劉南南，鄭福平,2,*，張玉玉,2，范婷婷，黃明泉,2，陳海濤,2，劉玉平,2，謝建春,2，孫寶國(guó),2

（1.北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

SAFE-GC-MS分析酸牛奶揮發(fā)性成分

劉南南1，鄭福平1,2,*，張玉玉1,2，范婷婷1，黃明泉1,2，陳海濤1,2，劉玉平1,2，謝建春1,2，孫寶國(guó)1,2

（1.北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

采用溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法萃取原味酸牛奶揮發(fā)性成分，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)合保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，采用面積歸一化法加鄰二氯苯作內(nèi)標(biāo)定量，共鑒定出揮發(fā)性成分52 種，其中酸12 種、醛2 種、酮5 種、醇2 種、酯3 種、內(nèi)酯2 種、烯烴4 種、烷烴17 種、其他5 種。其中，對(duì)酸牛奶風(fēng)味影響較大的可能有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸稀酸、乙偶姻、2-壬酮、2-十一酮、壬醛、香蘭素、3-甲基-2-丁烯-1-醇、十六硫醇、丁位癸內(nèi)酯、丁位十二內(nèi)酯等。

酸牛奶；溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；揮發(fā)性成分；保留指數(shù)；標(biāo)準(zhǔn)品

酸奶由牛奶發(fā)酵制成，主要原料是牛 奶、蔗糖和乳酸菌發(fā)酵劑，是一種功能獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)品，不僅保存了牛奶中所有的營(yíng)養(yǎng)成分，而且能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)微生物的平衡。由于酸奶具有口味酸甜、細(xì)滑的特點(diǎn)，且營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛(ài)[1]。酸奶中的風(fēng)味化合物可能是乳酸菌代謝產(chǎn)生的，這些風(fēng)味化合物主要來(lái)源于乳糖、酯類、檸檬酸或蛋白質(zhì)（氨基酸）的微生物的代謝，或酶及化學(xué)的轉(zhuǎn)變[2]。酸奶中的風(fēng)味物質(zhì)主要有揮發(fā)性酸、羥基化合物、醇類、酯類等[3]。關(guān)于酸奶風(fēng)味的提取方法，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多的為固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）法[4-5]。王偉君等[6]采用同時(shí)蒸餾萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（simultaneous distillation extraction and gas chromatography-mass spectrometry，SDE-GCMS）聯(lián)用技術(shù)，測(cè)定發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)；劉寧寧等[7]采用碘滴定法和鄰苯二胺比色法測(cè)定發(fā)酵乳中的乙醛和雙乙酰含量；郭文奎等[8]利用SPME-GC-MS聯(lián)用測(cè)定酸奶發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味成分；李寧等[9]用溶劑輔助蒸發(fā)（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）、SDE和頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）3 種方法萃取結(jié)合GC-MS分析新疆發(fā)酵駱駝乳揮發(fā)性成分。

SAFE作為一種溫和的揮發(fā)性成分提取方式，在中高真空和接近室溫的條件下，利用水或有機(jī)溶劑的快速蒸發(fā)，輔助揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的蒸發(fā)，除去難揮發(fā)組分，得到的萃取物沒(méi)有“煮熟”味，香味自然逼真[10]，適合液態(tài)乳制品等食品中揮發(fā)性成分提取[11]。目前關(guān)于SAFE提取揮發(fā)性成分的研究報(bào)道，主要集中在果蔬[12-15]、酒[16]、肉制品[17-18]和乳制品[19]。

本實(shí)驗(yàn)采用SAFE裝置提取酸牛奶中的揮發(fā)性成分，意在解決SPME法萃取揮發(fā)性成分過(guò)程中由于吸附競(jìng)爭(zhēng)及萃取纖維頭吸附容量受限導(dǎo)致無(wú)法有效萃取樣品中的痕量揮發(fā)性成分的問(wèn)題[20]，與SDE法相比，萃取條件溫和，避免了熱敏性揮發(fā)性成分的損失，為乳制品及其他液體樣品的揮發(fā)性成分的分離、分析提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三元原味酸牛奶（180g，袋裝）市售，放于冰箱內(nèi)冷藏備用。

二氯甲烷（分析純，重蒸后使用）、無(wú)水硫酸鈉（分析純）、氯化鈉（分析純）、C7～C30正構(gòu)烷烴（色譜純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸、丁酸、乙偶姻等標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SAFE裝置 定制加工；XDS5復(fù)合渦輪分子泵英國(guó)Edwards公司；N-EVAP111-12位干浴氮吹儀 美國(guó)Organomation Associates公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配MSD ChemStationE.02.01.1177數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和NIST 11質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)） 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

圖1 SAFE裝置示意圖[21]Fig.1 Schematic view of SAFE equipment[21]

