白寶清，李美萍，張生萬*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

QuEChERS-DLLME-高效液相色譜法測定蔬菜中溴蟲腈和氟蟲腈殘留

白寶清，李美萍，張生萬*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

建立同時檢測蔬菜中溴蟲腈和氟蟲腈殘留的QuEChERS-分散液液微萃取-高效液相色譜方法。樣品用乙腈溶液提取，硫酸鎂和氯化鈉鹽析后，加入N-丙基乙二胺和石墨化碳吸附凈化，分散液液微萃取富集，用SunFire-C18反相色譜柱分離，以甲醇和水作為流動相梯度洗脫，二極管陣列檢測器進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量。并考察萃取劑和分散劑的類型及體積和萃取時間對萃取效率的影響。該方法在3.0～460 ?g/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）不小于0.998 6，檢測限0.70～0.86 ?g/k g。3個不同加標(biāo)水平的平均回收率為90.5%～108.5%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。結(jié)果表明，該方法簡便、準(zhǔn)確、并且成本較低，適用于蔬菜中溴蟲腈和氟蟲腈農(nóng)藥殘留的測定。

溴蟲腈；氟蟲腈；QuEChERS；分散液液微萃取；高效液相色譜

溴蟲腈是吡咯類殺蟲、殺螨劑，昆蟲取食或接觸溴蟲腈后在體內(nèi)多功能氧化酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袣⑾x活性的化合物。氟蟲腈是苯基吡唑類新型高活性殺蟲劑[1]，其作用機(jī)制在于阻礙昆蟲γ-氨基丁酸控制的氯化物代謝，因而對葉蟬、鱗翅目幼蟲、蚜蟲、蠅類和飛虱等害蟲有很高的殺蟲活性，對作物無藥害。兩種農(nóng)藥具有防蟲效果好、用量低、起效時間長等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在農(nóng)作物生產(chǎn)中廣泛使用。隨著溴蟲腈和氟蟲腈使用范圍的逐漸擴(kuò)大和用量的不斷增加，其殘留的毒副作用也逐步顯現(xiàn)。它們在食品和環(huán)境中半衰期長，殘留物能夠在生物體中富集，對生物體的健康具有較大毒害風(fēng)險。由于溴蟲腈和氟蟲腈在青菜、白菜、大豆、黃瓜、莧菜、小松菜、四季豆、大蔥、胡蘿卜等蔬菜上的廣泛使用，對蔬菜蟲害的控制起到了很重要的作用，但同時也不可避免地產(chǎn)生了農(nóng)藥殘留問題。隨著人們生活水平的提高，蔬菜中農(nóng)藥殘留問題已日漸受到重視，目前國際上對溴蟲腈和氟蟲腈在食品中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)也日益嚴(yán)格。因此，建立蔬菜中簡單、準(zhǔn)確、成本低的檢測方法具有十分重要的意義。

目前溴蟲腈和氟蟲腈在蔬菜和水果中的主要測定方法為氣相色譜法[2-3]、液相色譜法[4-7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]，上述方法前處理富集程度低，或者操作步驟繁瑣，使用裝置昂貴。本方法針對已有報道存在的不足，基于QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）的快速提取[15-17]和分散液液微萃?。╠ispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）[18-19]的快速富集原理，使用高效液相色譜建立分析檢測蔬菜中溴蟲腈和氟蟲腈殘留的方法。方法將DLLME良好的萃取富集與高效液相色譜的高分離能力結(jié)合起來，具有靈敏度高、重復(fù)性好、可操作性強(qiáng)，免去其他方法繁瑣的凈化步驟，適合大批量蔬菜樣品中溴蟲腈和氟蟲腈殘留的定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溴蟲腈、氟蟲腈（含量大于99.8%）標(biāo)準(zhǔn)品、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳百靈威科技有限公司；乙腈、甲醇、四氯化碳、四氯乙烯、氯仿、氯苯（均為色譜純） 德國Merck公司；丙酮、正己烷、乙酸乙酯、MgSO4（均為分析純）、NaCl（優(yōu)級純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

