亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛乳和豬肉中5 種青霉素類抗生素

        2014-03-08 09:18:10劉莉萍
        食品科學(xué) 2014年24期

        劉莉萍

        (深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東 深圳 518055)

        固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛乳和豬肉中5 種青霉素類抗生素

        劉莉萍

        (深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東 深圳 518055)

        建立一種用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛乳和豬肉中芐星青霉素G、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林5種青霉素類抗生素方法。樣品經(jīng)乙腈提取,Bond Elut C18固相萃取柱凈化,用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明,本方法5 種青霉素在2.0~200 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)大于0.999;牛乳樣品添加回收實(shí)驗(yàn),回收率為85.2%~122.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.43%~16.8%(n=6);豬肉樣品添加回收實(shí)驗(yàn)在50 μg/kg和100 μg/kg添加水平,除氨芐西林外,回收率在94.3%~116.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%~5.09%(n=6)。方法定量限為1.0~2.0 μg/kg。該方法具有簡便快捷、準(zhǔn)確度高、定量限低的優(yōu)點(diǎn),適用于牛乳和豬肉中青霉素類抗生素的測定。

        固相萃取;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;青霉素;牛乳;豬肉

        青霉素類抗生素主要用于治療革蘭氏陽性菌引起的各種感染,因高效低毒,成本低,在畜禽中廣泛應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道,青霉素可產(chǎn)生各種過敏反應(yīng),嚴(yán)重的會引發(fā)過敏性休克,同時還能產(chǎn)生耐藥性,對人體健康造成嚴(yán)重危害。因此世界各國對青霉的最大殘留量(maximum residue limits,MRL)均提出了限量要求[2-3],我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定食用動物組織中氨芐青霉素的MRL均為50 μg/kg;美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)規(guī)定青霉素類抗生素在各類農(nóng)產(chǎn)品中的MRL不超過5 μg/kg。青霉素類抗生素的分析方法主要有微生物法[4]、免疫分析法[5-7]、電化學(xué)分析法[8]、光學(xué)分析法[9-11]、毛細(xì)管電泳法[12]、高效液相色譜法[13-14]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-22],其中高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用因可彌補(bǔ)其他方法準(zhǔn)確定性、高靈敏檢測的困難,而成為國際上廣泛采用的青霉素類抗生素分析方法。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(solid-phase extraction and high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry,SPE-HPLC-MS-MS)法同時檢測牛乳和豬肉中青霉素類抗生素殘留,方法簡便快捷、定量限低,完全能滿足獸殘分析要求。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        甲醇、乙腈(均為色譜純);磷酸二氫鈉、正己烷、磷酸、氫氧化鈉、乙酸銨、氯化鈉(均為分析純)。

        青霉素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品:氯唑西林、雙氯西林、芐星青霉素G、氨芐西林和苯唑西林(純度為96%~99%)德國Riedel-Dehaen公司;芐青霉素-D7德國Dr. Ehrenstorfer公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        API 3000液相色譜-質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源和1100高效液相色譜儀) 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;LV型吹氮濃縮儀 美國Zymark公司;Minishaker MS1型旋渦混合器 德國IKA公司;UNIVERSAL 32R型低溫離心機(jī) 德國Hettich公司;4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司;TF-123組織切碎機(jī) 日本Hitachi公司;POLYGRON PT3000型均質(zhì)器 德國Brinkmann公司;Bond Elut C18固相萃取柱(500 mg,6 mL) 美國Varian公司。

        1.3 方法

        1.3.1 溶液的配制

        0.15 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 8.5):準(zhǔn)確稱取0.018 g磷酸二氫鈉,用去離子水溶解,并使溶液總體積達(dá)到約950 mL,然后用磷酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5,用去離子水定容至1 000 mL。

        1∶1乙腈溶液:500 mL乙腈與500 mL去離子水等體積混合。

        標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(100 mg/L):分別稱量經(jīng)折算相當(dāng)于10 mg(精確到0.1 mg)的各種青霉素標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈-水(50∶50,V/V)溶液溶解,定容至100 mL。此溶液各種青霉素質(zhì)量濃度分別為100 mg/L。溶液可在-18 ℃條件下避光保存6 個月。

