實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)食品中貓?jiān)葱猿煞?/h1>
2014-03-08 09:18:00高曉麗楊昕霆趙琳娜陳吉漢侯彩云
食品科學(xué) 2014年24期
高曉麗，楊昕霆，王 丹，趙琳娜，陳吉漢，侯彩云,*
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京 100041）
實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)食品中貓?jiān)葱猿煞?/p>
高曉麗1，楊昕霆2，王 丹2，趙琳娜2，陳吉漢1，侯彩云1,*
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京 100041）
根據(jù)貓線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化還原酶亞基1（ND1）基因中的保守序列設(shè)計(jì)貓?zhí)禺愋砸锖蚑aqMan探針，建立食品中貓?jiān)葱猿煞值膶?shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法。通過實(shí)時(shí)熒光PCR反復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果表明，引物和TaqMan探針對(duì)貓?jiān)葱猿煞值奶禺愋粤己?，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1 pg，適用于食品中貓?jiān)葱猿煞值目焖勹b定。通過對(duì)隨機(jī)抽取的市售肉制品的檢測(cè)，尚未發(fā)現(xiàn)摻有貓?jiān)葱猿煞值男袨椤?/p>
實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；線粒體ND1基因；貓?jiān)葱猿煞?/p>
動(dòng)物源性食品由于其富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，在日常飲食中所占的比例越來越大。但是，國(guó)內(nèi)外不斷報(bào)道的食品安全問題，尤其是肉制品的摻假摻雜，不僅嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的健康和權(quán)益，同時(shí)直接影響到國(guó)家的形象、社會(huì)的和諧發(fā)展以及政府的公信力[1]，甚至因宗教因素導(dǎo)致的民族矛盾。因此，有必要建立快速、準(zhǔn)確、高效的食品中動(dòng)物源性成分篩查方法，對(duì)未知成分的動(dòng)物源性食品進(jìn)行快速篩查。
目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要利用以實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)對(duì)動(dòng)物源性物種成分的鑒定進(jìn)行研究，大量報(bào)道了普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)食品中豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、火雞肉、馬肉、驢肉、駱駝等常見的肉類物種[2-15]，以及食品中鳥類、魚類的檢測(cè)[16-19]。與普通PCR相比，實(shí)時(shí)熒光PCR法特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好；反應(yīng)過程中反應(yīng)管保持封閉，大大減少了外來污染；擴(kuò)增產(chǎn)物無需電泳，檢測(cè)自動(dòng)化程度較高，分析快速，能同時(shí)進(jìn)行多個(gè)物種的高效篩選；能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，可實(shí)現(xiàn)定性、定量檢測(cè)。因此，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)被認(rèn)為是肉品鑒定中最有潛力的分子學(xué)檢測(cè)工具[20]。
國(guó)內(nèi)外雖有大量PCR法檢測(cè)肉制品中物種成分的研究報(bào)道，但針對(duì)貓?jiān)葱猿煞骤b定的還不多。Martín等[20]建立了食品和飼料中貓、狗、鼠源性成分鑒定的普通PCR方法，檢測(cè)限為0.1%。國(guó)內(nèi)僅有張舒亞等[21]以12S rRNA為靶標(biāo)設(shè)計(jì)了引物和TaqMan探針，建立了食品和飼料中貓?jiān)葱猿煞值膶?shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，可檢出動(dòng)物和植物材料基質(zhì)中0.01%的貓?jiān)葱猿煞帧Ｉ形从嗅槍?duì)貓線粒體ND1基因?yàn)榘袠?biāo)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，而動(dòng)物線粒體ND1基因進(jìn)化速率快[14]，可以更好地與其他物種進(jìn)行區(qū)分。因此，本研究設(shè)計(jì)了貓線粒體ND1基因特異性引物和TaqMan探針，建立了食品中貓?jiān)葱猿煞值膶?shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)快速、高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)肉制品中的物種成分，從而為保障食品質(zhì)量安全、打擊摻假摻雜違法行為提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉等動(dòng)物材料購自北京市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市；駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉、貓肉等動(dòng)物材料為實(shí)驗(yàn)室自存。15 個(gè)牛羊肉串樣品購自北京市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。
