蔡 淼，黃 新，岳喜慶,*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所，北京 100029）

表面等離子共振傳感檢測(cè)Cry2A蛋白

蔡 淼1，黃 新2，岳喜慶1,*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所，北京 100029）

目的：建立利用表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中蘇云金芽孢桿菌Cry2A蛋白的方法。方法：利用SPR檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)生物分子間的相互作用，在金片表面修飾Cry2A蛋白的特異性單克隆抗體，對(duì)不同質(zhì)量濃度梯度的Cry2A蛋白進(jìn)行檢測(cè)研究。結(jié)果：該方法可有效地檢測(cè)到Cry2A蛋白，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 ng/mL，與同為抗蟲基因編碼的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。結(jié)論：利用SPR方法檢測(cè)Cry2A蛋白操作簡(jiǎn)單，省時(shí)且靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于對(duì)Cry2A蛋白的定性檢測(cè)。

表面等離子共振傳感器；Cry2A蛋白；蘇云金芽孢桿菌；轉(zhuǎn)基因植物

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt），是一種分布非常廣泛的革蘭氏陽(yáng)性病原性細(xì)菌[1]，其在芽孢形成時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有殺蟲活性的晶體蛋白質(zhì)[2]，稱為殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal protein，ICP）。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Bt基因?qū)胫参镏?，改良植物品種，使改良后的植物具有抗蟲基因，可有效殺滅多種害蟲[3-7]。在節(jié)省害蟲防治成本的同時(shí)，還能緩解因大量施用農(nóng)藥而造成的環(huán)境污染。目前已有多種轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化種植，如玉米、棉花、馬鈴薯、番茄等[8]。然而，由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問(wèn)題一直備受關(guān)注，各國(guó)對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種植和進(jìn)口都有著嚴(yán)格的規(guī)定，因此研究出一種簡(jiǎn)便快捷地檢測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因作物的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究針對(duì)Bt蛋白中的Cry2A蛋白進(jìn)行檢測(cè)研究，Cry2A蛋白能同時(shí)殺滅鱗翅目害蟲和雙翅目害蟲。

表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)是近些年得到長(zhǎng)足發(fā)展的一項(xiàng)應(yīng)用于分析生物分子間相互作用的檢測(cè)技術(shù)[9-14]，而表面等離子共振傳感器便是基于這種技術(shù)的一種光學(xué)傳感器，它利用全反射時(shí)入射光可以和金屬表面的等離子發(fā)生共振的原理，檢測(cè)生物分子之間的相互作用與結(jié)合過(guò)程以及動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[11,15-18]。相比其他檢測(cè)方法，SPR方法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1）檢測(cè)樣品不需標(biāo)記，避免了樣品因?yàn)闃?biāo)記不當(dāng)而失去活性[19-22]；2）可做到動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；3）檢測(cè)過(guò)程非常簡(jiǎn)便且靈敏度高。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品分析、蛋白質(zhì)[23-25]與核酸檢測(cè)[26-27]、藥物篩選、臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)便是基于這種技術(shù)，利用SPR傳感器對(duì)Bt抗蟲蛋白Cry2A進(jìn)行了檢測(cè)研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

單側(cè)鍍金玻璃片（12 mm×20 mm，單側(cè)鍍金50 nm）、SPR Navi 200傳感器 芬蘭BioNavis公司；蒸餾水；無(wú)水乙醇；30%氨水、30%雙氧水均為分析純；巰基十一酸（11-mercaptoundecanoic acid，11-MUA） Sigma中國(guó)上海有限公司；3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid，3-MPA）、脂肪酸甲酯磺酸鹽（fatty acid methyl ester sulfonate，MES）、N-乙基-N’-（二甲基氨基丙基）碳二亞胺（N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（1-hydroxy-5-pyrrolidinedione，NHS）、Cry2A蛋白及其單克隆抗體、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、磷酸鹽（phosphate buffered saline，PBS）緩沖液（20 mmol/L NaH2PO4，150 mmol/L NaCl，pH7.4）、DHG-9030恒溫干燥箱 北京江陰濱江設(shè)備公司；Cry2A蛋白檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Envirlogix公司。

1.2 方法

1.2.1 SPR金片預(yù)處理

將30%氨水、30%雙氧水、蒸餾水按照1∶1∶5的體積比混合，把金片置入其中，于水浴鍋中煮沸，溫度設(shè)置為80～90 ℃，10 min后取出，用蒸餾水及無(wú)水乙醇分別清洗金片表面，氮?dú)獯蹈杀砻?，以便用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 SPR金片表面修飾

