劉莉萍
(深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東 深圳 518055)
固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛乳和豬肉中5 種青霉素類抗生素
劉莉萍
(深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東 深圳 518055)
建立一種用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛乳和豬肉中芐星青霉素G、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林5種青霉素類抗生素方法。樣品經(jīng)乙腈提取,Bond Elut C18固相萃取柱凈化,用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明,本方法5 種青霉素在2.0~200 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)大于0.999;牛乳樣品添加回收實(shí)驗(yàn),回收率為85.2%~122.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.43%~16.8%(n=6);豬肉樣品添加回收實(shí)驗(yàn)在50 μg/kg和100 μg/kg添加水平,除氨芐西林外,回收率在94.3%~116.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%~5.09%(n=6)。方法定量限為1.0~2.0 μg/kg。該方法具有簡便快捷、準(zhǔn)確度高、定量限低的優(yōu)點(diǎn),適用于牛乳和豬肉中青霉素類抗生素的測定。
固相萃取;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;青霉素;牛乳;豬肉
青霉素類抗生素主要用于治療革蘭氏陽性菌引起的各種感染,因高效低毒,成本低,在畜禽中廣泛應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道,青霉素可產(chǎn)生各種過敏反應(yīng),嚴(yán)重的會引發(fā)過敏性休克,同時還能產(chǎn)生耐藥性,對人體健康造成嚴(yán)重危害。因此世界各國對青霉的最大殘留量(maximum residue limits,MRL)均提出了限量要求[2-3],我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定食用動物組織中氨芐青霉素的MRL均為50 μg/kg;美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)規(guī)定青霉素類抗生素在各類農(nóng)產(chǎn)品中的MRL不超過5 μg/kg。青霉素類抗生素的分析方法主要有微生物法[4]、免疫分析法[5-7]、電化學(xué)分析法[8]、光學(xué)分析法[9-11]、毛細(xì)管電泳法[12]、高效液相色譜法[13-14]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-22],其中高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用因可彌補(bǔ)其他方法準(zhǔn)確定性、高靈敏檢測的困難,而成為國際上廣泛采用的青霉素類抗生素分析方法。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(solid-phase extraction and high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry,SPE-HPLC-MS-MS)法同時檢測牛乳和豬肉中青霉素類抗生素殘留,方法簡便快捷、定量限低,完全能滿足獸殘分析要求。
1.1 材料與試劑
甲醇、乙腈(均為色譜純);磷酸二氫鈉、正己烷、磷酸、氫氧化鈉、乙酸銨、氯化鈉(均為分析純)。
青霉素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品:氯唑西林、雙氯西林、芐星青霉素G、氨芐西林和苯唑西林(純度為96%~99%)德國Riedel-Dehaen公司;芐青霉素-D7德國Dr. Ehrenstorfer公司。
1.2 儀器與設(shè)備
API 3000液相色譜-質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源和1100高效液相色譜儀) 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;LV型吹氮濃縮儀 美國Zymark公司;Minishaker MS1型旋渦混合器 德國IKA公司;UNIVERSAL 32R型低溫離心機(jī) 德國Hettich公司;4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司;TF-123組織切碎機(jī) 日本Hitachi公司;POLYGRON PT3000型均質(zhì)器 德國Brinkmann公司;Bond Elut C18固相萃取柱(500 mg,6 mL) 美國Varian公司。
1.3 方法
1.3.1 溶液的配制
0.15 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 8.5):準(zhǔn)確稱取0.018 g磷酸二氫鈉,用去離子水溶解,并使溶液總體積達(dá)到約950 mL,然后用磷酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5,用去離子水定容至1 000 mL。
1∶1乙腈溶液:500 mL乙腈與500 mL去離子水等體積混合。
標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(100 mg/L):分別稱量經(jīng)折算相當(dāng)于10 mg(精確到0.1 mg)的各種青霉素標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈-水(50∶50,V/V)溶液溶解,定容至100 mL。此溶液各種青霉素質(zhì)量濃度分別為100 mg/L。溶液可在-18 ℃條件下避光保存6 個月。
標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(1 mg/L):準(zhǔn)確吸取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液至100 mL容量瓶中,用乙腈-水(50∶50,V/V)溶液定容。此溶液各種青霉素質(zhì)量濃度分別為1 mg/L。溶液可在4 ℃條件下避光保存1 個月。