Tris-平衡酚、氯仿（三氯甲烷）、無水乙醇、異丙醇、乙酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取緩沖液（20 g/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.02 mol/L Na2EDTA、0.1 mol/L Tris-HCl、pH 8.0）、Tris -乙二胺四乙酸緩沖液（Tris-ethylene diamine tetra-acetic acid buffer，TE）（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA）由本實(shí)驗(yàn)室配制；實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混合液（Premix Ex TaqTM） 寶生物工程（大連）有限公司；貓ND1基因序列特異的上下游引物、TaqMan探針，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。
1.2 儀器與設(shè)備
QIA Cube核酸自動(dòng)提取儀 美國(guó)QIA Gene公司；核酸蛋白定量分析儀 德國(guó)Eppendorf公司；MyiQ單色實(shí)時(shí)定量PCR儀 美國(guó)伯樂公司；3K18冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Biomedical freezer超低溫冰箱（－40 ℃）日本Sanyo公司；Mili-Q純水器 美國(guó)Milipore公司。
1.3 方法
1.3.1 動(dòng)物組織DNA的提取
用滅菌手術(shù)剪分別剪取一定量的豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉、貓肉的肌肉組織，剪碎置于研缽中（注意防止交叉污染）；加入石英砂，用液氮充分研磨至粉末狀，迅速取2 g左右于2.0 mL離心管中，立即加入1 mL CTAB，混勻；置于核酸自動(dòng)提取儀中加熱振蕩，消化30 min；離心取600 μL上清液于新的2.0 mL離心管中，加入等體積的氯仿和Tris-平衡酚各300 μL，用力振蕩5 min，使其充分反應(yīng)，12 000 r/min室溫離心10 min；取上清液，加入600 μL氯仿，同上，12 000 r/min室溫離心10 min；取上清液，加10%體積3 mol/L乙酸鈉和2 倍體積無水乙醇，輕緩顛倒數(shù)次，可見白色絮狀DNA，12 000 r/min室溫離心10 min，棄上清液；加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀2 次，12 000 r/min室溫離心10 min，棄乙醇；待DNA沉淀干燥后，將DNA溶于50～100 μL TE溶液或無菌水中；核酸蛋白定量分析儀測(cè)定濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，置于4 ℃冰箱備用，或于－20 ℃保存。
1.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR引物與TaqMan探針的設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank基因數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的貓（Felis silvestris catus）線粒體序列（Accession NO：NC_001700，GI：5835205）和豬、牛、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、兔、駱駝、馬、驢、鹿、狗的線粒體序列，分析生物進(jìn)化樹的規(guī)律，使用DNAMAN軟件比對(duì)以上基因序列，尋找種內(nèi)保守、種間差異較大的基因片段。應(yīng)用Primer Express軟件對(duì)各物種選取的特定序列進(jìn)行引物、TaqMan探針的設(shè)計(jì)。最終設(shè)計(jì)的引物和探針經(jīng)過BLAST比對(duì)，進(jìn)一步驗(yàn)證引物和探針的特異性。本研究最終選取貓ND1基因序列設(shè)計(jì)了貓?zhí)禺愋砸锖吞结?，既可以保證種內(nèi)保守，又能保證種間特異。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100 bp左右。
1.3.3 引物和TaqMan探針的驗(yàn)證
以貓肉線粒體DNA為陽性對(duì)照，豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉的線粒體DNA為陰性對(duì)照。DNA模板的質(zhì)量濃度均稀釋至100 ng/μL，分別加入貓線粒體ND1基因特異性引物、TaqMan探針，以驗(yàn)證特異性，空白對(duì)照中以無菌水代替DNA模板。實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)體系為20 μL，具體包括： Premix Buffer（2×）10 μL、上游引物（10 μmol/L）0.5 μL、下游引物（10 μmol/L）0.5 μL、TaqMan探針1 μL、DNA 模板1 μL、無菌水將體系補(bǔ)充至總體積20 μL。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。
在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中，Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。以Ct值35為界限，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR儀所得的Ct值來驗(yàn)證引物與探針對(duì)貓?jiān)葱猿煞值奶禺愋浴?/p>
