工藝的基礎。目前，測定食品中粗蛋白的方法有國家頒布的標準法即凱氏定氮法[3]、高效液相色譜法[4]、恒pH滴定法[5]、自動凱氏定氮儀法[6]、化學發(fā)光法[7]、甲醛法[8]、近紅外光譜法[9]、濃度直讀法[10]等。凱氏定氮法樣品消化過程繁瑣，測定條件不易掌握，試劑消耗量大，排放的廢氣污染環(huán)境，危害人體健康。高效液相色譜法、化學發(fā)光法、近紅外光譜法和濃度直讀法或儀器價格昂貴、分析成本較高，或需要具有特殊功能的專用儀器，普及推廣受限。

微波消解樣品技術具有操作簡便、消化速度快、試劑用量少、污染小、工作效率高等優(yōu)勢，已被廣泛用于食品分析[10-19]。電導率滴定法具有儀器便攜、操作簡便、快速準確、成本低廉、無需添加指示劑、易于現(xiàn)場檢測等突出優(yōu)點已得到應用[20-21]。本實驗將微波密閉壓力消解技術與電導滴定法聯(lián)用，使兩者的優(yōu)點得到充分發(fā)揮，樣品在微波密閉罐中程序壓力消解，將蛋白質(zhì)中的氮轉化為NH4+，除去多余酸，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 5.40后，加入中性甲醛將NH4+轉化為等物質(zhì)的量的H+，以NaOH標準溶液進行電導滴定，以電導率為縱坐標，以消耗的NaOH標準溶液體積為橫坐標作圖確定滴定終點。研究表明，該法用于鄭州地區(qū)野生花葉滇苦菜中粗蛋白的分析，樣品經(jīng)與國標方法對照測定無顯著性差異，測定結果令人滿意，為該食品新資源的進一步開發(fā)利用提供了科學參考，有一定的推廣應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花葉滇苦菜于2014年3月20日采集于鄭州市郊區(qū)，經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學朱長山教授鑒定確認。

中性甲醛溶液：取質(zhì)量濃度37～40 g/100 mL的甲醛試劑（AR）一瓶約500 mL，加酚酞指示劑3～4 滴，用NaOH溶液滴至淺粉色，30 s不褪色為止，用前臨時處理。

0.05 mol/L NaOH標準溶液：先粗配0.05 mol/L NaOH溶液250 mL，用干燥至恒質(zhì)量的基準鄰苯二甲酸氫鉀標定和計算，其濃度為0.050 43 mol/L。

0.100 0 mol/L鹽酸標準溶液：量取濃鹽酸9 mL定容至1 L；用恒質(zhì)量的Na2CO3；以溴甲酚綠-甲基紅為指示劑，按經(jīng)典方法[22]進行標定，平行測定3 次，平均濃度0.106 3 mol/L。

氫氧化鈉、硫酸銅（均為分析純） 天津市德恩化學試劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（基準試劑） 上海試劑三廠；16 mol/L濃硝酸、18 mol/L濃硫酸（均為優(yōu)級純）、鹽酸（分析純） 洛陽昊華化學試劑有限公司；30 g/100 mL雙氧水（優(yōu)級純） 汕頭市西隴化工有限公司；甲醛 廣東光華科技股份有限公司；硼酸、硫酸鉀（均為分析純） 天津市凱通化學試劑有限公司；所用水為超純水（電阻率18.25 MΩ?cm）。

1.2 儀器與設備

ETHOS A型微波消解/萃取系統(tǒng) 意大利Milestone微波實驗儀器研制公司；DDS-11A型數(shù)顯電導率儀中國杭州雷磁分析儀器廠；雷磁PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；MS034S101電子分析精密天平（精確到0.1 mg） 瑞士Mettler Toledo公司；GZX-9140 MBE電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Molgene1820C超純水機 重慶摩爾水處理設備有限公司；Velp Scientifica系列自動凱氏定氮儀意大利Velp公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

采集花葉滇苦菜后，用普通蒸餾水和超純水分別清洗3 次，除去灰塵和雜質(zhì)，在55 ℃條件下恒溫干燥24 h以上，用粉碎機粉碎后，全部過35 目不銹鋼篩，然后置于真空袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品水分測定

按照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定方法》[23]測定水分的質(zhì)量分數(shù)。