如圖1所示，將360 g酸牛奶經(jīng)滴液漏斗1緩慢滴入蒸餾燒瓶2（1000 mL）內(nèi)，超級(jí)恒溫水槽3和循環(huán)水的溫度均為50 ℃，在冷阱5和冷阱7中加入液氮，分子渦輪泵使系統(tǒng)壓力降至5×10-3Pa左右開(kāi)始滴加樣品，滴加約1 h，滴加完成后繼續(xù)蒸發(fā)30 min。待500 mL收集燒瓶6內(nèi)提取液自然融化后，用50 mL二氯甲烷萃取提取液4次，合并萃取液。無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，得澄清的二氯甲烷萃取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL，氮吹至0.5 mL備用。

1.3.2 GC-MS分析

色譜柱：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度50 ℃，以3 ℃/min升到180 ℃，再以6 ℃/min升到230 ℃，保持10 min；載氣流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1μL；不分流。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲5 min；質(zhì)量掃描范圍40～450 u。

1.3.3 定性定量分析

定性分析：運(yùn)用NIST 11譜庫(kù)檢索，保留匹配度不小于60的成分；通過(guò)計(jì)算保留指數(shù)結(jié)合文獻(xiàn)保留指數(shù)進(jìn)一步對(duì)化合物進(jìn)行定性，對(duì)羧酸和其他可能對(duì)酸牛奶風(fēng)味有重要影響到化合物通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)一步定性。

定量分析：采用面積歸一化法對(duì)各組分進(jìn)行定量分析，得到各組分的相對(duì)含量。進(jìn)樣時(shí)，在樣品進(jìn)樣后立刻進(jìn)1 μL 100 μg/mL的鄰二氯苯做內(nèi)標(biāo)，通過(guò)峰面積比值計(jì)算各組分含量。

2 結(jié)果與分析

圖2 酸牛奶揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of volatiles in yogurt

表1中保留了匹配度不小于60，或者文獻(xiàn)保留指數(shù)與樣品保留指數(shù)相差30以內(nèi)，或者有標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)的化合物，并認(rèn)為是可靠的。

從表1可以看出，酸牛奶經(jīng)SAFE-GC-MS分析，得到的揮發(fā)性成分主要是酸類（27.82%）、酮類（28.97%）、醛類（0.28%）、醇類（0.49%）、酯類（0.24%）、內(nèi)酯類（0.42%）、烯烴類（0.85%）烷烴類（8.93%）及其他類化合物（8.24%）。鑒定出的含量較高的化合物（相對(duì)峰面積大于1%）有丁酸、己酸、辛酸、癸酸、苯甲酸、棕櫚酸、乙偶姻、2,6,10,14-四甲基十五烷、二十二烷、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、2,4-二叔丁基苯酚。

表1 酸牛奶揮發(fā)性成分Table 1 Volatiles identified in yogurt

通常認(rèn)為酸類作為酸牛奶的主要揮發(fā)性物質(zhì)主要表現(xiàn)在滋味上[22]，也有報(bào)道稱揮發(fā)酸對(duì)酸牛奶風(fēng)味作用不大的結(jié)論并不一定正確，它至少對(duì)酸牛奶的風(fēng)味強(qiáng)度有相對(duì)較大的影響[23]，是酸牛奶清爽口感的來(lái)源[24]。酸牛奶中的脂肪酸源于脂肪的降解。本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到酸12 種，其中，乙酸具有淡淡的酸味，丁酸具有多汁味、奶油味，己酸有油脂味，辛酸具有清香，癸酸表現(xiàn)出油脂味、腐臭味。檢測(cè)到不飽和脂肪酸1 種（9-癸稀酸），呈顯著脂肪酸和蠟香，略有果香和乳香[25]。另外，有機(jī)酸的保健功能也有報(bào)道[26]。

酮類物質(zhì)多由不飽和脂肪酸的氧化、熱降解或微生物代謝產(chǎn)生。酮類物質(zhì)使酸牛奶具有特征的風(fēng)味。乙偶姻具有令人愉快的奶香氣、微甜、乳脂氣息，是本實(shí)驗(yàn)酸牛奶中含量最高的揮發(fā)性成分，文獻(xiàn)報(bào)道的酸牛奶中乙偶姻含量在1.2～28.2 μg/g，測(cè)得量（13.4 μg/g）與文獻(xiàn)[27]相符；2-壬酮具有果香、甜香、青香及椰子、奶油的氣味；2-十一酮具有蠟香、脂肪香，并帶有奶油、乳酪的味道[25]。

檢測(cè)到醛類2 種。壬醛具有蠟香、脂肪香；香蘭素具有甜香、奶油香[25]。

醇類化合物主要來(lái)自脂肪氧化，有文獻(xiàn)報(bào)道飽和醇的風(fēng)味閾值較高，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，不飽和醇的風(fēng)味閾值較低，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[28]。