        標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(1 mg/L):準(zhǔn)確吸取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液至100 mL容量瓶中,用乙腈-水(50∶50,V/V)溶液定容。此溶液各種青霉素質(zhì)量濃度分別為1 mg/L。溶液可在4 ℃條件下避光保存1 個月。

        標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:用20 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.0)配制質(zhì)量濃度分別為0、5、10、50、100、200 μg/L青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

        1.3.2 色譜條件

        色譜柱:SunFireTMC18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm);柱溫30 ℃;進(jìn)樣量20 μL;流速0.3 mL/min;流動相A為乙腈,流動相B為5 mmol/L乙酸銨溶液(pH 4.5),梯度洗脫程序:0~10.0 min,5%~80% A;10.0~11.0 min,80%~90% A;11.0~12.0 min,90% A;12.0~13.0 min,90%~5% A;13.0~18.0 min,5% A。

        1.3.3 質(zhì)譜條件

        電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測;噴霧電壓:4 000 V;離子源溫度:450 ℃;霧化氣流量:11.00 L/min;氣簾氣流量:11.00 L/min;碰撞氣流量:5.00 L/min;射入電壓:10.00 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

        表1 5種青霉素類抗生素的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for analysis of 5 penicillins

        1.3.4 樣品處理

        1.3.4.1 豬肉試樣

        取代表性豬肉樣品(應(yīng)盡量避免取脂肪部分),用組織切碎機(jī)攪碎,均質(zhì)處理。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)良好的樣品2 g(精確到0.01 g)于15 mL具塞離心管中,加入芐青霉素-D7內(nèi)標(biāo)50 μg/kg,再加入2 mL磷酸緩沖溶液(50 mmol/L)和8 mL乙腈,渦旋2 min,在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。上層清液轉(zhuǎn)移到另一干凈的50 mL具塞離心管中,分別加入8、5 mL乙腈進(jìn)行提取,合并提取液。

        1.3.4.2 牛乳試樣

        準(zhǔn)確取5 mL牛乳樣品于50 mL具塞離心管中,稱量和記錄其質(zhì)量。加入內(nèi)標(biāo)芐青霉素-D74 μg/kg,再加入5 mL 磷酸緩沖溶液(50 mmol/L)和30 mL乙腈,渦旋2 min,在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。取20 mL上清液到另一個干凈的50 mL具塞離心管中,注意不要混入析出的乳脂肪。

        1.3.5 樣品的凈化

        在提取液中加入10 mL正己烷,渦旋2 min,以5 000 r/min離心5 min,去除上層有機(jī)相,正己烷重復(fù)去脂一次。于45 ℃水浴旋蒸至約5 mL,加入5 mL 0.15 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 8.5),混合均勻。

        取Bond Elut C18固相萃取柱,依次用3 mL甲醇、3 mL水處理和3 mL磷酸緩沖溶液平衡。當(dāng)溶劑液面達(dá)到小柱吸附層表面時,立即將上述提取液加入萃取柱中(以1 mL/min流速),依次用3 mL 50 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 8.0)和3 mL水洗柱,最后用3 mL乙腈-水(1∶1,V/V)洗脫,定容至5.0 mL。過0.22 μm濾膜供HPLC-MS-MS分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 提取液的選擇

        選擇去離子水、4%氯化鈉溶液和磷酸二氫鈉緩沖液(0.15 mol/L)作為提取液,5 種青霉素測定回收率實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。

        表2 不同提取液對5 種青霉素回收率的影響Table 2 Effects of different extractants on recoveries of 5 penicillins %

        由表2可見,選擇去離子水和4%氯化鈉溶液作為提取液時,氨芐西林的回收率小于30%,其他4 種青霉素的回收率均在87%~101%之間,故此應(yīng)選用磷酸二氫鈉緩沖液作為5種青霉素提取液。

        由于磷酸二氫鈉緩沖溶液濃度和pH值對氨芐西林回收率的影響較大,分別比較磷酸二氫鈉濃度和pH值對氨芐西林回收率的影響,見表3。

        表3 不同濃度磷酸二氫鈉緩沖溶液和pH值對氨芐西林回收率的影響Table 3 Effect of buffer concentration and pH on recoveries of ampicillins