1.3.3 粗蛋白的測定

準確稱取0.40 g（精確到0.000 1 g）左右，按1.3.1節(jié)樣品于聚四乙烯溶樣罐中，加7.00 mL濃硝酸，1.00 mL雙氧水，輕搖，密閉罐蓋，置于微波爐中。按表1設定的程序消解完全后，于電熱板上加熱揮發(fā)至約1 mL左右，將消解液移至小燒杯，用超純水多次洗滌溶樣罐，洗滌液轉入燒杯，定量移入100 mL容量瓶，用超純水定容，混勻，待測。

表1 微波壓力消解參數(shù)設定的程序Table 1 Parameter settings for microwave-pressurized digestion

用移液管移取10.00 mL消解定溶液于50 mL小燒杯中，加水10.00 mL，在pH計的監(jiān)測下，用1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L NaOH逐滴滴加，調(diào)pH值至5.40后，加入2.00 mL中性甲醛溶液，輕輕混勻。測定其電導率并記錄后，用0.050 43 mol/L NaOH標準溶液滴定，記錄滴定體積與其對應的電導率值，每次滴定體積控制在0.10～0.50 mL之間。以測得的電導率值為縱坐標，以NaOH標準溶液的滴定體積為橫坐標作圖繪制滴定曲線，根據(jù)滴定曲線確定滴定終點體積V終，同時進行平行測定。

2 結果與分析

2.1 樣品水分測定及精密度

取1.3.1節(jié)預處理后的樣品5 g左右（稱準至0.000 1 g）于扁型玻璃稱量瓶中，按照1.3.2節(jié)[23]測定花葉滇苦菜中水分的質(zhì)量分數(shù)，平行測定3 次，按公式（1）計算干基樣品的水分，結果如表2所示。

式中：ω0為樣品中水分的質(zhì)量分數(shù)/%；m1為稱量瓶和試樣干燥前的質(zhì)量/g；m2為稱量瓶和試樣干燥后的質(zhì)量/g；m3為稱量瓶的質(zhì)量/g。

表2 花葉滇苦菜水分質(zhì)量分數(shù)測定的平均值（n＝3，干基）Table 2 Average water content in Sonchus asper (n= 3, dry basis) %

由表2可知，花葉滇苦菜干基樣品中水分的質(zhì)量分數(shù)為6.28%，相對標準偏差（relative standard deviations，RSD）為0.43%。

2.2 消解體系和料液比的選擇

實驗采用硝酸和雙氧水混酸消解體系，按照ETHOS A型微波消解/萃取系統(tǒng)針對蔬菜所推薦的消解程序：樣品0.4～0.5 g，硝酸與H2O2的體積分別為7 mL和1 mL，按照表1所設定的消解程序消解30 min，溶液澄清透明，消解效果較理想。

2.3 消解液中過量酸的影響

消解過程中添加過量氧化性混合酸，加入甲醛后可以發(fā)生氧化還原反應而額外消耗甲醛，且在調(diào)節(jié)pH 5.40時會過多消耗NaOH溶液，影響后續(xù)實驗步驟和終點的確定。因此需要趕酸，使用帶有溫度控制的電熱板在通風廚中進行趕酸，電熱板的最高溫度設置為180 ℃，至消解罐中液體剩余約1 mL時停止，再定容至100 mL備用。

2.4 滴定時溶液pH值的確定

由于樣品中蛋白質(zhì)轉化的等物質(zhì)的量的NH4+是較弱共軛酸（Ka=5.6×10-10），不能直接被NaOH標準溶液準確滴定。經(jīng)預實驗計算，除去樣品中過量的硝酸時，用NaOH溶液將消解液滴至pH 5.10～5.40，溶液中的NH4+不與NaOH反應，此時可用中性甲醛將NH4+轉換為等物質(zhì)的量的H+后滴定，轉換反應為：

因此，控制消解液pH 5.40進行電導法測定。

2.5 甲醛用量的確定

按1.3.3節(jié)操作步驟向10.00 mL定溶液中，分別加入1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL甲醛溶液測定粗蛋白，同時進行3 次平行測定，取平均值。實驗表明：加入甲醛大于2.00 mL時，粗蛋白的測定結果最大且穩(wěn)定，考慮到節(jié)省試劑，確定加入甲醛的體積為2.00 mL。