為檢測(cè)方法的靈敏度，將貓肉基因組DNA溶液分別稀釋為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01 ng/μL，各個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置空白對(duì)照。根據(jù)各梯度的擴(kuò)增曲線，建立Ct值-模板DNA質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于貓?jiān)葱猿煞值撵`敏度檢測(cè)。
1.3.4 市售肉制品中貓?jiān)葱猿煞值臋z測(cè)
從北京超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中隨機(jī)取樣15 個(gè)羊肉串，檢驗(yàn)是否摻雜貓肉。首先提取所有的羊肉串樣本DNA，然后按照實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)體系，設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。
2 結(jié)果與分析
2.1 利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行普通PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果
利用本研究設(shè)計(jì)的引物對(duì)貓肉DNA以及豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，只擴(kuò)增了貓肉基因組DNA。將貓肉DNA擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用GenBank中的BLAST功能對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果只出現(xiàn)了一條貓基因序列的比對(duì)信息，同源性為93%，由此可以確定物種的真實(shí)性。而且，DNA質(zhì)量能夠保證實(shí)時(shí)熒光PCR的正常進(jìn)行，這與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符合，可以進(jìn)一步進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR。測(cè)序比對(duì)結(jié)果見圖1。
圖1 貓?jiān)葱猿煞諴CR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing of PCR products of feline DNA
2.2 引物和TaqMan探針的特異性檢測(cè)結(jié)果
引物和TaqMan探針是以貓線粒體ND1基因?yàn)榘行蛄兴O(shè)計(jì)的。實(shí)驗(yàn)表明，豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉等動(dòng)物材料DNA模板和空白對(duì)照所擴(kuò)增的曲線Ct值均大于40，而貓肉DNA擴(kuò)增曲線的Ct值為17。說明該體系對(duì)貓?jiān)葱猿煞值臋z測(cè)具有良好的特異性。特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線如圖2所示。
圖2 貓引物探針實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性檢測(cè)結(jié)果圖Fig.2 Specificity of real-time PCR for detection of cat-derived components
2.3 靈敏度檢測(cè)結(jié)果
對(duì)貓肉基因組不同梯度的DNA溶液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)（表1），其中，100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL的DNA模板均有擴(kuò)增，且Ct值在35之內(nèi)，0.000 1 ng/μL質(zhì)量濃度的擴(kuò)增曲線Ct值略大于35，而0.000 01 ng/μL質(zhì)量濃度的貓肉DNA未出現(xiàn)擴(kuò)增。因此可知，貓?jiān)葱猿煞值囊?、TaqMan探針檢測(cè)靈敏度為1 pg（0.001 ng/μL，相當(dāng)于0.001%）。當(dāng)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)處于指數(shù)期階段，所有DNA模板的反應(yīng)效率穩(wěn)定且近似相等，DNA質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)Ct值呈線性關(guān)系。為檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法的靈敏度及其線性范圍關(guān)系，建立Ct值-模板DNA質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。由圖3可知，該曲線線性相關(guān)度良好，R2為0.999，靈敏度可低至1 pg。根據(jù)PCR擴(kuò)增效率計(jì)算公式，擴(kuò)增效率/% =（－1+10[-1/slope]）×100，其中slope為斜率，可得PCR擴(kuò)增效率是96%。
表1 貓DNA引物、探針體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Table 1 Sensitivity obtained with the species-specific primer-probe sets for detection of cat-derived components
2.4 市售食品中貓?jiān)葱猿煞謾z測(cè)