1525高效液相色譜儀（含二極管陣列檢測器和工作站） 美國Waters公司；FJ-200型高速分散均質(zhì)機(jī)上海標(biāo)本模型廠；HC-3018型高速離心機(jī) 安徽中科中佳科技儀器有限公司；DV215CD電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；XW-80A旋渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取溴蟲腈、氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容到5 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于－20 ℃保存。移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液各500 μL于5 mL的容量瓶中，用甲醇定容到5 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)混合液，4 ℃冰箱存放備用。用流動相逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合液，配制系列工作溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：SunFire-C18（250 mm×46 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：溴蟲腈和氟蟲腈分別在260、280 nm波長處檢測；進(jìn)樣量：20 μL；流動相：乙腈-水；梯度洗脫程序：在0～6 min，乙腈由30%線性遞增至70%，6～8 min，乙腈70%，8～10 min，乙腈由70%線性遞增至80%，10～17 min，乙腈80%，17～20 min，乙腈由80%線性遞減到30%，20～30 min，乙腈30%。色譜峰保留時間定性，外標(biāo)法定量，進(jìn)樣體積20 μL。

1.3.3 樣品前處理

稱取勻漿粉碎樣品10 g 于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入乙腈10 mL，渦旋2 min；加入2.0 g MgSO4和1.0 g NaCl，劇烈振蕩1 min，于5 000 r/min離心2 min；取上清液6 mL，加入100 mg PSA和75 mg石墨化碳，渦旋3 min，于5 000 r/min離心5 min；取上層溶液1 mL于10 mL具塞尖底離心試管中，加入5 mL去離子水，再加入30 μL四氯化碳，振蕩30 s，形成均勻的乳濁液，于5 000 r/min離心5 min 使之分層，用注射器吸取底部有機(jī)溶液于1.5 mL離心管中，用氮?dú)獯蹈?，加入和四氯化碳等體積的甲醇復(fù)溶，供高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS提取劑的選擇

QuEChERS前處理中常用甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷與丙酮混合液作為農(nóng)藥殘留的提取劑[20-21]，在樣品中添加一定量溴蟲腈和氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，分別用相同體積的乙腈、丙酮-正己烷（3∶7，V/V）、甲醇和乙酸乙酯提取，如圖1所示，結(jié)果表明，與甲醇、乙酸乙酯、正己烷與丙酮混合液相比，乙腈的提取效果優(yōu)于其他。并且乙腈提取蔬菜中色素、蠟質(zhì)、脂肪等非極性成分的能力相對較弱，更容易通過后續(xù)加入吸附劑除去基質(zhì)的干擾物質(zhì)。

圖1 QuEChERS提取劑的選擇Fig.1 Screening of extractant for QuEChERS

2.2 吸附劑的優(yōu)化

比較乙腈提取液中加入PSA和石墨化碳和不加PSA和石墨化碳時對色譜分離效果的影響，如圖2所示。并對PSA和石墨化碳用量進(jìn)行了考察，結(jié)果如表1所示。

表1 PSA和石墨化碳用量對回收率的影響Table 1 Effect of PSA and graphitized carbon amounts on the recoveries of fipronil and chlorfenapyr

圖2 PSA和石墨化碳對凈化效果的影響Fig.2 Effect of PSA and graphitized carbon on clean-up efficiency

由圖2可知，不加吸附劑PSA和石墨化碳時，乙腈提取液中色素、蠟質(zhì)和脂肪等成分會干擾目標(biāo)化合物出峰，加入PSA和石墨化碳以后，可以有效地除去基質(zhì)中的干擾物對待測物色譜峰的影響，同時減少雜質(zhì)對儀器和色譜柱的損害[22]。由表1可知，當(dāng)PSA和石墨化碳加入量較小時，雖然對溴蟲腈和氟蟲腈吸附很小，但不能有效地除去基質(zhì)中的干擾物，隨著加入量的增加，能夠有效地除去干擾物的影響，但對溴蟲腈和氟蟲腈吸附也同時增大。故實驗選擇PSA和石墨化碳的加入量分別為100 mg和75 mg用于凈化，能夠較好地兼顧兩者。

2.3 DLLME方法的優(yōu)化

2.3.1 萃取劑的選擇

對相同體積的四氯化碳、三氯甲烷、氯苯、四氯乙烯4 種萃取劑對溴蟲腈和氟蟲腈萃取富集效果進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖3所示。表明同等條件下四氯化碳的萃取效果最好，故選擇四氯化碳作為萃取劑。

