位 杰，吳翠云,2，蔣 媛，王合理,*

（1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

蒽酮法測定紅棗可溶性糖含量條件的優(yōu)化

位 杰1，吳翠云1,2，蔣 媛1，王合理1,*

（1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

以紅棗為試材，通過單因素試驗研究反應(yīng)溫度、蒽酮質(zhì)量濃度、蒽酮用量、顯色反應(yīng)時間、冷卻時間對紅棗可溶性糖含量測定的影響，并采用正交試驗優(yōu)化測定紅棗可溶性糖含量的最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明，紅棗可溶性糖含量測定的最佳條件為：蒽酮質(zhì)量濃度25 mg/mL、蒽酮試劑用量3 mL、室溫反應(yīng)時間1 min、冷卻時間25 min。該方法操作簡便、快速、靈敏度高。驗證實驗結(jié)果表明，蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液含量在20～240 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系（A=0.004 5C－0.013 4，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 2，式中，A為吸光度；C為糖含量）。實驗重現(xiàn)性好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.20%（n=3）；平均回收率達(dá)102.87%，RSD為0.84%（n=3）。最佳優(yōu)化條件下測得的紅棗可溶性糖含量為68.43%（以干質(zhì)量計）。

蒽酮法；紅棗；可溶性糖；優(yōu)化

棗（Zizyphus jujube Mill.）原產(chǎn)于我國，又名大棗、棗子、紅棗，栽培歷史悠久，是最具代表性的民族果樹。棗的營養(yǎng)價值和藥用價值都很高，具有多種營養(yǎng)保健功能。新疆紅棗近年來發(fā)展迅速，得天獨厚的地理條件和氣候環(huán)境造就了新疆紅棗的優(yōu)良品質(zhì)，使得新疆紅棗受到越來越多的消費者的青睞。因此，充分運用現(xiàn)代科技手段提取和開發(fā)紅棗功能成分，對其進(jìn)行深加工和新產(chǎn)品研究，提高附加值，具有重要的意義。糖是紅棗中重要的天然活性成分，對抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、調(diào)血脂、降血糖以及提高機體免疫力具有重要作用[1-3]，總糖能反映出食品營養(yǎng)素的組成，還可以計算食品中由糖類物質(zhì)提供的熱量[4]。此外，可溶性糖也是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物，是決定棗果實品質(zhì)和風(fēng)味的重要指標(biāo)，其含量的多少直接影響棗果的口感和甜度，而不同的棗品種其糖含量也不盡相同。多糖的檢測通常采用比色法測定，影響顯色的因素主要有顯色劑用量、顯色劑濃度、顯色溫度及顯色時間等[5-6]。蒽酮法是目前常用的糖定量測定方法，其原理是糖在濃硫酸作用下，經(jīng)脫水反應(yīng)生成的糠醛或羥甲基糠醛與蒽酮反應(yīng)，生成藍(lán)綠色化合物，在一定的范圍內(nèi)，顏色深淺與糖的含量成正比[7]。蒽酮法測定可溶性糖因其準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好、操作簡便、快速、靈敏[8]等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于各種植物組織中可溶性糖含量的測定。

學(xué)者們對蒽酮法的反應(yīng)條件進(jìn)行研究，林炎坤[9]提出利用濃硫酸與水反應(yīng)放熱的“水合熱法”來代替外加熱法，張妙霞等[10]也提出蒽酮硫酸法室溫顯色的靈敏度高，顯色充分，測定誤差?。坏蠖鄶?shù)的研究還是采用外加熱法[11-14]。不同的測定方法其測定結(jié)果往往差異很大，同一種方法應(yīng)用于不同的植物其差異也很大。關(guān)于蒽酮法測定紅棗可溶性糖含量反應(yīng)條件的研究還鮮見報道，因此有必要對其測定條件進(jìn)行探討和優(yōu)化，以期獲得蒽酮法測定紅棗可溶性糖的最佳條件，并將其應(yīng)用到實踐中去，為紅棗可溶性糖的深入研究、應(yīng)用以及棗種質(zhì)資源品種性狀的評價提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟后自然風(fēng)干的灰棗，采自塔里木大學(xué)園藝試驗站。果實成熟度一致，大小均勻。蔗糖、濃硫酸、蒽酮均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BP211D電子分析天平 廣州廣一科學(xué)儀器有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；UV1800紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Multifuge X1R高速冷凍離心機 德國Heraeus公司。