為進(jìn)一步驗(yàn)證貓引物探針體系的實(shí)際應(yīng)用能力，對(duì)市場(chǎng)上抽檢的15 個(gè)羊肉串進(jìn)行是否摻雜貓?jiān)葱猿煞值蔫b定。結(jié)果顯示，陽性對(duì)照的擴(kuò)增曲線正常，陰性對(duì)照未擴(kuò)增曲線，檢樣也未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表明15 個(gè)羊肉串中不含貓?jiān)葱猿煞帧?/p>
3 討 論
實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法由于其靈敏度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性參數(shù)上具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)[23]，因而得到了廣泛的應(yīng)用。在實(shí)時(shí)熒光PCR法的檢測(cè)中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要以線粒體cytb、D-loop、12S rRNA、16S rRNA等基因作為靶序列來設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，主要是因?yàn)榫€粒體DNA是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，是檢測(cè)中比較理想的靶基因，而且細(xì)胞中均含有大量的線粒體。本研究通過大量篩選貓線粒體中的不同基因，并將設(shè)計(jì)的引物和探針序列在NCBI的BLAST中搜索、比對(duì)，最終在貓線粒體ND1基因位點(diǎn)上，發(fā)現(xiàn)既可以保證種內(nèi)保守，又可保證種間特異的引物和探針序列，從而建立了針對(duì)貓?jiān)葱猿煞值膶?shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法。該方法可以很好地特異性擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，常見的畜禽類物種DNA模板均未擴(kuò)增，Ct值-模板DNA質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好（R2≥0.990），靈敏度可達(dá)1 pg，PCR擴(kuò)增效率為96%。
動(dòng)物的不同組織中線粒體數(shù)量有區(qū)別，比如，心臟和肝臟等組織的線粒體就多于普通肌肉組織，或加工程度不同可能會(huì)導(dǎo)致熒光PCR定量結(jié)果的偏差，只能判斷大致含量，但定性結(jié)果可靠。本實(shí)驗(yàn)中，貓線粒體DNA在提取后，需反復(fù)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證結(jié)果，若DNA多次反復(fù)凍融容易降解，所以應(yīng)該及時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的反復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，減少由于DNA的降解對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成假陰性的影響。
總之，本研究建立的針對(duì)貓?jiān)葱猿煞值膶?shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法特異性良好、靈敏度較高、重復(fù)性好、實(shí)用性強(qiáng)。這對(duì)食品中貓?jiān)葱猿煞謸郊贀诫s的檢測(cè)具有重要意義，可作為食品中貓?jiān)葱猿煞謾z測(cè)方法之一，同時(shí)為保障食品安全、打擊摻假的違法行為提供技術(shù)參考。
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Detection of Cat-Derived Components in Foods by Real-Time Polymerase Chain Reaction
GAO Xiao-li1, YANG Xin-ting2, WANG Dan2, ZHAO Lin-na2, CHEN Ji-han1, HOU Cai-yun1,*
(1. Key Laboratory of Functional Dairy, Co-constructed by Ministry of Education and Beijing Municipality, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring, Beijing 100041, China)
In this study, a TaqMan-based, sensitive and specific real-time polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for the detection of cat-derived components in foods. Primers and TaqMan probe were designed based on the conserved sequence of the feline mitochondrial ND1, and the performance of the method was invalidated. Results indicated that no cross-reaction was observed between the feline and non-target species, and this method revealed a high sensitivity and could detect 1 pg of cat template DNA. In conclusion, the TaqMan probe assay used in this study can be a rapid and sensitive method for the routine identification of meat species in foods.