將10 mmol/L 3-MPA溶液與10 mmol/L 11-MUA溶液以10∶1的比例混合，把金片鍍金的一面朝上置于其中，浸泡24 h；取出金片，用蒸餾水及無(wú)水乙醇沖洗金片并用氮?dú)獯蹈?，于金片表面滴?00 μL EDC（0.4 mol/L），100 μL NHS（0.1 mol/L）（EDC、NHS均用MES溶解）以活化金片表面的硫醇羧基，室溫靜置2 h后用蒸餾水及無(wú) 水乙醇清洗金片，氮?dú)獯蹈?，再次滴?00 μL EDC，100 μL NHS，室溫靜置2 h；蒸餾水及無(wú)水乙醇清洗并吹干金片，金片表面滴加100 μL Cry2A單克隆抗體溶液（0.2 mg/mL，PBS稀釋），37 ℃恒溫箱中靜置3 h；蒸餾水洗去表面抗體溶液，氮?dú)獯蹈桑? mg/mL PBS稀釋，覆蓋于金片表面，室溫靜置2 h，用蒸餾水將金片表面清洗干凈，吹干，置于PBS中4 ℃保存。

1.2.3 SPR檢測(cè)樣品

取出金片，用蒸餾水洗凈，氮?dú)獯蹈?，將金片放入SPR傳感器的指定位置中，打開(kāi)儀器和監(jiān)測(cè)軟件，通入PBS（使用前需超聲），流速為10 μL/min，待反應(yīng)池及棱鏡溫度達(dá)到設(shè)置溫度后進(jìn)行初始角度掃描（一般將反應(yīng)溫度設(shè)置為低于室溫1～2 ℃），找到固定角后進(jìn)行固定角掃描，待基線穩(wěn)定后，用進(jìn)樣注射器注入300 μL待測(cè)樣品溶液（PBS稀釋），通過(guò)SPR檢測(cè)軟件實(shí)時(shí)觀察反應(yīng)過(guò)程。

1.2.4 酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)Cry2A蛋白

將Cry2A標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋到目標(biāo)質(zhì)量濃度，取100 μL加入到樣品板中，室溫靜置15 min，加入100 μL酶標(biāo)抗體，室溫孵育1 h，傾去反應(yīng)液，拍干，吐溫-PBS緩沖液（tween PBS，PBST）洗滌3 次，加入100 μL底物，靜置30 min，最后加入100 μL終止液，使用酶標(biāo)儀讀數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的靈敏度

將待測(cè)抗原Cry2A稀釋成不同質(zhì)量濃度（10～1 000 ng/mL），每種質(zhì)量濃度在同一條件下重復(fù)檢測(cè)3 次，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算平均值，結(jié)果如圖1所示。進(jìn)樣后約30 s開(kāi)始產(chǎn)生響應(yīng)，表明待測(cè)樣品流經(jīng)金片表面時(shí)與結(jié)合在金片表面的單抗發(fā)生特異性結(jié)合，引起金片表面折射率的變化，使SPR角度發(fā)生偏移。樣品質(zhì)量濃度越高，響應(yīng)值越大，說(shuō)明結(jié)合在金片表面的抗原越多。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，使用SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的最低檢測(cè)限為10 ng/mL。

圖1 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的靈敏度Fig.1 Sensitivity of SPR for the detection of Cry2A protein

2.2 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的重復(fù)性

選取4 種不同質(zhì)量濃度的Cry2A蛋白重復(fù)檢測(cè)3 次，表1結(jié)果顯示每次檢測(cè)都有明顯的反應(yīng)，且同一質(zhì)量濃度的響應(yīng)值差異很小，隨蛋白質(zhì)量濃度的降低反應(yīng)響應(yīng)值也相應(yīng)減小，表明SPR檢測(cè)Cry2A的重復(fù)性較好。

表1 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的重復(fù)性Table 1 Repeatability of SPR for the detection of Cry2A protein

2.3 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的特異性

為了驗(yàn)證SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的特異性，選用另外兩種抗蟲Bt蛋白Cry1Ac和Cry2Ab作為對(duì)照，3 種蛋白均以1 μg/mL質(zhì)量濃度進(jìn)樣，進(jìn)行3 次特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示，Cry2A蛋白有明顯響應(yīng)，而Cry1Ac和Cry2Ab蛋白則未出現(xiàn)明顯響應(yīng)，由此可見(jiàn)此方法檢測(cè)Cry2A蛋白具有較好的特異性。

圖2 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的特異性Fig.2 Specificity of SPR for the detection of Cry2A protein

2.4 ELISA法檢測(cè)Cry2A蛋白

使用Cry2A檢測(cè)試劑盒對(duì)不同質(zhì)量濃度的Cry2A抗原進(jìn)行了檢測(cè)，每個(gè)質(zhì)量濃度3 個(gè)重復(fù)，結(jié)果如表2所示。陰性樣品的OD值一般不超過(guò)0.2，超過(guò)0.2均視為陽(yáng)性樣品，故ELISA法檢測(cè)Cry2A蛋白的靈敏度可達(dá)10 ng/mL，與SPR方法靈敏度相當(dāng)，但SPR方法具有免標(biāo)記、操作簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)勢(shì)。

