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        表面等離子共振傳感檢測(cè)Cry2A蛋白

        2014-03-08 09:17:57岳喜慶
        食品科學(xué) 2014年24期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法

        蔡 淼,黃 新,岳喜慶,*

        (1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110866;2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所,北京 100029)

        表面等離子共振傳感檢測(cè)Cry2A蛋白

        蔡 淼1,黃 新2,岳喜慶1,*

        (1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110866;2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所,北京 100029)

        目的:建立利用表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)傳感器檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中蘇云金芽孢桿菌Cry2A蛋白的方法。方法:利用SPR檢測(cè)技術(shù),根據(jù)生物分子間的相互作用,在金片表面修飾Cry2A蛋白的特異性單克隆抗體,對(duì)不同質(zhì)量濃度梯度的Cry2A蛋白進(jìn)行檢測(cè)研究。結(jié)果:該方法可有效地檢測(cè)到Cry2A蛋白,檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 ng/mL,與同為抗蟲基因編碼的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。結(jié)論:利用SPR方法檢測(cè)Cry2A蛋白操作簡(jiǎn)單,省時(shí)且靈敏度高、特異性強(qiáng),可用于對(duì)Cry2A蛋白的定性檢測(cè)。

        表面等離子共振傳感器;Cry2A蛋白;蘇云金芽孢桿菌;轉(zhuǎn)基因植物

        蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt),是一種分布非常廣泛的革蘭氏陽(yáng)性病原性細(xì)菌[1],其在芽孢形成時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有殺蟲活性的晶體蛋白質(zhì)[2],稱為殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein,ICP)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Bt基因?qū)胫参镏?,改良植物品種,使改良后的植物具有抗蟲基因,可有效殺滅多種害蟲[3-7]。在節(jié)省害蟲防治成本的同時(shí),還能緩解因大量施用農(nóng)藥而造成的環(huán)境污染。目前已有多種轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化種植,如玉米、棉花、馬鈴薯、番茄等[8]。然而,由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問(wèn)題一直備受關(guān)注,各國(guó)對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種植和進(jìn)口都有著嚴(yán)格的規(guī)定,因此研究出一種簡(jiǎn)便快捷地檢測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因作物的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究針對(duì)Bt蛋白中的Cry2A蛋白進(jìn)行檢測(cè)研究,Cry2A蛋白能同時(shí)殺滅鱗翅目害蟲和雙翅目害蟲。

        表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)技術(shù)是近些年得到長(zhǎng)足發(fā)展的一項(xiàng)應(yīng)用于分析生物分子間相互作用的檢測(cè)技術(shù)[9-14],而表面等離子共振傳感器便是基于這種技術(shù)的一種光學(xué)傳感器,它利用全反射時(shí)入射光可以和金屬表面的等離子發(fā)生共振的原理,檢測(cè)生物分子之間的相互作用與結(jié)合過(guò)程以及動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[11,15-18]。相比其他檢測(cè)方法,SPR方法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):1)檢測(cè)樣品不需標(biāo)記,避免了樣品因?yàn)闃?biāo)記不當(dāng)而失去活性[19-22];2)可做到動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè);3)檢測(cè)過(guò)程非常簡(jiǎn)便且靈敏度高。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品分析、蛋白質(zhì)[23-25]與核酸檢測(cè)[26-27]、藥物篩選、臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)便是基于這種技術(shù),利用SPR傳感器對(duì)Bt抗蟲蛋白Cry2A進(jìn)行了檢測(cè)研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑與儀器

        單側(cè)鍍金玻璃片(12 mm×20 mm,單側(cè)鍍金50 nm)、SPR Navi 200傳感器 芬蘭BioNavis公司;蒸餾水;無(wú)水乙醇;30%氨水、30%雙氧水均為分析純;巰基十一酸(11-mercaptoundecanoic acid,11-MUA) Sigma中國(guó)上海有限公司;3-巰基丙酸(3-mercaptopropionic acid,3-MPA)、脂肪酸甲酯磺酸鹽(fatty acid methyl ester sulfonate,MES)、N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺(N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(1-hydroxy-5-pyrrolidinedione,NHS)、Cry2A蛋白及其單克隆抗體、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、磷酸鹽(phosphate buffered saline,PBS)緩沖液(20 mmol/L NaH2PO4,150 mmol/L NaCl,pH7.4)、DHG-9030恒溫干燥箱 北京江陰濱江設(shè)備公司;Cry2A蛋白檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Envirlogix公司。