圖3 萃取劑的選擇Fig.3 Selection of extraction solvent

2.3.2 萃取劑用量的選擇

在DLLME過程中，萃取劑的用量對目標(biāo)分析物的萃取效率有重要的影響。分別對30、40、50、50、100 μL體積的四氯化碳作為萃取劑，1.0 mL乙腈作為分散劑體系進(jìn)行實驗，如圖4所示。溴蟲腈與氟蟲腈的萃取效率隨著四氯化碳用量的增加而減少。由于20 μL是實驗中高效液相色譜儀的進(jìn)樣量，不宜選擇20 μL作為萃取體積。因此，四氯化碳的最佳用量為30 μL。

圖4 萃取劑用量的選擇Fig.4 Effect of the amount of extraction solvent on peak area

2.3.3 分散劑用量的選擇

分散劑乙腈用量直接影響四氯化碳能否有效地在水中分散，進(jìn)而影響對待測物的萃取效果，實驗考察乙腈體積在0.5～2.0 mL范圍內(nèi)對待測物的萃取富集效果，如圖5所示。結(jié)果表明在0.5～1.0 mL范圍內(nèi)，待測物的萃取富集效果隨著乙腈體積的增加而增加，在乙腈體積為1.0 mL時達(dá)到最大值，之后萃取效果隨著乙腈用量的增加而降低。原因是隨著乙腈用量的增加，待測物在水中的溶解度也隨之增大，萃取效率降低。因此實驗中乙腈的最佳用量為1.0 mL。

圖5 分散劑用量的選擇Fig.5 Effect of the amount of disperser solvent on peak area

2.3.4 萃取時間的選擇

考察萃取時間在10～120 s范圍內(nèi)對待測物萃取效果的影響，如圖6所示。萃取時間為10 s時，體系不能有效地建立平衡。萃取時間在10～30 s內(nèi)萃取效率逐漸增大，當(dāng)萃取時間大于30 s后萃取效果基本趨于穩(wěn)定，故選擇30 s作為最佳萃取時間。

圖6 萃取時間的選擇Fig.6 Effect of extraction time on peak area

2.4 色譜條件的優(yōu)化

實驗比較了甲醇-水、乙-水腈兩流動相體系，結(jié)果表明以甲醇-水溶液作為流動相體系時，溴蟲腈和氟蟲腈色譜峰峰形比較好，信號響應(yīng)也相應(yīng)增強(qiáng)。所以確定流動相為甲醇-水溶液，并且優(yōu)化了流動相梯度比例?？疾炝虽逑x腈和氟蟲腈的210～400 nm范圍內(nèi)兩組分的紫外吸收情況，檢測波長為280 nm時，空白樣品色譜圖如7所示，加標(biāo)樣品的色譜圖如圖8所示，結(jié)果表明溴蟲腈和氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)品分別在260 nm和280 nm波長處靈敏度高，基質(zhì)干擾小。故選擇260 nm和280 nm作為最佳檢測波長。

圖7 空白樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of blank sample

圖8 加標(biāo)樣品色譜圖Fig.8 Chromatogram of spiked sample

2.5 方法的線性關(guān)系、檢出限、定量限

表2 方法的回歸方程、檢測限、定量限和重復(fù)性Table 2 Standard curve equations, LOD, LOQ and repeatability for fipronil and chlorfenapyr

圖9 溴蟲腈和氟蟲腈的最低量（3 μgg/kg）色譜圖Fig.9 Chromatogram of chlorfenapyr and fipronil at the lowest concentration level

圖10 溴蟲腈和氟蟲腈的最高量（460 μgg/kg）色譜圖Fig.10 Chromatogram of chlorfenapyr and fipronil at the highest concentration level

試以分析物的峰面積Y對分析物的含量X/（μg/kg）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2所示。結(jié)果表明溴蟲腈和氟蟲腈農(nóng)藥在3.0～460 μg/kg范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均不小于0.998 6，檢測波長為280 nm時，溴蟲腈和氟蟲腈的最低添加量為3.0 μg/kg的加標(biāo)色譜圖如圖9所示，最高添加量460 μg/kg的加標(biāo)色譜圖如圖10所示，結(jié)果表明方法的檢測限（按信噪比RSN=3計） 分別為0.70～0.86 ?g/kg，定量限（按RSN=10計）分別為3.0～3.5 μg/kg。說明該方法具有富集效果好，富集倍數(shù)35 倍、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測要求。