1.3 方法

1.3.1 紅棗可溶性糖提取液的制備

紅棗可溶性糖提取液的制備參考郭明等[15]方法：溫度84℃、時間32 min、料液比1∶12。

1.3.2 試驗設(shè)計

通過對反應(yīng)溫度、蒽酮試劑質(zhì)量濃度、蒽酮試劑用量、反應(yīng)時間、冷卻時間等影響紅棗可溶性糖含量測定的條件進(jìn)行單因素試驗，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交優(yōu)化設(shè)計試驗，確定紅棗可溶性糖含量測定的最佳條件。在最優(yōu)條件下制作蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，并測定精密度和回收率。

1.3.3 精密度與回收率

精密度：將同一紅棗可溶性糖提取液樣品分成3份，每份在最佳反應(yīng)條件下測定其可溶性糖含量，求3次測定結(jié)果的平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

回收率：向已知可溶性糖含量的紅棗可溶性糖提取液中加入定量的無水蔗糖，按最佳優(yōu)化條件測定其可溶性糖含量，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 反應(yīng)溫度對吸光度的影響

分別取樣液1 mL于試管中，同時另取一支試管，向其中加入1 mL蒸餾水作為空白對照管，各管中分別加入5 mL質(zhì)量濃度20 mg/mL蒽酮試劑，每處理3 次重復(fù)。分別于室溫（18）、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴中反應(yīng)10 min，冷水中冷卻10 min，在620 nm波長處測吸光度，測定結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)溫度對吸光度的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on absorbance

由圖1可知，在室溫條件下，顯色反應(yīng)即可達(dá)到完全，隨著水浴溫度的升高，樣液吸光度逐漸下降，80℃后又緩慢升高，但吸光度仍低于室溫的吸光度。在室溫條件下，濃硫酸與水發(fā)生水合反應(yīng)放出大量熱量，使反應(yīng)系統(tǒng)自行升溫，即可達(dá)到充分顯色，因此，試驗中采用水合熱法免去了外加熱，使操作更為簡便，即節(jié)約了能源又提高了工作效率。

2.1.2 蒽酮試劑質(zhì)量濃度對吸光度的影響

圖2 蒽酮試劑質(zhì)量濃度對吸光度的影響Fig.2 Effect of anthrone concentration on absorbance

分別配制不同質(zhì)量濃度的蒽酮試劑（5、10、15、20、25、30、40 mg/mL），分別取樣液1 mL于試管中，同時另取一支試管，向其中加入1 mL蒸餾水作為空白對照管，各試管中分別加入5 mL不同質(zhì)量濃度的蒽酮試劑，每處理3 次重復(fù)。室溫條件下反應(yīng)10 min，冷水中冷卻10 min，在620 nm波長處測吸光度。測定結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著蒽酮試劑質(zhì)量濃度的增加，樣品吸光度逐漸增大。蒽酮試劑質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL時，吸光度趨于穩(wěn)定，說明此時可溶性糖與蒽酮試劑已經(jīng)反應(yīng)完全，此后再增加蒽酮的量，吸光度也不再增大。而在蒽酮試劑質(zhì)量濃度低于20 mg/mL時，蒽酮的量不足，反應(yīng)不完全，致使吸光度偏低。從充分反應(yīng)和經(jīng)濟角度兩方面來看，蒽酮試劑的最佳質(zhì)量濃度為20 mg/mL。

2.1.3 蒽酮試劑用量對吸光度的影響

分別取樣液1 mL于試管中，同時另取一支試管，向其中加入1 mL蒸餾水作為空白對照管，各管中分別加入1、2、3、5、7、9、10 mL質(zhì)量濃度20 mg/mL的蒽酮試劑，每處理3 次重復(fù)。室溫條件下反應(yīng)10 min，冷水中冷卻10 min，在620 nm波長處測吸光度，測定結(jié)果見圖3。

圖3 蒽酮試劑用量對吸光度的影響Fig.3 Effect of anthrone reagent consumption on absorbance

由圖3可知，蒽酮試劑使用量不同，對紅棗可溶性糖的顯色效果也不同，用量在1～3 mL時，隨著用量的增加，吸光度逐漸增大，蒽酮試劑用量為3 mL時，樣品吸光度達(dá)到最大。此后再增加蒽酮試劑的用量，吸光度逐漸下降。結(jié)果表明，蒽酮試劑最佳用量為3 mL。