real-time PCR; mitochondrial ND1; cat-origin component
TS201.6
A
1002-6630（2014）24-0235-04
10.7506/spkx1002-6630-201424045
2014-03-17
北京市科技計(jì)劃課題（Z131100005613005）
高曉麗（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測(cè)。E-mail：xiaoligao606@163.com
*通信作者：侯彩云（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與加工技術(shù)。E-mail：cyhou@cau.edu.cn
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高曉麗，楊昕霆，王 丹，趙琳娜，陳吉漢，侯彩云,*
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京 100041）
實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)食品中貓?jiān)葱猿煞?/p>
高曉麗1，楊昕霆2，王 丹2，趙琳娜2，陳吉漢1，侯彩云1,*
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京 100041）
根據(jù)貓線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化還原酶亞基1（ND1）基因中的保守序列設(shè)計(jì)貓?zhí)禺愋砸锖蚑aqMan探針，建立食品中貓?jiān)葱猿煞值膶?shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法。通過實(shí)時(shí)熒光PCR反復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果表明，引物和TaqMan探針對(duì)貓?jiān)葱猿煞值奶禺愋粤己?，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1 pg，適用于食品中貓?jiān)葱猿煞值目焖勹b定。通過對(duì)隨機(jī)抽取的市售肉制品的檢測(cè)，尚未發(fā)現(xiàn)摻有貓?jiān)葱猿煞值男袨椤?/p>
實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；線粒體ND1基因；貓?jiān)葱猿煞?/p>
動(dòng)物源性食品由于其富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，在日常飲食中所占的比例越來越大。但是，國(guó)內(nèi)外不斷報(bào)道的食品安全問題，尤其是肉制品的摻假摻雜，不僅嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的健康和權(quán)益，同時(shí)直接影響到國(guó)家的形象、社會(huì)的和諧發(fā)展以及政府的公信力[1]，甚至因宗教因素導(dǎo)致的民族矛盾。因此，有必要建立快速、準(zhǔn)確、高效的食品中動(dòng)物源性成分篩查方法，對(duì)未知成分的動(dòng)物源性食品進(jìn)行快速篩查。
目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要利用以實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)對(duì)動(dòng)物源性物種成分的鑒定進(jìn)行研究，大量報(bào)道了普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)食品中豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、火雞肉、馬肉、驢肉、駱駝等常見的肉類物種[2-15]，以及食品中鳥類、魚類的檢測(cè)[16-19]。與普通PCR相比，實(shí)時(shí)熒光PCR法特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好；反應(yīng)過程中反應(yīng)管保持封閉，大大減少了外來污染；擴(kuò)增產(chǎn)物無需電泳，檢測(cè)自動(dòng)化程度較高，分析快速，能同時(shí)進(jìn)行多個(gè)物種的高效篩選；能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，可實(shí)現(xiàn)定性、定量檢測(cè)。因此，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)被認(rèn)為是肉品鑒定中最有潛力的分子學(xué)檢測(cè)工具[20]。
國(guó)內(nèi)外雖有大量PCR法檢測(cè)肉制品中物種成分的研究報(bào)道，但針對(duì)貓?jiān)葱猿煞骤b定的還不多。Martín等[20]建立了食品和飼料中貓、狗、鼠源性成分鑒定的普通PCR方法，檢測(cè)限為0.1%。國(guó)內(nèi)僅有張舒亞等[21]以12S rRNA為靶標(biāo)設(shè)計(jì)了引物和TaqMan探針，建立了食品和飼料中貓?jiān)葱猿煞值膶?shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，可檢出動(dòng)物和植物材料基質(zhì)中0.01%的貓?jiān)葱猿煞帧Ｉ形从嗅槍?duì)貓線粒體ND1基因?yàn)榘袠?biāo)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，而動(dòng)物線粒體ND1基因進(jìn)化速率快[14]，可以更好地與其他物種進(jìn)行區(qū)分。因此，本研究設(shè)計(jì)了貓線粒體ND1基因特異性引物和TaqMan探針，建立了食品中貓?jiān)葱猿煞值膶?shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)快速、高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)肉制品中的物種成分，從而為保障食品質(zhì)量安全、打擊摻假摻雜違法行為提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉等動(dòng)物材料購自北京市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市；駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉、貓肉等動(dòng)物材料為實(shí)驗(yàn)室自存。15 個(gè)牛羊肉串樣品購自北京市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。