標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:用20 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.0)配制質(zhì)量濃度分別為0、5、10、50、100、200 μg/L青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
1.3.2 色譜條件
色譜柱:SunFireTMC18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm);柱溫30 ℃;進(jìn)樣量20 μL;流速0.3 mL/min;流動相A為乙腈,流動相B為5 mmol/L乙酸銨溶液(pH 4.5),梯度洗脫程序:0~10.0 min,5%~80% A;10.0~11.0 min,80%~90% A;11.0~12.0 min,90% A;12.0~13.0 min,90%~5% A;13.0~18.0 min,5% A。
1.3.3 質(zhì)譜條件
電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測;噴霧電壓:4 000 V;離子源溫度:450 ℃;霧化氣流量:11.00 L/min;氣簾氣流量:11.00 L/min;碰撞氣流量:5.00 L/min;射入電壓:10.00 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表1 5種青霉素類抗生素的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for analysis of 5 penicillins
1.3.4 樣品處理
1.3.4.1 豬肉試樣
取代表性豬肉樣品(應(yīng)盡量避免取脂肪部分),用組織切碎機(jī)攪碎,均質(zhì)處理。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)良好的樣品2 g(精確到0.01 g)于15 mL具塞離心管中,加入芐青霉素-D7內(nèi)標(biāo)50 μg/kg,再加入2 mL磷酸緩沖溶液(50 mmol/L)和8 mL乙腈,渦旋2 min,在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。上層清液轉(zhuǎn)移到另一干凈的50 mL具塞離心管中,分別加入8、5 mL乙腈進(jìn)行提取,合并提取液。
1.3.4.2 牛乳試樣
準(zhǔn)確取5 mL牛乳樣品于50 mL具塞離心管中,稱量和記錄其質(zhì)量。加入內(nèi)標(biāo)芐青霉素-D74 μg/kg,再加入5 mL 磷酸緩沖溶液(50 mmol/L)和30 mL乙腈,渦旋2 min,在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。取20 mL上清液到另一個干凈的50 mL具塞離心管中,注意不要混入析出的乳脂肪。
1.3.5 樣品的凈化
在提取液中加入10 mL正己烷,渦旋2 min,以5 000 r/min離心5 min,去除上層有機(jī)相,正己烷重復(fù)去脂一次。于45 ℃水浴旋蒸至約5 mL,加入5 mL 0.15 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 8.5),混合均勻。
取Bond Elut C18固相萃取柱,依次用3 mL甲醇、3 mL水處理和3 mL磷酸緩沖溶液平衡。當(dāng)溶劑液面達(dá)到小柱吸附層表面時,立即將上述提取液加入萃取柱中(以1 mL/min流速),依次用3 mL 50 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 8.0)和3 mL水洗柱,最后用3 mL乙腈-水(1∶1,V/V)洗脫,定容至5.0 mL。過0.22 μm濾膜供HPLC-MS-MS分析。
2.1 提取液的選擇
選擇去離子水、4%氯化鈉溶液和磷酸二氫鈉緩沖液(0.15 mol/L)作為提取液,5 種青霉素測定回收率實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。
表2 不同提取液對5 種青霉素回收率的影響Table 2 Effects of different extractants on recoveries of 5 penicillins %
由表2可見,選擇去離子水和4%氯化鈉溶液作為提取液時,氨芐西林的回收率小于30%,其他4 種青霉素的回收率均在87%~101%之間,故此應(yīng)選用磷酸二氫鈉緩沖液作為5種青霉素提取液。
由于磷酸二氫鈉緩沖溶液濃度和pH值對氨芐西林回收率的影響較大,分別比較磷酸二氫鈉濃度和pH值對氨芐西林回收率的影響,見表3。
表3 不同濃度磷酸二氫鈉緩沖溶液和pH值對氨芐西林回收率的影響Table 3 Effect of buffer concentration and pH on recoveries of ampicillins
由表3可見,磷酸二氫鈉濃度在0.03~0.1 mol/L之間,回收率和重復(fù)性不好;當(dāng)磷酸二氫鈉濃度大于0.17 mol/L時,峰形變寬,流速減慢。本方法選擇0.15 mol/L的磷酸二氫鈉緩沖溶液作為提取液,pH值為8.5。
2.2 固相萃取柱及洗脫條件的選擇
2.2.1 固相萃取柱的選擇
分別選用Oasis HLB固相萃取柱、Bond Elut C18固相萃取柱、ENVI-18固相萃取柱、Octadecyl C18固相萃取柱、LiChrolut EN固相萃取柱和Sep-Pak C18固相萃取柱對5 種青霉素類抗生素的提取效率和凈化效果進(jìn)行比較,結(jié)果表明:Bond Elut C18固相萃取柱提取效率和凈化效果較好,重復(fù)性好;ENVI-18固相萃取柱、Octadecyl C18固相萃取柱、LiChrolut EN固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱回收率均良好,但樣品溶液過柱速度較慢,樣品預(yù)處理時間長,不同批次之間回收率有顯著差異;Sep-Pak C18固相萃取柱回收率小于60%,凈化效果不理想。本方法選用Bond Elut C18固相萃取柱凈化樣品。
2.2.2 洗脫條件的選擇
本方法選用乙腈-水(1∶1,V/V)為固相萃取樣品洗脫劑,比較不同用量洗脫劑對5 種青霉素回收率的影響,見表4。
表4 乙腈-水洗脫劑用量對5種青霉素回收率的影響Table 4 Effect of elution with different amounts of acetonitrile-water on recoveries of 5 penicillins%
由表4可見,當(dāng)洗脫劑用量小于3 mL時,氨芐西林的回收率偏低,其他4 種青霉素的回收率為82.0%~94.0%;當(dāng)洗脫劑用量為3 mL時,5種青霉素回收率為95.6%~102.2%,滿足工作要求。洗脫劑用量為4 mL時,5 種青霉素回收率沒有顯著提高。因此,本方法使用3 mL乙腈-水(1∶1,V/V)作為固相萃取柱的洗脫劑。
2.3 液相色譜分析柱的選擇