表 2 ELISA 檢測(cè)CCrryy22AA蛋白靈敏度Table 2 Sensitivity of ELISA for the detection of Cry2A protein

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全問(wèn)題一直備受關(guān)注，我國(guó)政府高度重視轉(zhuǎn)基因植物安全檢測(cè)工作。因此，對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)新方法的研究具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。SPR傳感器是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的新型檢測(cè)儀器。近30a來(lái)，SPR傳感器在技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用領(lǐng)域等方面都有很大的進(jìn)步，現(xiàn)已成為一種檢測(cè)生物分子間相互作用的核心手段，且SPR檢測(cè)金片可反復(fù)使用30 次左右，降低了實(shí)驗(yàn)成本。但SPR技術(shù)在靈敏度、多通道檢測(cè)等方面還有不足。在靈敏度方面目前SPR技術(shù)還無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)到一些低濃度、小分子質(zhì)量的分子。在實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)方面，目前SPR傳感器僅可同時(shí)檢測(cè)兩組數(shù)據(jù)。以上兩方面問(wèn)題將是今后SPR檢測(cè)研究的主要方向。本實(shí)驗(yàn)基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，運(yùn)用SPR檢測(cè)技術(shù)，研究建立了Cry2A蛋白的新的檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 ng/mL，與傳統(tǒng)的ELISA檢測(cè)方法靈敏度相似，但SPR方法具有免標(biāo)記、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、操作省時(shí)簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，且特異性較好，在與Cry1Ac和Cry2Ab蛋白的對(duì)照檢測(cè)中可看出，Cry1Ac和Cry2Ab蛋白未出現(xiàn)明顯響應(yīng)，而Cry2A蛋白響應(yīng)明顯。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此方法具有較好的穩(wěn)定性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)Cry2A蛋白的定性檢測(cè)，為Bt蛋白的檢測(cè)提供了一種新的可行性方法。

[1] 李海濤, 姚江, 郭巍, 等. 蘇云金芽孢桿菌Cry2Aa基因的克隆、表達(dá)與活性[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2005, 13(6): 787-791.

[2] LEE M K, PAUL M, CHEN J S. Brush border membrane binding properties of Bacillus thuringiensis Vip3A toxin to Heliothis virescens and Helicoverpa zea midguts[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 339(4): 1043-1047.

[3] 徐雪亮, 韓宇, 吳剛. 轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac, cry1C, cry2A基因水稻對(duì)田間稻縱卷葉螟及其捕食類天敵的影響[J]. 中國(guó)科學(xué): 生命科學(xué), 2011, 41(11): 1095-1104.

[4] 常雪, 王偉, 沈志成, 等. 轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj玉米對(duì)亞洲玉米螟的抗性評(píng)價(jià)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2013, 40(4): 339-344.

[5] 張嵐, 林克劍, 李飛, 等. 轉(zhuǎn)cry1C和cry2A不同抗蟲基因水稻品種對(duì)非靶標(biāo)害蟲灰飛虱生物學(xué)特性的影響[J]. 植物保護(hù), 2011, 37(6): 120-125.

[6] SHARON D, ROD M. Evolution ecology and management of resistance in Helicoverpa spp. to Bt cotton in Australia[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2012, 110(3): 281-286.

[7] LU Qiong, CAO Guangchun, ZHANG Lili, et al. The binding character of cry insecticidal proteins to the brush border membrane vesicles of Helicoverpa armigera, Spodoptera exigua, Spodoptera litura and Agrotis ipsilon[J]. Journal of Integrative Agriculture, 2013, 12(9): 1598-1605.

[8] MANN R S, GILL R S, DHAWAN A K, et al. Relative abundance and damage by target and non-target insects on Bollgard and BollgardII cotton cultivars[J]. Crop Protection, 2010, 29(8): 793-801.

[9] KANG C D, LEE S W, PARK T H, et al. Performance enhancement of real-time detection of protozoan parasite, Cryptosporidium oocyst by a modified surface plasmon resonance (SPR) biosensor[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(3): 387-390.

[10] CHEN X, PAN M, JIANG K. Sensitivity enhancement of SPR biosensor by improving surface quality of glass slides[J]. Microelectronic Engineering, 2010, 87(5/6/7/8): 790-792.

[11] CHUNG J W, KIM S D, BERNHARDT R. Application of SPR biosensor for medical diagnostics of human hepatitis B virus (hHBV) [J]. Sensors and Actuators B, 2005, 111/112(11): 416-422.