Tris-平衡酚、氯仿（三氯甲烷）、無水乙醇、異丙醇、乙酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取緩沖液（20 g/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.02 mol/L Na2EDTA、0.1 mol/L Tris-HCl、pH 8.0）、Tris -乙二胺四乙酸緩沖液（Tris-ethylene diamine tetra-acetic acid buffer，TE）（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA）由本實(shí)驗(yàn)室配制；實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混合液（Premix Ex TaqTM） 寶生物工程（大連）有限公司；貓ND1基因序列特異的上下游引物、TaqMan探針，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。
1.2 儀器與設(shè)備
QIA Cube核酸自動(dòng)提取儀 美國(guó)QIA Gene公司；核酸蛋白定量分析儀 德國(guó)Eppendorf公司；MyiQ單色實(shí)時(shí)定量PCR儀 美國(guó)伯樂公司；3K18冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Biomedical freezer超低溫冰箱（－40 ℃）日本Sanyo公司；Mili-Q純水器 美國(guó)Milipore公司。
1.3 方法
1.3.1 動(dòng)物組織DNA的提取
用滅菌手術(shù)剪分別剪取一定量的豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉、貓肉的肌肉組織，剪碎置于研缽中（注意防止交叉污染）；加入石英砂，用液氮充分研磨至粉末狀，迅速取2 g左右于2.0 mL離心管中，立即加入1 mL CTAB，混勻；置于核酸自動(dòng)提取儀中加熱振蕩，消化30 min；離心取600 μL上清液于新的2.0 mL離心管中，加入等體積的氯仿和Tris-平衡酚各300 μL，用力振蕩5 min，使其充分反應(yīng)，12 000 r/min室溫離心10 min；取上清液，加入600 μL氯仿，同上，12 000 r/min室溫離心10 min；取上清液，加10%體積3 mol/L乙酸鈉和2 倍體積無水乙醇，輕緩顛倒數(shù)次，可見白色絮狀DNA，12 000 r/min室溫離心10 min，棄上清液；加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀2 次，12 000 r/min室溫離心10 min，棄乙醇；待DNA沉淀干燥后，將DNA溶于50～100 μL TE溶液或無菌水中；核酸蛋白定量分析儀測(cè)定濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，置于4 ℃冰箱備用，或于－20 ℃保存。
1.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR引物與TaqMan探針的設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank基因數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的貓（Felis silvestris catus）線粒體序列（Accession NO：NC_001700，GI：5835205）和豬、牛、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、兔、駱駝、馬、驢、鹿、狗的線粒體序列，分析生物進(jìn)化樹的規(guī)律，使用DNAMAN軟件比對(duì)以上基因序列，尋找種內(nèi)保守、種間差異較大的基因片段。應(yīng)用Primer Express軟件對(duì)各物種選取的特定序列進(jìn)行引物、TaqMan探針的設(shè)計(jì)。最終設(shè)計(jì)的引物和探針經(jīng)過BLAST比對(duì)，進(jìn)一步驗(yàn)證引物和探針的特異性。本研究最終選取貓ND1基因序列設(shè)計(jì)了貓?zhí)禺愋砸锖吞结?，既可以保證種內(nèi)保守，又能保證種間特異。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100 bp左右。
1.3.3 引物和TaqMan探針的驗(yàn)證
以貓肉線粒體DNA為陽性對(duì)照，豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉的線粒體DNA為陰性對(duì)照。DNA模板的質(zhì)量濃度均稀釋至100 ng/μL，分別加入貓線粒體ND1基因特異性引物、TaqMan探針，以驗(yàn)證特異性，空白對(duì)照中以無菌水代替DNA模板。實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)體系為20 μL，具體包括： Premix Buffer（2×）10 μL、上游引物（10 μmol/L）0.5 μL、下游引物（10 μmol/L）0.5 μL、TaqMan探針1 μL、DNA 模板1 μL、無菌水將體系補(bǔ)充至總體積20 μL。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。
在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中，Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。以Ct值35為界限，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR儀所得的Ct值來驗(yàn)證引物與探針對(duì)貓?jiān)葱猿煞值奶禺愋浴?/p>