內(nèi)酯類化合物，雖然含量較少但閾值較低，對(duì)酸牛奶的風(fēng)味起重要作用。內(nèi)酯類化合物源于脂肪的降解，由4或5-羥基酸經(jīng)環(huán)化反應(yīng)生成。丁位癸內(nèi)酯具有桃子、乳脂香氣；丁位十二內(nèi)酯具有脂肪、奶油、牛奶、堅(jiān)果的氣味[25]。對(duì)不同品牌酸牛奶香氣成分的研究表明，內(nèi)酯類化合物可以增添酸牛奶的奶香氣息[29]。

硫醇是含硫氨基酸分裂所得，硫醇閾值很小，故硫醇雖含量低，但對(duì)風(fēng)味影響不見(jiàn)得小。

檢測(cè)到的2,6-二叔丁基對(duì)甲酚為食品抗氧化劑，異丙醚、二甲基砜、2,4-二叔丁基苯酚的來(lái)源有待進(jìn)一步研究。

對(duì)于文獻(xiàn)中報(bào)道的酸牛奶中的典型香味成分乙醛，通過(guò)SAFE萃取沒(méi)有檢測(cè)到，可能是由于GC-MS分析過(guò)程中設(shè)有溶劑延遲（5 min），根據(jù)乙醛的文獻(xiàn)保留指數(shù)推算出乙醛出峰時(shí)間在溶劑延遲以內(nèi)，被溶劑峰掩蓋。

3 結(jié) 論

酸牛奶經(jīng)SAFE萃取、GC-MS分析，得到的揮發(fā)性成分主要是酸類（27.82%）、酮類（28.97%）、醛類（0.28%）、醇類（0.49%）、酯類（0.24%）、內(nèi)酯類（0.42%）、烷烴類（8.93%）及其他類化合物（8.24%）。其中，對(duì)酸牛奶風(fēng)味影響較大的可能有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸烯酸、乙偶姻、2-壬酮、2-十一酮、壬醛、香蘭素、3-甲基-2-丁烯-1-醇、十六硫醇、丁位癸內(nèi)酯、丁位十二內(nèi)酯。

實(shí)驗(yàn)采用SAFE結(jié)合GC-MS分析對(duì)酸牛奶的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，克服了同時(shí)蒸餾萃取時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)熱敏性香味成分影響較大的難題。與固相微萃取相比，能夠更全面的萃取酸牛奶中的揮發(fā)性成分。但是由于溶液萃取、濃縮過(guò)程中對(duì)沸點(diǎn)較低及含量較低的化合物有一定損失，還需通過(guò)與其他萃取手段結(jié)合進(jìn)行深入分析。

[1] 康歡. 酸奶中風(fēng)味物質(zhì)與酶活及感官特性關(guān)系的初探[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[2] 郭文奎. 優(yōu)質(zhì)酸奶風(fēng)味圖譜的建立[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[3] 李延華, 王偉軍, 張?zhí)m威, 等. 發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)釀造, 2008, 26(14): 8-11.

[4] BESHKOVA D, SIMOVA E, FRENGOVA G, et al. Production of flavour compounds by yogurt starter cultures[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1998, 20(3/4): 180-186.

[5] LUBBERS S, DECOURCELLE N, VALLET N, et al. Flavor release and rheology behavior of strawberry fatfree stirred yogurt during storage[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(10): 3077-3082.

[6] 王偉君, 李延華, 張?zhí)m威, 等. SDE-GC-MS法測(cè)定發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)[J].食品科學(xué), 2008, 29(6): 332-334.

[7] 劉寧寧, 郭紅敏, 葛春美, 等. 酸奶中乙醛和雙乙酰含量對(duì)其風(fēng)味的影響[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2012(1): 269-273.

[8] 郭文奎, 王玉堂, 霍貴成. 固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定酸奶發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味成分[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2012, 40(6): 58-61.

[9] LI Ning, ZHENG Fuping, CHEN Haitao, et al. Identification of volatile components in Chinese Sinkiang fermented camel milk using SAFE, SDE, and HS-SPME-GC/MS[J]. Food Chemistry, 2011, 129(3): 1242-1252.

[10] HAVEMOSE M S, JUSTESEN P, BREDIE W L P, et al. Measurement of volatile oxidation products from milk using solvent-assisted flavour evaporation and solid phase microextraction[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(7): 746-752.

[11] BENDALL J G. Aroma compounds of fresh milk from New Zealand cows fed different diets[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(10): 4825-4832.

[12] XU Yan, FAN Wenlian, QIAN M C. Characterization of aroma compounds in apple cider using solvent-assisted flavor evaporation and headspace solid-phase microextraction[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(8): 3051-3057.