2.1.4 反應(yīng)時間對吸光度的影響

圖4 反應(yīng)時間對吸光度的影響Fig.4 Effect of reaction time on absorbance

分別取樣液1 mL于試管中，同時另取一支試管，向其中加入1 mL蒸餾水作為空白對照管，各管中分別加入3 mL質(zhì)量濃度20 mg/mL的蒽酮試劑，每處理3 次重復(fù)。室溫條件下顯色反應(yīng)0.5、1、2、3、5、8、10、15、18、20 min，冷水中冷卻10 min，在620 nm波長處測吸光度，測定結(jié)果見圖4。

由圖4可知，反應(yīng)時間對樣品可溶性糖含量測定的影響較大，顯色反應(yīng)時間短，反應(yīng)不完全，隨著反應(yīng)時間的延長，樣品吸光度逐漸下降，15 min后吸光度變化差異不大。因此，宜將顯色反應(yīng)時間控制在1～3 min內(nèi)。反應(yīng)1 min后冷卻所測定的總糖含量最高。因此，最佳反應(yīng)時間確定為1 min。

2.1.5 冷卻時間對吸光度的影響

分別取樣液1 mL于試管中，同時另取一支試管，向其中加入1 mL蒸餾水作為空白對照管，各管中分別加入3 mL質(zhì)量濃度20 mg/mL蒽酮試劑，每處理3 次重復(fù)。室溫條件下反應(yīng)1 min，冷水中冷卻10、15、20、25、30、35、40 min，在620 nm波長處測吸光度，測定結(jié)果見圖5。

圖5 冷卻時間對吸光度的影響Fig.5 Effect of cooling time on absorbance

從圖5可以看出，隨著冷卻時間的延長，樣液吸光度先升高然后下降，冷卻時間30 min時吸光度達(dá)到最大。冷卻時間太短，反應(yīng)不能立即終止，就會出現(xiàn)反應(yīng)聚合過度，從而使測量結(jié)果偏小。反之，冷卻時間過長，也會造成比較大的誤差。因此，確定最佳冷卻時間為30 min。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗設(shè)計優(yōu)化紅棗可溶性糖測定

表1 正交試驗LL9（334）設(shè)計及結(jié)果Table 1 Results of orthogonal experiments

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)正交試驗設(shè)計原理，以蒽酮質(zhì)量濃度（20、25、30 mg/mL）、蒽酮試劑用量（2、3、5 mL）、反應(yīng)時間（1、2、3 min）、冷卻時間（20、25、30 min）設(shè)計四因素三水平正交試驗，試驗結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設(shè)計方差分析表Table 2 Analysis of variance of the orthogonal experimental results

從表1和表2的極差、方差分析結(jié)果表明，各影響因子的主次順序為：A蒽酮試劑質(zhì)量濃度＞B蒽酮試劑用量＞C顯色反應(yīng)時間＞D冷卻時間，蒽酮試劑質(zhì)量濃度對測定結(jié)果有顯著影響，蒽酮試劑用量、顯色反應(yīng)時間、冷卻時間對測定結(jié)果的影響不顯著。正交試驗確蒽酮法測定紅棗可溶性糖最優(yōu)組合為A3B2C1D2，即：蒽酮質(zhì)量濃度25 mg/mL、蒽酮試劑用量3 mL、室溫顯色反應(yīng)1 min、冷卻時間25 min。由于正交試驗最優(yōu)組合A3B2C1D2未在L9（34）正交表中，因此，在最優(yōu)化的測定條件下對其進(jìn)行驗證，3 次重復(fù)的平均吸光度結(jié)果為1.013，高于正交試驗號所有組合的試驗結(jié)果，表明正交優(yōu)化試驗確定的最優(yōu)組合結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2.2 驗證實驗