為檢測(cè)方法的靈敏度，將貓肉基因組DNA溶液分別稀釋為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01 ng/μL，各個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置空白對(duì)照。根據(jù)各梯度的擴(kuò)增曲線，建立Ct值-模板DNA質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于貓?jiān)葱猿煞值撵`敏度檢測(cè)。
1.3.4 市售肉制品中貓?jiān)葱猿煞值臋z測(cè)
從北京超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中隨機(jī)取樣15 個(gè)羊肉串，檢驗(yàn)是否摻雜貓肉。首先提取所有的羊肉串樣本DNA，然后按照實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)體系，設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。
2 結(jié)果與分析
2.1 利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行普通PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果
利用本研究設(shè)計(jì)的引物對(duì)貓肉DNA以及豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，只擴(kuò)增了貓肉基因組DNA。將貓肉DNA擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用GenBank中的BLAST功能對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果只出現(xiàn)了一條貓基因序列的比對(duì)信息，同源性為93%，由此可以確定物種的真實(shí)性。而且，DNA質(zhì)量能夠保證實(shí)時(shí)熒光PCR的正常進(jìn)行，這與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符合，可以進(jìn)一步進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR。測(cè)序比對(duì)結(jié)果見圖1。
圖1 貓?jiān)葱猿煞諴CR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing of PCR products of feline DNA
2.2 引物和TaqMan探針的特異性檢測(cè)結(jié)果
引物和TaqMan探針是以貓線粒體ND1基因?yàn)榘行蛄兴O(shè)計(jì)的。實(shí)驗(yàn)表明，豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉等動(dòng)物材料DNA模板和空白對(duì)照所擴(kuò)增的曲線Ct值均大于40，而貓肉DNA擴(kuò)增曲線的Ct值為17。說明該體系對(duì)貓?jiān)葱猿煞值臋z測(cè)具有良好的特異性。特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線如圖2所示。
圖2 貓引物探針實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性檢測(cè)結(jié)果圖Fig.2 Specificity of real-time PCR for detection of cat-derived components
2.3 靈敏度檢測(cè)結(jié)果
對(duì)貓肉基因組不同梯度的DNA溶液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)（表1），其中，100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL的DNA模板均有擴(kuò)增，且Ct值在35之內(nèi)，0.000 1 ng/μL質(zhì)量濃度的擴(kuò)增曲線Ct值略大于35，而0.000 01 ng/μL質(zhì)量濃度的貓肉DNA未出現(xiàn)擴(kuò)增。因此可知，貓?jiān)葱猿煞值囊?、TaqMan探針檢測(cè)靈敏度為1 pg（0.001 ng/μL，相當(dāng)于0.001%）。當(dāng)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)處于指數(shù)期階段，所有DNA模板的反應(yīng)效率穩(wěn)定且近似相等，DNA質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)Ct值呈線性關(guān)系。為檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法的靈敏度及其線性范圍關(guān)系，建立Ct值-模板DNA質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。由圖3可知，該曲線線性相關(guān)度良好，R2為0.999，靈敏度可低至1 pg。根據(jù)PCR擴(kuò)增效率計(jì)算公式，擴(kuò)增效率/% =（－1+10[-1/slope]）×100，其中slope為斜率，可得PCR擴(kuò)增效率是96%。
表1 貓DNA引物、探針體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Table 1 Sensitivity obtained with the species-specific primer-probe sets for detection of cat-derived components
2.4 市售食品中貓?jiān)葱猿煞謾z測(cè)
為進(jìn)一步驗(yàn)證貓引物探針體系的實(shí)際應(yīng)用能力，對(duì)市場(chǎng)上抽檢的15 個(gè)羊肉串進(jìn)行是否摻雜貓?jiān)葱猿煞值蔫b定。結(jié)果顯示，陽性對(duì)照的擴(kuò)增曲線正常，陰性對(duì)照未擴(kuò)增曲線，檢樣也未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表明15 個(gè)羊肉串中不含貓?jiān)葱猿煞帧?/p>
3 討 論