[13] 何聰聰, 劉夢(mèng)雅, 劉建彬, 等. SPME和SAFE結(jié)合GC-O-MS分析鮮榨西瓜汁揮發(fā)性香氣成分[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(2): 49-53.

[14] MAJCHER M, JELE? H H. Comparison of suitability of SPME, SAFE and SDE methods for isolation of flavor compounds from extruded potato snacks[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2009, 22(6): 606-612.

[15] MURAT C, GOURRAT K, JEROSCH H, et al. Analytical comparison and sensory representativity of SAFE, SPME, and purge and trap extracts of volatile compounds from pea flour[J]. Food Chemistry, 2012, 135(3): 913-920.

[16] MO Xinliang, XU Yan, FAN Wenlian. Characterization of aroma compounds in Chinese rice wine Qu by solvent-assisted flavor evaporation and headspace solid-phase microextraction[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(4): 2462-2469.

[17] 段艷, 鄭福平, 楊夢(mèng)云, 等. ASE-SAFE/GC-MS/GC-O分析德州扒雞風(fēng)味化合物[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2014, 14(4): 222-230.

[18] 段艷, 鄭福平, 王楠, 等. MAE-SAFE/GC-MS分析醬牛肉揮發(fā)性成分[J].食品科學(xué), 2013, 34(14): 250-254.

[19] 李寧, 鄭福平, 楊夢(mèng)云, 等. SAFE用于液態(tài)奶味香精揮發(fā)性香成分的提取效果[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(18): 347-349.

[20] 徐剛, 史茗歌, 吳明紅, 等. 固相微萃取的原理及應(yīng)用[J]. 上海大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2013, 19(4): 368-373.

[21] ENGEL W, BAHR W, SCHIEBERLE P. Solvent assisted flavour evaporation: a new and versatile technique for the careful and direct isolation of aroma compounds from complex food matrices[J]. European Food Research and Technology, 1999, 209: 237-241.

[22] 葛武鵬, 李元瑞, 陳瑛, 等. 牛羊奶酸奶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)固相微萃取GC/MS分析[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2009, 39(11): 64-69.

[23] 劉景, 張雪洪, 王蔭榆. 酸奶保質(zhì)期內(nèi)風(fēng)味物質(zhì)與風(fēng)味變化研究[J].食品工業(yè)科技, 2011, 32(7): 154-156.

[24] COLLINS E B. Biosynthesis of flavor compounds by microorganisms[J]. Journal of Dairy Science, 1972, 55(7): 1022-1028.

[25] 孫寶國(guó). 食用調(diào)香術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2003: 172-179; 299-301.

[26] 張曉梅, 艾娜絲, 孫寶國(guó), 等. 馬奶蒸餾酒中揮發(fā)性成分分析[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2013, 13(11): 160-168.

[27] CHENG Hefa. Volatile flavor compounds in yogurt: a review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2010, 50(10): 938-950.

[28] 謝建春. 現(xiàn)代香味分析技術(shù)及應(yīng)用[M]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008: 17-18.

[29] 牛云蔚, 肖作兵, 張喆, 等. 不同品牌酸奶香氣成分研究[J]. 糧食與油脂, 2013, 26(9): 49-52.

Analysis of Volatiles in Yogurt by Solvent-Assisted Flavor Evaporation and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LIU Nan-nan1, ZHENG Fu-ping1,2,*, ZHANG Yu-yu1,2, FAN Ting-ting1, HUANG Ming-quan1,2, CHEN Hai-tao1,2, LIU Yu-ping1,2, XIE Jian-chun1,2, SUN Bao-guo1,2
(1. Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Volatiles in plain yogurt were extracted by solvent-assisted flavor evaporation (SAFE) and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) by combination of their retention indices with those of standards. Area normalization method was used for quantitative analysis and 1,2-dichlorobenzene was used as internal standard. A total of 52 volatiles were identified, including 12 acids, 2 aldehydes, 5 ketones, 2 alcohols, 2 lactones, 3 esters, 4 olefins, 17 hydrocarbons, and 5 other compounds. The main volatile flavor constituents in yogurt i ncluded acetic acid, butanoic acid, hexanoic acid, octanoic acid, n-decanoic acid, 9-decenoic acid, acetoin, 2-nonanone, 2-undecanone, nonanal, vanillin, 3-methyl-2-buten-1-ol, 1-hexadecanethiol, delta-decalactone, and delta-dodecalactone.

yogurt; solvent-assisted flavor evaporation (SAFE); gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); volatiles; retention indices; standards

TS252.5

A

1002-6630（2014）22-0150-04

10.7506/spkx1002-6630-201422028

2014-06-30

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100903）

劉南南（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橄懔匣瘜W(xué)。E-mail：liunan_0315@126.com

*通信作者：鄭福平（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橄懔匣瘜W(xué)。E-mail：zhengfp@th.btbu.edu.cn