將分析純蔗糖在80 ℃條件下烘至恒質(zhì)量，精確稱取2.000 g，加少量水溶解并定容至100 mL，取出1 mL再定容至100 mL，即得0.2 mg/mL的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，蒸餾水定容至2.0 mL，然后各加入20 mg/mL蒽酮試劑5 mL，室溫顯色1 min后冷卻25 min，然后在620 nm波長處比色。以吸光度為縱坐標(biāo)，糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液的含量在20～240 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，其回歸方程為：A=0.004 5C－0.013 4，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 2；傳統(tǒng)的蒽酮比色法（沸水浴加熱）的回歸方程為：A=0.003 2C－0.002，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 3。優(yōu)化條件下的回歸系數(shù)（0.004 5）高于傳統(tǒng)蒽酮比色法的回歸系數(shù)（0.003 2），優(yōu)化條件的靈敏度高于傳統(tǒng)的蒽酮比色法靈敏度的1.41 倍，表明優(yōu)化方法具有較高的靈敏度。根據(jù)最佳優(yōu)化條件測得的吸光度以及回歸方程可得，紅棗可溶性糖含量為68.43%（以干質(zhì)量計）。

2.2.3 優(yōu)化條件對水浴溫度的驗證

分別取樣液1 mL于試管中，同時另取一支試管，向其中加入1 mL蒸餾水作為空白對照管，各管中分別加入3 mL質(zhì)量濃度25 mg/mL蒽酮試劑，每處理3 次重復(fù)。分別于室溫、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴中反應(yīng)1 min，冷水中冷卻25 min，在620 nm波長處測吸光度，測定結(jié)果見圖6。

圖6 優(yōu)化條件下反應(yīng)溫度對吸光度的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on absorbance under the optimum conditions

從圖6可以看出，在最優(yōu)化的實驗條件下，樣品液的吸光度隨溫度的升高先逐漸降低，后又緩慢升高至穩(wěn)定，沸水浴的吸光度略低于室溫反應(yīng)的吸光度，表明蒽酮法測定棗可溶性糖在室溫條件下顯色即可達(dá)到完全。因此，可以采用室溫顯色以節(jié)約能源和簡化操作，提高工作效率。

2.2.4 精密度與回收率實驗

表3 紅棗可溶性糖含量精密度實驗結(jié)果（n=3）Table 3 Precision for replicate determinations of soluble sugar content in red jujubess ((n = 3)

表4 紅棗可溶性糖含量回收率實驗結(jié)果（n==33）Table 4 Recovery rates of soluble sugar in red jujubes spiked with sucrose (n = 3)

由表3可知，同一紅棗樣品3 次重復(fù)測得的可溶性糖平均含量為68.20%，RSD為0.20%，表明優(yōu)化的實驗方法具有較好的重現(xiàn)性。由表4可知，按優(yōu)化的實驗方法測得的紅棗可溶性糖含量的平均回收率102.87%，RSD為0.84%，說明按上述優(yōu)化的測定條件和回歸方程，測定紅棗可溶性糖含量的準(zhǔn)確性較好。

3 討論與結(jié)論

蒽酮法測定紅棗可溶性糖不需要昂貴的儀器，簡便快速，完全可以滿足常規(guī)的分析要求。但此法干擾因素較多，如蒽酮試劑質(zhì)量濃度、蒽酮試劑用量、顯色反應(yīng)時間、冷卻時間以及外源加熱與否都影響其顯色，操作條件控制不好易引起誤差。

經(jīng)典的蒽酮比色法需使用沸騰的水浴[16-17]，李利軍等[18]在測定甘蔗含糖量時免去了水浴加熱步驟，發(fā)展了新的蒽酮-硫酸法。本研究表明，直接利用硫酸與水發(fā)生水合反應(yīng)時釋放的熱量，使反應(yīng)體系自行升溫，即可達(dá)到充分顯色。從方法的簡易程度比較，蒽酮法測定紅棗可溶性糖室溫顯色省去了外加熱一項，更為簡便，提高了測定速度，對取樣較多，測定任務(wù)較大的科研而言，這是一種較好的方法。

蒽酮不溶于水，易溶于濃硫酸，難溶于稀硫酸。蒽酮試劑的質(zhì)量濃度和用量對顯色有較大影響。蒽酮試劑質(zhì)量濃度小，反應(yīng)不完全，蒽酮試劑質(zhì)量濃度過大，蒽酮難以溶解。蒽酮試劑用量少，不夠反應(yīng)消耗，多余糠醛沒有參與反應(yīng)，從而使結(jié)果偏?。惠焱噭┯昧慷?，稀釋了顯色液，使溶液光通透性減小，也會使結(jié)果偏小，這與王宏軍等[19]的研究結(jié)果相吻合。