實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法由于其靈敏度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性參數(shù)上具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)[23]，因而得到了廣泛的應(yīng)用。在實(shí)時(shí)熒光PCR法的檢測(cè)中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要以線粒體cytb、D-loop、12S rRNA、16S rRNA等基因作為靶序列來設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，主要是因?yàn)榫€粒體DNA是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，是檢測(cè)中比較理想的靶基因，而且細(xì)胞中均含有大量的線粒體。本研究通過大量篩選貓線粒體中的不同基因，并將設(shè)計(jì)的引物和探針序列在NCBI的BLAST中搜索、比對(duì)，最終在貓線粒體ND1基因位點(diǎn)上，發(fā)現(xiàn)既可以保證種內(nèi)保守，又可保證種間特異的引物和探針序列，從而建立了針對(duì)貓?jiān)葱猿煞值膶?shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法。該方法可以很好地特異性擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，常見的畜禽類物種DNA模板均未擴(kuò)增，Ct值-模板DNA質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好（R2≥0.990），靈敏度可達(dá)1 pg，PCR擴(kuò)增效率為96%。
動(dòng)物的不同組織中線粒體數(shù)量有區(qū)別，比如，心臟和肝臟等組織的線粒體就多于普通肌肉組織，或加工程度不同可能會(huì)導(dǎo)致熒光PCR定量結(jié)果的偏差，只能判斷大致含量，但定性結(jié)果可靠。本實(shí)驗(yàn)中，貓線粒體DNA在提取后，需反復(fù)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證結(jié)果，若DNA多次反復(fù)凍融容易降解，所以應(yīng)該及時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的反復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，減少由于DNA的降解對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成假陰性的影響。
總之，本研究建立的針對(duì)貓?jiān)葱猿煞值膶?shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法特異性良好、靈敏度較高、重復(fù)性好、實(shí)用性強(qiáng)。這對(duì)食品中貓?jiān)葱猿煞謸郊贀诫s的檢測(cè)具有重要意義，可作為食品中貓?jiān)葱猿煞謾z測(cè)方法之一，同時(shí)為保障食品安全、打擊摻假的違法行為提供技術(shù)參考。
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Detection of Cat-Derived Components in Foods by Real-Time Polymerase Chain Reaction
GAO Xiao-li1, YANG Xin-ting2, WANG Dan2, ZHAO Lin-na2, CHEN Ji-han1, HOU Cai-yun1,*
(1. Key Laboratory of Functional Dairy, Co-constructed by Ministry of Education and Beijing Municipality, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring, Beijing 100041, China)
In this study, a TaqMan-based, sensitive and specific real-time polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for the detection of cat-derived components in foods. Primers and TaqMan probe were designed based on the conserved sequence of the feline mitochondrial ND1, and the performance of the method was invalidated. Results indicated that no cross-reaction was observed between the feline and non-target species, and this method revealed a high sensitivity and could detect 1 pg of cat template DNA. In conclusion, the TaqMan probe assay used in this study can be a rapid and sensitive method for the routine identification of meat species in foods.
real-time PCR; mitochondrial ND1; cat-origin component
TS201.6
A
1002-6630（2014）24-0235-04
10.7506/spkx1002-6630-201424045
2014-03-17
北京市科技計(jì)劃課題（Z131100005613005）
高曉麗（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測(cè)。E-mail：xiaoligao606@163.com
*通信作者：侯彩云（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與加工技術(shù)。E-mail：cyhou@cau.edu.cn
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