        由表3可見,磷酸二氫鈉濃度在0.03~0.1 mol/L之間,回收率和重復(fù)性不好;當(dāng)磷酸二氫鈉濃度大于0.17 mol/L時,峰形變寬,流速減慢。本方法選擇0.15 mol/L的磷酸二氫鈉緩沖溶液作為提取液,pH值為8.5。

        2.2 固相萃取柱及洗脫條件的選擇

        2.2.1 固相萃取柱的選擇

        分別選用Oasis HLB固相萃取柱、Bond Elut C18固相萃取柱、ENVI-18固相萃取柱、Octadecyl C18固相萃取柱、LiChrolut EN固相萃取柱和Sep-Pak C18固相萃取柱對5 種青霉素類抗生素的提取效率和凈化效果進(jìn)行比較,結(jié)果表明:Bond Elut C18固相萃取柱提取效率和凈化效果較好,重復(fù)性好;ENVI-18固相萃取柱、Octadecyl C18固相萃取柱、LiChrolut EN固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱回收率均良好,但樣品溶液過柱速度較慢,樣品預(yù)處理時間長,不同批次之間回收率有顯著差異;Sep-Pak C18固相萃取柱回收率小于60%,凈化效果不理想。本方法選用Bond Elut C18固相萃取柱凈化樣品。

        2.2.2 洗脫條件的選擇

        本方法選用乙腈-水(1∶1,V/V)為固相萃取樣品洗脫劑,比較不同用量洗脫劑對5 種青霉素回收率的影響,見表4。

        表4 乙腈-水洗脫劑用量對5種青霉素回收率的影響Table 4 Effect of elution with different amounts of acetonitrile-water on recoveries of 5 penicillins%

        由表4可見,當(dāng)洗脫劑用量小于3 mL時,氨芐西林的回收率偏低,其他4 種青霉素的回收率為82.0%~94.0%;當(dāng)洗脫劑用量為3 mL時,5種青霉素回收率為95.6%~102.2%,滿足工作要求。洗脫劑用量為4 mL時,5 種青霉素回收率沒有顯著提高。因此,本方法使用3 mL乙腈-水(1∶1,V/V)作為固相萃取柱的洗脫劑。

        2.3 液相色譜分析柱的選擇

        分別使用μBondapak C18(300 mm×4.0 mm,10 μm)色譜柱和SunFireTMC18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)色譜柱對5 種青霉素分析進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這兩種色譜柱的靈敏度均能滿足要求,但μBondapak C18色譜柱對氯唑西林分離度不如SunFireTMC18色譜柱好。μBondapak C18柱流速在1.5 mL/min時,進(jìn)質(zhì)譜儀之前必須分流,但分流時對5種青霉素結(jié)果的測定會產(chǎn)生一定誤差;而使用SunFireTMC18柱則不需分流,定量準(zhǔn)確度優(yōu)于μBondapak C18柱。本方法選用SunFireTMC18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)色譜柱為5 種青霉素的分析柱。

        2.4 線性范圍和方法定量限

        配制含苯唑西林質(zhì)量濃度為1.0~200 μg/L;芐星青霉素G、氨芐西林、氯唑西林、雙氯西林質(zhì)量濃度分別為2.0~400 μg/L的樣品基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在選定的條件下進(jìn)行測定,進(jìn)樣量為20 μL,以各青霉素與芐青霉素-D7峰面積之比為縱坐標(biāo),各青霉素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。采用空白樣品中添加青霉素抗生素的方法,以RSN不小于10的方法確定定量限,5 種青霉素的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表5。

        表5 5種青霉素線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 5 Linear equations, correction coefficients and LOQs for 5 penicillins

        2.5 方法的回收率和精密度

        用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和和精密度實(shí)驗(yàn),樣品中添加3 個不同水平的5 種青霉素后,按本方法提取和凈化,用HPLC-MS-MS進(jìn)行測定,其回收率和精密度結(jié)果見表6。

        表6 牛乳和豬肉中5 種青霉素加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 6 Recoveries and precision (RSDs) of 5 penicillins from spiked milk and pork (n = 6)