[12] PARK M, JOACHIM J, PYUN J C. SPR biosensor by using E. coli outer membrane layer with autodisplayed Z-domains[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2011, 154(2): 82-88.

[13] WANG Jing, SONG Daqian, WANG Liying, et al. Design and performance of immunoassay based on SPR biosensor with Au/Ag alloy nanocomposites[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2011, 157(2): 547-553.

[14] ZHANG Hua, SUN Ying, WANG Jing, et al. Preparation and application of novel nanocomposites of magnetic-Au nanorod in SPR biosensor[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2012, 34(1): 137-143.

[15] MARIOTTI E, MINUNNI M, MASCINI M. Surface plasmon resonance biosensor for genetically modified organisms detection[J]. Analytica Chimica Act, 2002, 453(2): 165-172.

[16] CHABOT V, MIRON Y, CHARETTE P G, et al. Identification of the molecular mechanisms in cellular processes that elicit a surface plasmon resonance (SPR) response using simuLtaneous surface plasmon-enhanced fluorescence (SPEF) microscopy[J]. Biosens Bioelectron, 2013, 50(15): 125-131.

[17] SUN Ying, BI Ning, SONG Daqian, et al. Preparation of titania sol-gel matrix for the immunoassay by SPR biosensor with magnetic beads[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2008, 134(2): 566-572.

[18] SHIN Y B, KIM H M, JUNG Y W, et al. A new palm-sized surfaceplasmon resonance (SPR) biosensor based on modulation of a light source by a rotating mirror[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2010, 150(1): 1-6.

[19] KANG C D, LEE S W, PARK T Y, et al. Performance enhancement of real-time detection of protozoan parasite, Cryptosporidium oocyst by a modified surface plasmon resonance (SP R) biosensor[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(3): 387-390.

[20] MANERA M G, FERREIRO-VILA E, GARCIA-MARTIN J M, et al. Enhanced magneto-optical SPR platform for amine sensing based on Zn p orphyrin dimers[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2013, 182: 232-238.

[21] CHEN X, PAN M, JIANG K. Sensitivity enhancement of SPR biosensor by improving surface quality of glass slides[J]. Microelectronic Enginee ring, 2010, 87(5/6/7/8): 790-792.

[22] KAROONUTHAISIRI N, CHARLERMROJ R, MORTON M J, et al. Development of a M13 bacteriophage-based SPR detection using Salmonella as a case study[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2014, 190: 214-220.

[23] SOTA H, HASEGAWA Y, IWAKURA M. Detection of conformational changes in an immobilized protein using surface plasmon resonance[J]. Analytical Chemistry, 1998, 70(10): 2019-2024.

[24] MASSARELLI. Computational modeli ng and surface plasmon resonance analyses in the assessment of peptide ligands interacting with fibrin gamma(312-324)epitope[J]. European Journal Medicinal Chemistry, 2009, 44(5): 2128-2134.

[25] COCHRAN S, LI C P, FERRO V. A surface plasmon resonancebased solution affinity assay for heparan sulfate-binding proteins[J]. Glycoconjugate Journal, 2009, 26(5): 577-587.

[26] MONTEIRO J P, FERREIRA J, SABAT R G, et al. SPR based biosensor using surface relief grating in transmission mode[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2012, 174: 270-273.

[27] NAKAMURA K, SAKAGAMI H, ASANUMA-DATE K, et al. Immobilized glycosylated Fmoc-amino acid for SPR: comparative studies of lectin-binding to linear or biantennary dilacNAc structures[J]. Carbohydrate Research, 2013, 382(15): 77-85.

Using a Surface Plasmon Resonance Sensor for the Detection of Bacillus thuringiensis Cry2A Protein

CAI Miao1, HUANG Xin2, YUE Xi-qing1,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. Institute of Plant Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China)

Purpose: To establish a method to detect Bacillus thuringiensis (Bt) Cry2A protein by surface plasmon resonance (SPR) sensor. Methods: By using SPR based on interaction between biomolecules, the monoclonal antibodies specific to the Cry2A protein were modified on the gold surface for the detection of this protein. Results: The detection limit of Cry2A protein was 10 ng/mL by this method without cross-reaction with Cry1Ac or Cry2Ab protein. Conclusion: The SPR method was simple, time-saving, sensitive, specific and applicable for the qualitative detection of Bt Cry2A protein.

surface plasmon resonance sensor; Cry2A protein; Bacillus thuringiensis; genetically modified plant

Q31

A

1002-6630（2014）24-0201-04

10.7506/spkx1002-6630-201424038

2014-01-17

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201410014）

蔡淼（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因檢測(cè)。E-mail：779302469@qq.com

*通信作者：岳喜慶（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail：yxqsyau@126.com