2.6 溫度的影響

溫度對電導率的測定有較大影響[24]，用溫度計測量被測液體的溫度后，將儀器上的溫度補償旋鈕到該溫度，其影響即可得到補償和校正。

2.7 滴定終點的確定

滴定終點前，由于溶液中的H+離子具有較高的無限稀釋摩爾電導率[24]，導電能力較強，滴加NaOH標準溶液后，快速與OH-定量反應，生成導電性弱的H2O，溶液電導率隨NaOH溶液的加入量增加而線性降低，達終點時，溶液的電導率最低。終點后，由于過量的OH-具有較強導電性，溶液的導電率隨NaOH的加入量增加而線性增加，因此，圖1中2條直線延長線的交點即為滴定終點。

圖1 電導滴定曲線Fig.1 Conductivity titration curve

由圖1可知，滴定曲線由2條直線組成，每條直線只需進行5～7 個點的測定，即可以準確進行繪制。2條直線延長線交點所對應的消耗標準溶液的體積，即為滴定終點V終?；ㄈ~滇苦菜干基樣品中粗蛋白的質(zhì)量分數(shù)按公式（2）計算：

式中：ω為干基樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)/%；V終為滴定終點消耗NaOH標準溶液的體積/mL；c為NaOH標準溶液的物質(zhì)的量濃度/（mol/L）；0.014 01為1 mmol NaOH標準溶液相當于氮的質(zhì)量/（g/mmol）；6.25為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；m為稱取樣品的質(zhì)量/g；ω0為樣品中水分的質(zhì)量分數(shù)/%。

2.8 對照測定結果及精密度

利用該法按照1.3.3節(jié)操作步驟和國標法[3]各進行6 次平行測定，用格魯布斯檢驗法檢驗無可疑值后，按公式（1）計算干基樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)，結果如表3所示。

表3 對照測定結果Table 3 Comparison of the analytical results obtained using the conductivity titration method and the Chinese national standard %

由表3可知，國標法測得粗蛋白均值為21.12%，RSD為2.4%，微波消解-電導滴定法測得的粗蛋白含量均值為20.16%，RSD為2.5%，經(jīng)過F值和t值檢驗表明，2 種方法的測定結果無顯著性差異，結論的置信度為95%[25]。

3 結 論

微波消解法樣品與試劑的反應是在密閉的容器內(nèi)進行的，試劑用量少，消化速度快且消化徹底；對環(huán)境和分析人員的危害大大減??；按表1程序設置后可自動完成全部操作，簡單方便，減輕了分析人員的勞動強度，提高了工作效率。

電導法測定花葉滇苦菜中的粗蛋白無需對試液進行蒸餾和使用硼酸吸收液，不需要指示劑和催化劑，試液處理后可直接滴定，所用儀器便宜、操作簡便、消耗標準溶液和試劑少，成本低廉，分析速度快。對花葉滇苦菜樣品進行6 次平行測定，粗蛋白含量均值為20.16%，RSD為2.5%。與國標法對照測定，經(jīng)過F值檢驗和t值檢驗表明，2 種方法間無顯著性差異，結論的置信度為95%，為花葉滇苦菜等樣品中粗蛋白的快速測定提供一種新的分析方法，為該自然資源的進一步開發(fā)利用提供科學參考，有一定的推廣應用價值。

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Rapid Determination of Crude Protein in Sonchus asper by Microwave Digestion-Conductivity Titration

GAO Xiang-yang1,3, GAO Qiu-zhu2, WANG Chang-qing3, LIU Yao-wei1
(1. School of Food Science and Engineering, University for Science and Technology of Zhengzhou, Zhengzhou 450064, China; 2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 3. College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

A rapid and simple method to determine crude protein content in Sonchus asper was established in this study. Samples were digested with nitric acid-hydrogen peroxide by microwave digestion technique to convert crude protein to NH4+. The NH4+generated in the digestion was further converted to H+ions by neutral formalin for conductivity titration with standard NaOH solution. The results indicated that the average content of protein in wild Sonchus asper from Zhengzhou was determined to be 20.16% with relative standard deviation (RSD) of 2.5% (n = 6). Compared with the classic method, the conductivity titration method did not exhibit significant difference as analyzed by F-test and t-test at 95% confidence level. This method has the advantages of convenient operation, high sensitivity, quick determination, accurate results and no requirements for indicators.

Sonchus asper; microwave digestion; conductivity; crude protein

O657.11

A

1002-6630（2014）22-0194-04

10.7506/spkx1002-6630-201422037

2014-06-04

河南省重點學科建設項目（10466-X-082301）

高向陽（1949—），男，教授，學士，主要從事食品安全監(jiān)測、食品新資源開發(fā)研究。E-mail：ndgaoxy@163.com