        由表6可見,對于牛乳樣品,2、4 μg/kg和8 μg/kg添加水平5 種青霉素加標(biāo)回收率在85.2%~122.7%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在3.43%~16.8%之間;對于豬肉樣品,5 μg/kg添加水平,5 種青霉素加標(biāo)回收率均較低;50 μg/kg和100 μg/kg添加水平,除氨芐西林外,回收率為94.3%~116.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1.62%~5.09%,符合獸藥殘留分析要求。

        3 結(jié) 論

        豬肉組織的基質(zhì)非常復(fù)雜,其中的微量青霉素很難檢測。本實(shí)驗(yàn)采用SPE-HPLC-MS-MS分析技術(shù)建立了牛乳和豬肉中5 種青霉素類抗生素殘留的檢測和確證方法,該方法適用于牛乳和豬肉中青霉素類抗生素的定量檢測。

        [1] 程中華. 再談濫用青霉素[J]. 中國藥業(yè), 1998, 7(4): 31.

        [2] 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部2002年235號公告: 動物性食品中獸藥最高殘留限量[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2002.

        [3] 陳卓婧, 閻淑男, 夏瀾, 等. 農(nóng)產(chǎn)品中青霉素檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013(11): 1476-1479.

        [4] 李延華, 王偉君, 張?zhí)m威, 等. 牛乳中青霉素G殘留三種檢測方法的比較研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(3): 325-327.

        [5] SAMSONVA Z H, SHCHELOKOVA O S, IVANOVA N L, et al. Enzyme immunoassay of ampicillin in milk[J]. Prikl Biokhim Mikrobiol, 2005, 41(6): 668-675.

        [6] 楊鵬華, 林敏, 倪鳳娥. 一種牛乳中青霉素G殘留ELISA檢測方法的建立[J]. 食品工業(yè), 2010, 31(4): 96-98.

        [7] 李效君, 李蘭, 馬潔, 等. 電化學(xué)免疫法測定豬肉組織中青霉素的研究[J]. 化學(xué)傳感器, 2009, 29(1): 25-31.

        [8] 劉平, 朱亞琪, 馬潔, 等. 氧化蘇木精復(fù)合電極測定牛乳中殘留青霉素[J]. 應(yīng)用化學(xué), 2006, 23(5): 519-523.

        [9] 畢莉, 張丹揚(yáng), 張尹, 等. 催化動力學(xué)光度法測定青霉素G及其機(jī)理研究[J]. 分析試驗(yàn)室, 2011, 30(5): 22-25.

        [10] CHIVULESCU A I, BADEA-DONI M, CHEREGI M C, et al. Determination of amoxicillin, ampicillin and penicillin using a flow injection analysis method with chemiluninescence detection[J]. Revue Roumaine de Chimie, 2011, 56(3): 247-254.

        [11] 馬小紅, 趙武奇, 谷月, 等. 牛乳中青霉素近紅外光譜定量分析[J].中國釀造, 2012, 31(12): 124-127.

        [12] 陳玎玎, 孟歡歡, 祁克宗, 等. 高效毛細(xì)管電泳法檢測雞肉中青霉素類藥物殘留量[J]. 理化檢驗(yàn): 化學(xué)分冊, 2011, 47(11): 1293-1298.

        [13] 葉能勝, 谷學(xué)新, 張琦. 固相萃取-高效液相色譜法檢測牛乳和豬肉中5 種β-內(nèi)酰胺類抗生素[J]. 分析試驗(yàn)室, 2010, 9(6): 73-77.

        [14] XIE Kaizhou, JIA Longfei, XU Dong, et al. Simulataneous determination of smoxicillin and sampicillin in eggs by reversed-phase high-performance liquid chromatography with fluorescence detection using pre-column derivatization[J]. Journal of Chromatographic Science, 2012, 50(7): 620-624.

        [15] 郭萌萌, 李兆新, 譚志軍, 等. 分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中的8 種青霉素殘留[J]. 分析測試學(xué)報(bào), 2011, 30(9): 969-975.

        [16] 范瑩瑩, 其魯, 楊樹民. 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測豬肉中5 種青霉素的殘留量[J]. 分析試驗(yàn)室, 2007, 26(12): 76-79.