2.6 回收率和精密度

分別在10 g搗碎的蔬菜樣品中添加5、50、150 μg/kg溴蟲腈和氟蟲腈混合溶液，按上述最佳實驗條件萃取后進(jìn)樣分析。每個添加水平平行測定3 次，以峰面積計算3 種添加水平的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），測定結(jié)果見表3。表明溴蟲腈和氟蟲腈回收率在90.5%～108.5%范圍內(nèi)，RSD小于10%。

表3 黃瓜、豆角樣品的回收率和精密度（n=3）Table 3 Recovery rates and precision of fipronil and chlorfenapyr from spiked samples of cucumber and green bean (n == 33))

2.7 實際樣品測定

按照最優(yōu)的實驗方法分別對市場上購買的10 個黃瓜樣品和15 個豆角樣品進(jìn)行了分析檢測，結(jié)果均未檢出溴蟲腈和氟蟲腈農(nóng)藥殘留。

3 結(jié) 論

建立QuEChERS-DLLME-HPLC法同時測定蔬菜中溴蟲腈和氟蟲腈殘留的方法。樣品前處理采用QuEChERS提取凈化，DLLME萃取富集的技術(shù)，探討了吸附劑PSA和石墨化碳用量對基質(zhì)中干擾雜質(zhì)的凈化效果，萃取劑種類與體積、分散劑體積以及萃取時間對萃取效果的影響；方法的線性相關(guān)系數(shù)、回收率、RSD等各項參數(shù)指標(biāo)，表明方法的靈敏度和精確度均滿足實際樣品檢測的需要。同時本方法重復(fù)性好、檢出限低、富集倍數(shù)高。相對于較昂貴的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用而言，高效液相色譜法更易在普通實驗室進(jìn)行，可以作為溴蟲腈和氟蟲腈殘留的檢測方法。

[1] 操海群, 施艷紅, 花日茂. 辣椒、白菜中氟蟲腈殘留分析方法的研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(9): 377-380.

[2] 周昱, 徐敦明, 陳達(dá)捷, 等. 固相微萃取-氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法測定茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留[J]. 色譜, 2011, 29(7): 656-661.

[3] KURZ M H S, MARTEL S, GONCALVES F, et al. Development of a fast method for the determination of the insecticide fipronil and its metabolites in environmental waters by SPE and GC-ECD[J]. Journal of the Brazilian Chemical Society, 2013, 24(4): 631-638.

[4] CAO Yongsong, CHEN Jiuxin WANG Yuelong, et al. HPLC/ UV analysis of chlorfenapyr residues in cabbage and soil to study the dynamics of different formulations[J]. Science of the Total Environment, 2005, 350(1/3): 38-46.

[5] TOMASINI D, SAMPAIO M R F, CARDOSO L V, et al. Comparison of dispersive liquid-liquid microextraction and the modified QuEChERS method for the determination of fipronil in honey by high performance liquid chromatography with diode-array detection[J]. Analytical Methods, 2011, 3(8): 1893-1900.

[6] HADJMOHAMMADI M R, NIKOU S M, KAMEL K. Determination of fipronil residue in soil and water in the rice fields in north of Iran by RP-HPLC method[J]. Acta Chimica Slovenica, 2006, 53(4): 517-520.

[7] CID Y P, FERREIRA T P, MEDEIROS D M V C, et al. Determination of fipronil in bovine plasma by solid phase extraction and liquid chromatography with ultraviolet detection[J]. Quimica Nova, 2010, 35(10): 2063-2066.

[8] RAMASUBRAMANIAN T, PARAMASIVAM M, JAYANTHI R, et al. A simple and sensitive single-step method for gas chromatography-mass spectrometric determination of fipronil and its metabolites in sugarcane juice, jaggery and sugar[J]. Food Chemistry, 2014, 150: 408-413.

[9] PARAMASIVAM M, CHANDRASEKARAN S. Determination of fipronil and its major metabolites in vegetables, fruit and soil using QuEChERS and gas chromatography-mass spectrometry[J]. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 2013, 93(11): 1203-1211.

[10] ARAUJO L, TROCONIS M, CUBILLAN D, et al. Single drop microextraction and gas chromatography-mass spectrometry for the determination of diflufenican, mepanipyrim, fipronil, and pretilachlor in water samples[J]. Environmental Monitoring and Assessment, 2013, 185(12): 10225-10233.

[11] SARTARELLI N C, de MACEDO A N, de SOUSA J P, et al. Determination of chlorfenvinphos, fipronil, and cypermethrin residues in meat and bovine fat using QuEChERS method and gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 2012, 35(13): 1895-1908.