        1.2 方法

        1.2.1 SPR金片預(yù)處理

        將30%氨水、30%雙氧水、蒸餾水按照1∶1∶5的體積比混合,把金片置入其中,于水浴鍋中煮沸,溫度設(shè)置為80~90 ℃,10 min后取出,用蒸餾水及無(wú)水乙醇分別清洗金片表面,氮?dú)獯蹈杀砻?,以便用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2 SPR金片表面修飾

        將10 mmol/L 3-MPA溶液與10 mmol/L 11-MUA溶液以10∶1的比例混合,把金片鍍金的一面朝上置于其中,浸泡24 h;取出金片,用蒸餾水及無(wú)水乙醇沖洗金片并用氮?dú)獯蹈?,于金片表面滴?00 μL EDC(0.4 mol/L),100 μL NHS(0.1 mol/L)(EDC、NHS均用MES溶解)以活化金片表面的硫醇羧基,室溫靜置2 h后用蒸餾水及無(wú) 水乙醇清洗金片,氮?dú)獯蹈?,再次滴?00 μL EDC,100 μL NHS,室溫靜置2 h;蒸餾水及無(wú)水乙醇清洗并吹干金片,金片表面滴加100 μL Cry2A單克隆抗體溶液(0.2 mg/mL,PBS稀釋),37 ℃恒溫箱中靜置3 h;蒸餾水洗去表面抗體溶液,氮?dú)獯蹈桑? mg/mL PBS稀釋,覆蓋于金片表面,室溫靜置2 h,用蒸餾水將金片表面清洗干凈,吹干,置于PBS中4 ℃保存。

        1.2.3 SPR檢測(cè)樣品

        取出金片,用蒸餾水洗凈,氮?dú)獯蹈?,將金片放入SPR傳感器的指定位置中,打開(kāi)儀器和監(jiān)測(cè)軟件,通入PBS(使用前需超聲),流速為10 μL/min,待反應(yīng)池及棱鏡溫度達(dá)到設(shè)置溫度后進(jìn)行初始角度掃描(一般將反應(yīng)溫度設(shè)置為低于室溫1~2 ℃),找到固定角后進(jìn)行固定角掃描,待基線穩(wěn)定后,用進(jìn)樣注射器注入300 μL待測(cè)樣品溶液(PBS稀釋),通過(guò)SPR檢測(cè)軟件實(shí)時(shí)觀察反應(yīng)過(guò)程。

        1.2.4 酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測(cè)Cry2A蛋白

        將Cry2A標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋到目標(biāo)質(zhì)量濃度,取100 μL加入到樣品板中,室溫靜置15 min,加入100 μL酶標(biāo)抗體,室溫孵育1 h,傾去反應(yīng)液,拍干,吐溫-PBS緩沖液(tween PBS,PBST)洗滌3 次,加入100 μL底物,靜置30 min,最后加入100 μL終止液,使用酶標(biāo)儀讀數(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的靈敏度

        將待測(cè)抗原Cry2A稀釋成不同質(zhì)量濃度(10~1 000 ng/mL),每種質(zhì)量濃度在同一條件下重復(fù)檢測(cè)3 次,對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算平均值,結(jié)果如圖1所示。進(jìn)樣后約30 s開(kāi)始產(chǎn)生響應(yīng),表明待測(cè)樣品流經(jīng)金片表面時(shí)與結(jié)合在金片表面的單抗發(fā)生特異性結(jié)合,引起金片表面折射率的變化,使SPR角度發(fā)生偏移。樣品質(zhì)量濃度越高,響應(yīng)值越大,說(shuō)明結(jié)合在金片表面的抗原越多。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,使用SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的最低檢測(cè)限為10 ng/mL。

        圖1 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的靈敏度Fig.1 Sensitivity of SPR for the detection of Cry2A protein

        2.2 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的重復(fù)性

        選取4 種不同質(zhì)量濃度的Cry2A蛋白重復(fù)檢測(cè)3 次,表1結(jié)果顯示每次檢測(cè)都有明顯的反應(yīng),且同一質(zhì)量濃度的響應(yīng)值差異很小,隨蛋白質(zhì)量濃度的降低反應(yīng)響應(yīng)值也相應(yīng)減小,表明SPR檢測(cè)Cry2A的重復(fù)性較好。

        表1 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的重復(fù)性Table 1 Repeatability of SPR for the detection of Cry2A protein