        [17] 郞友, 單藝, 滿朝新, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳及乳制品中青霉素類藥物殘留[J]. 中國乳品工業(yè), 2013, 41(5): 48-51.

        [18] HAMMEL Y A, MOHAMED R, GREMAUD E, et al. Multi-screening approach to monitor and quantify 42 antibiotic residues in honey by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1177(1): 58-76.

        [19] 方慧文, 盧躍鵬, 周原. 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時快速測定牛乳中不同類型的11 種獸藥殘留[J]. 分析測試學(xué)報(bào), 2013, 32(2): 262-266.

        [20] 劉創(chuàng)基, 王海, 杜振霞, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛肉中青霉素類藥物及其代謝產(chǎn)物[J]. 分析化學(xué), 2011, 39(5): 617-622.

        [21] 李學(xué)民, 曹彥忠, 張近杰, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定河豚魚和鰻魚中9 種青霉素類抗生素[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào), 2013, 4(4): 1165-1172.

        [22] 陳瑞春, 賈海濤, 艾連峰, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛乳和奶粉中9 種青霉素類藥物殘留量[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(18): 249-252.

        Determination of 5 Penicillin Residues in Milk and Pork by SPE-HPLC-MS-MS

        LIU Li-ping
        (Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, China)

        A method was established for the determination of 5 penicillin residues in milk and pork by solid-phase extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-HPLC-MS-MS). The samples were extracted with acetonitrile, purified on a Bond Elut C18column by solid-phase extraction, and finally detected by HPLC-MS-MS and quantified by an external standard method. As a result, the method showed a good linearity with a correlation coefficient higher than 0.999 in the range from 2.0 to 200 μg/L for 5 penicillin compounds. The average recoveries of these five penicillins in milk were in the range of 85.2% to 122.7% with relative standard deviations (RSDs) of 3.43% to 16.8% (n = 6). As for pork samples spiked at 50 and 100 μg/kg, the average recoveries were between 94.3% and 116.4% except for ampicillin with RSDs of 1.62% to 5.09%. The limit of quantification (LOQ) was in the range of 1.0–2.0 μg/kg. In conclusion, the method is convenient, rapid, accurate and sensitive so that it can be applied to determinate penicillin residues in milk and pork.

        solid-phase extraction; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS); penicillins; milk; pork

        TS207.3

        A

        1002-6630(2014)24-0308-04

        10.7506/spkx1002-6630-201424059

        2014-02-24

        劉莉萍(1962—),女,高級工程師,碩士,研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail:maryliu@szpt.edu.cn

        精品一区二区三区女同免费| 日韩精品一区二区三区免费视频| 超薄肉色丝袜一区二区| 中文字幕乱码无码人妻系列蜜桃| 无码a∨高潮抽搐流白浆| 国产亚洲高清不卡在线观看| 亚洲一区二区三区最新视频| 精品久久有码中文字幕| 老妇女性较大毛片| 亚洲国产成人AV人片久久网站| 一区二区三区在线日本| 中国国产不卡视频在线观看 | 视频一区精品自拍| 中文字幕亚洲视频三区| 午夜久久久久久禁播电影| 日本免费一区二区三区| 欧美日韩一区二区三区色综合| 97久久综合精品国产丝袜长腿| 亚洲av综合色区无码专区桃色| 欧产日产国产精品精品| 色婷婷久久免费网站| 中文字幕色资源在线视频| а√中文在线资源库| 18级成人毛片免费观看| 日本亚洲一级中文字幕| av网站在线观看亚洲国产| 少妇仑乱a毛片| 国产无码swag专区| 一区二区三区日本美女视频| 无码毛片内射白浆视频| 色偷偷av亚洲男人的天堂| 丰满人妻一区二区乱码中文电影网| 国产一区二区三区在线男友| 99热爱久久99热爱九九热爱| 欧美视频第一页| 国产白浆大屁股精品视频拍| 欧美激情肉欲高潮视频| 精品久久久久久久中文字幕| 亚洲av偷拍一区二区三区| 一本一道久久精品综合| 无码国产精品一区二区高潮|