[12] 薄海波. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜正離子模式測定食品中氟蟲腈和溴蟲腈殘留[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2013, 25(5): 431-434.

[13] TOMASINI D, SAMPAIO M R F, CARDOSO L V, et al. Simultaneous determination of pesticides and 5-hydroxymethylfurfural in honey by the modified QuEChERS method and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J]. Talanta, 2012, 99: 380-386.

[14] 丁明, 鐘冬蓮, 湯富彬, 等. 固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測定竹筍中殘留的7 種殺蟲劑農(nóng)藥[J]. 色譜, 2013, 31(2): 117-121.

[15] 葉江雷, 金貴娥, 吳云輝, 等. QuEChERS法提取凈化結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)法快速檢測茶葉中農(nóng)藥殘留[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(12): 265-271.

[16] 張耀海, 焦必寧, 周志欽. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS方法快速檢測軟包裝飲料中8 種光引發(fā)劑[J]. 分析化學(xué), 2012, 40(10): 1536-1542.

[17] 黃霞, 宋瑩, 張耀海, 等. QuEChERS-GC/MS快速檢測柑橘中50 種農(nóng)藥殘留[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(18): 268-273.

[18] REZAEE M, ASSADI Y, HOSSEINI M R M, et al. Determination of organic compounds in water using dispersive liquid-liquid microextraction[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1116(1/2): 1-9.

[19] 曹江平, 范盈盈, 解啟龍, 等. 分散液液微萃取-高效液相色譜法測定白酒中的酞酸酯[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(24): 233-237.

[20] NGUYEN T P, LEEBS, LEE B R, et al. A multiresidue method for the determination of 109 pesticides in rice using the quick easy cheap effective rugged and safe (QuEChERS) sample preparation method and gas chromatography/mass spectrometry with temperature control and vacuum concentration[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2007, 21(18): 3115-3122.

[21] NGUYEN T D, YE J E, LEE D M, et al. A multiresidue method for thedetermination of 107 pesticides in cabbge and radish using QuEChERS sample preparation method and gas chromatography mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2008, 110(1): 207-213.

[22] 劉亞偉, 董一威, 孫寶利, 等. QuEChERS在食品中農(nóng)藥多殘留檢測的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(9): 285-289.

Determination of Chlorfenapyr and Fipronil Residues in Vegetables by QuEChERS Combined with Dispersive Liquid-liquid Microextraction and High Performance Liquid Chromatography

BAI Bao-qing, LI Mei-ping, ZHANG Sheng-wan*
(College of Life Sciences, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

A method was developed for simultaneous determination of the residues of chlorfenapyr and fipronil in vegetables using QuEChERS combined with dispersive liquid-liquid microextraction and high performance liquid chromatography. The sample was extracted with acetonitrile, salted out with MgSO4and NaCl, cleaned up with N-propyl ethylenediamine (PSA) and graphitized carbon, and concentrated by dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) before being analyzed by HPLC. The separation of the target compounds was performed on a SunFire-C18liquid chromatography column using a mobile phase consisting of acetonitrile and water in a gradient elution mode and the matrix-matched external standard calibration method was used for quantitation. Key DLLME experimental parameters including the type and volume of extractant and disperser solvent and extraction time were optimized. This method had a good linearity in range of 3.0–460 μg/kg with correlation coefficients more than 0.998 6 (R2), and the limits of detectionwere in the range of 0.70–0.86 μg/kg. The average recoveries of chlorfenapyr and fipronil at three spiked concentration levels ranged from 90.5% to 108.5%, with relative standard deviations (RSDs) less than 10%. This method is simple, accurate, low-cost, and applicable for the determination of chlorfenapyr and fipronil residues in vegetables.

chlorfenapyr; fipronil; QuEChERS; dispersive liquid-liquid microextraction; high performance liquid chromatography

O657.7

A

1002-6630（2014）24-0254-05

10.7506/spkx1002-6630-201424049

2014-06-30

山西省普通高校特色重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項目（011352011）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31171748）

白寶清（1976—），男，講師，博士，研究方向為食品化學(xué)、食品分析。E-mail：baoqingbai@sxu.edu.cn

*通信作者：張生萬（1955—），男，教授，學(xué)士，研究方向為食品化學(xué)、化學(xué)計量學(xué)。E-mail：zswan@sxu.edu.cn