分別使用μBondapak C18(300 mm×4.0 mm,10 μm)色譜柱和SunFireTMC18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)色譜柱對5 種青霉素分析進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這兩種色譜柱的靈敏度均能滿足要求,但μBondapak C18色譜柱對氯唑西林分離度不如SunFireTMC18色譜柱好。μBondapak C18柱流速在1.5 mL/min時,進(jìn)質(zhì)譜儀之前必須分流,但分流時對5種青霉素結(jié)果的測定會產(chǎn)生一定誤差;而使用SunFireTMC18柱則不需分流,定量準(zhǔn)確度優(yōu)于μBondapak C18柱。本方法選用SunFireTMC18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)色譜柱為5 種青霉素的分析柱。
2.4 線性范圍和方法定量限
配制含苯唑西林質(zhì)量濃度為1.0~200 μg/L;芐星青霉素G、氨芐西林、氯唑西林、雙氯西林質(zhì)量濃度分別為2.0~400 μg/L的樣品基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在選定的條件下進(jìn)行測定,進(jìn)樣量為20 μL,以各青霉素與芐青霉素-D7峰面積之比為縱坐標(biāo),各青霉素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。采用空白樣品中添加青霉素抗生素的方法,以RSN不小于10的方法確定定量限,5 種青霉素的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表5。
表5 5種青霉素線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 5 Linear equations, correction coefficients and LOQs for 5 penicillins
2.5 方法的回收率和精密度
用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和和精密度實(shí)驗(yàn),樣品中添加3 個不同水平的5 種青霉素后,按本方法提取和凈化,用HPLC-MS-MS進(jìn)行測定,其回收率和精密度結(jié)果見表6。
表6 牛乳和豬肉中5 種青霉素加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 6 Recoveries and precision (RSDs) of 5 penicillins from spiked milk and pork (n = 6)
由表6可見,對于牛乳樣品,2、4 μg/kg和8 μg/kg添加水平5 種青霉素加標(biāo)回收率在85.2%~122.7%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在3.43%~16.8%之間;對于豬肉樣品,5 μg/kg添加水平,5 種青霉素加標(biāo)回收率均較低;50 μg/kg和100 μg/kg添加水平,除氨芐西林外,回收率為94.3%~116.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1.62%~5.09%,符合獸藥殘留分析要求。
豬肉組織的基質(zhì)非常復(fù)雜,其中的微量青霉素很難檢測。本實(shí)驗(yàn)采用SPE-HPLC-MS-MS分析技術(shù)建立了牛乳和豬肉中5 種青霉素類抗生素殘留的檢測和確證方法,該方法適用于牛乳和豬肉中青霉素類抗生素的定量檢測。
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Determination of 5 Penicillin Residues in Milk and Pork by SPE-HPLC-MS-MS
LIU Li-ping
(Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, China)
A method was established for the determination of 5 penicillin residues in milk and pork by solid-phase extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-HPLC-MS-MS). The samples were extracted with acetonitrile, purified on a Bond Elut C18column by solid-phase extraction, and finally detected by HPLC-MS-MS and quantified by an external standard method. As a result, the method showed a good linearity with a correlation coefficient higher than 0.999 in the range from 2.0 to 200 μg/L for 5 penicillin compounds. The average recoveries of these five penicillins in milk were in the range of 85.2% to 122.7% with relative standard deviations (RSDs) of 3.43% to 16.8% (n = 6). As for pork samples spiked at 50 and 100 μg/kg, the average recoveries were between 94.3% and 116.4% except for ampicillin with RSDs of 1.62% to 5.09%. The limit of quantification (LOQ) was in the range of 1.0–2.0 μg/kg. In conclusion, the method is convenient, rapid, accurate and sensitive so that it can be applied to determinate penicillin residues in milk and pork.
solid-phase extraction; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS); penicillins; milk; pork
TS207.3
A
1002-6630(2014)24-0308-04
10.7506/spkx1002-6630-201424059
2014-02-24
劉莉萍(1962—),女,高級工程師,碩士,研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail:maryliu@szpt.edu.cn