傳統(tǒng)的蒽酮比色法采用沸水浴，顯色時間從2～15 min不等[20-23]。本研究發(fā)現(xiàn)顯色時間與糖含量之間呈負(fù)相關(guān)，隨著顯色時間的延長，可溶性糖含量逐漸下降。這可能是反應(yīng)生成的糠醛衍生物不穩(wěn)定，反應(yīng)時間過長，糠醛衍生物被濃硫酸氧化破壞，顏色發(fā)生消退，造成吸光度減小[24-25]。因此，實驗過程中要注意控制好沸水浴的時間。

常用的蒽酮比色法在測定可溶性糖含量時，很少考慮冷卻時間對結(jié)果的影響，實驗時在待測液溫度下降之后就直接進(jìn)行測定。若冷卻時間不夠，測定時反應(yīng)還未終止，使測定結(jié)果不準(zhǔn)確，穩(wěn)定性也較差；冷卻時間過長，將使絡(luò)合反應(yīng)過度，生成的藍(lán)綠色化合物會發(fā)生進(jìn)一步聚合，產(chǎn)生其他物質(zhì)，造成結(jié)果偏小[26]。

本實驗采用單因素試驗設(shè)計考察了蒽酮試劑質(zhì)量濃度、蒽酮試劑用量、顯色反應(yīng)時間、冷卻時間對蒽酮法測定紅棗可溶性糖含量的影響，并在此基礎(chǔ)上，利用正交試驗設(shè)計優(yōu)化了反應(yīng)條件，發(fā)展了蒽酮硫酸水合熱法測定紅棗可溶性糖含量的最佳條件：蒽酮質(zhì)量濃度25 mg/mL、蒽酮試劑用量3 mL、室溫顯色反應(yīng)1 min、冷卻時間25 min。在此優(yōu)化條件下得蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.004 5C－0.013 4，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 2，靈敏度高。實驗重現(xiàn)性好，RSD為0.20%（n=3），平均回收率達(dá)102.87%，RSD為0.84%（n=3）。最佳優(yōu)化條件下測得的紅棗可溶性糖含量為68.43%（以干質(zhì)量計）。

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Sample Preparation Optimization for Determination of Soluble Sugar in Red Jujube Fruits by Anthrone Method

WEI Jie1, WU Cui-yun1,2, JIANG Yuan1, WANG He-li1,*
(1. College of Plant Science, Tarim University, Alar 843300, China; 2. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Alar 843300, China)

This paper reports the optimization of sample preparation conditions including reaction temperature, anthrone concentration and amount, color development time and cooling time for the determination of soluble sugar in red jujube fruits using a combination of single factor and orthogonal array designs. The results showed that 1 min reaction at room temperature in the presence of 3 mL of 25 mg/mL anthrone reagent followed by 25 min of cooling was found to be optimal. The established analytical method was characteristics of simple operation, rapidity and high sensitivity. Verification experiments showed that the standard curve of sucrose standard solution in the range of 20–240 μg/mL had good linearity (A = 0.004 5C - 0.013 4, R2= 0.999 2), with a good reproducibility. The accuracy, expressed as RSD, was 0.20% (n = 3) and the average recovery was 102.87% (n = 3) with a RSD of 0.84%. Dried red jujubes contained 68.43% soluble sugar as determined by this method.

anthrone method; red jujube; soluble sugar; optimization

S665.1

A

1002-6630（2014）24-0136-05

10.7506/spkx1002-6630-201424026

2014-04-02

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31260459）；新疆研究生科研創(chuàng)新項目（XJGRI2013153）；兵團重大產(chǎn)學(xué)研合作科技專項（2010ZX02）；塔里木大學(xué)創(chuàng)新群體研究項目（TDZXCX1001）

位杰（1987—），男，碩士研究生，研究方向為果樹栽培生理生態(tài)。E-mail：627weijie@sina.com

*通信作者：王合理（1958—），男，教授，學(xué)士，研究方向為設(shè)施園藝、蔬菜栽培生理生態(tài)。E-mail：waheli@sina.com