        2.3 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的特異性

        為了驗(yàn)證SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的特異性,選用另外兩種抗蟲Bt蛋白Cry1Ac和Cry2Ab作為對(duì)照,3 種蛋白均以1 μg/mL質(zhì)量濃度進(jìn)樣,進(jìn)行3 次特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示,Cry2A蛋白有明顯響應(yīng),而Cry1Ac和Cry2Ab蛋白則未出現(xiàn)明顯響應(yīng),由此可見(jiàn)此方法檢測(cè)Cry2A蛋白具有較好的特異性。

        圖2 SPR檢測(cè)Cry2A蛋白的特異性Fig.2 Specificity of SPR for the detection of Cry2A protein

        2.4 ELISA法檢測(cè)Cry2A蛋白

        使用Cry2A檢測(cè)試劑盒對(duì)不同質(zhì)量濃度的Cry2A抗原進(jìn)行了檢測(cè),每個(gè)質(zhì)量濃度3 個(gè)重復(fù),結(jié)果如表2所示。陰性樣品的OD值一般不超過(guò)0.2,超過(guò)0.2均視為陽(yáng)性樣品,故ELISA法檢測(cè)Cry2A蛋白的靈敏度可達(dá)10 ng/mL,與SPR方法靈敏度相當(dāng),但SPR方法具有免標(biāo)記、操作簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)勢(shì)。

        表 2 ELISA 檢測(cè)CCrryy22AA蛋白靈敏度Table 2 Sensitivity of ELISA for the detection of Cry2A protein

        3 討論與結(jié)論

        轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全問(wèn)題一直備受關(guān)注,我國(guó)政府高度重視轉(zhuǎn)基因植物安全檢測(cè)工作。因此,對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)新方法的研究具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。SPR傳感器是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的新型檢測(cè)儀器。近30a來(lái),SPR傳感器在技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用領(lǐng)域等方面都有很大的進(jìn)步,現(xiàn)已成為一種檢測(cè)生物分子間相互作用的核心手段,且SPR檢測(cè)金片可反復(fù)使用30 次左右,降低了實(shí)驗(yàn)成本。但SPR技術(shù)在靈敏度、多通道檢測(cè)等方面還有不足。在靈敏度方面目前SPR技術(shù)還無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)到一些低濃度、小分子質(zhì)量的分子。在實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)方面,目前SPR傳感器僅可同時(shí)檢測(cè)兩組數(shù)據(jù)。以上兩方面問(wèn)題將是今后SPR檢測(cè)研究的主要方向。本實(shí)驗(yàn)基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理,運(yùn)用SPR檢測(cè)技術(shù),研究建立了Cry2A蛋白的新的檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 ng/mL,與傳統(tǒng)的ELISA檢測(cè)方法靈敏度相似,但SPR方法具有免標(biāo)記、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、操作省時(shí)簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì),且特異性較好,在與Cry1Ac和Cry2Ab蛋白的對(duì)照檢測(cè)中可看出,Cry1Ac和Cry2Ab蛋白未出現(xiàn)明顯響應(yīng),而Cry2A蛋白響應(yīng)明顯。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此方法具有較好的穩(wěn)定性,可實(shí)現(xiàn)對(duì)Cry2A蛋白的定性檢測(cè),為Bt蛋白的檢測(cè)提供了一種新的可行性方法。

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        Using a Surface Plasmon Resonance Sensor for the Detection of Bacillus thuringiensis Cry2A Protein

        CAI Miao1, HUANG Xin2, YUE Xi-qing1,*
        (1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. Institute of Plant Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China)

        Purpose: To establish a method to detect Bacillus thuringiensis (Bt) Cry2A protein by surface plasmon resonance (SPR) sensor. Methods: By using SPR based on interaction between biomolecules, the monoclonal antibodies specific to the Cry2A protein were modified on the gold surface for the detection of this protein. Results: The detection limit of Cry2A protein was 10 ng/mL by this method without cross-reaction with Cry1Ac or Cry2Ab protein. Conclusion: The SPR method was simple, time-saving, sensitive, specific and applicable for the qualitative detection of Bt Cry2A protein.

        surface plasmon resonance sensor; Cry2A protein; Bacillus thuringiensis; genetically modified plant

        Q31

        A

        1002-6630(2014)24-0201-04

        10.7506/spkx1002-6630-201424038

        2014-01-17

        質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201410014)

        蔡淼(1987—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因檢測(cè)。E-mail:779302469@qq.com

        *通信作者:岳喜慶(1966—),男,教授,博士,研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail:yxqsyau@126.com

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