王 帥，吳子健,*，王素英，劉建福，張 偉，帖 航，榮 強

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.天津市青年職業(yè)技術(shù)學(xué)院烹 飪系，天津 300191）

三步沉淀法純化 雞卵類黏蛋白

王 帥1，吳子健1,*，王素英1，劉建福1，張 偉1，帖 航1，榮 強2

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.天津市青年職業(yè)技術(shù)學(xué)院烹 飪系，天津 300191）

雞卵類黏蛋白（hen’s e gg ovomucoid，HOVM）是雞蛋清中最重要的過敏原蛋白，探討三步沉淀（一步三氯乙酸沉淀以及兩步硫酸銨鹽析沉淀）從雞蛋清中提取并純化HOVM的工藝條件，并利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳以及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)檢測純化效果。結(jié)果表明：用等體積去離子水稀釋的雞卵清液加入質(zhì)量分數(shù)10%三氯乙酸去除大部 分雜蛋白后，所得上清液加入硫酸銨至終飽和度50%，鹽析沉淀進一步去除非HOVM的雜蛋白，上清液中最后再追加硫酸銨至終飽和度80%，離心所得沉淀再經(jīng)過透析凍干即為高純度的HOVM；HPLC（檢測波長220nm）檢測所獲HOVM的純度為99.202%，此工藝條件下得到HOVM的提取率約為27.05%。

雞卵類黏蛋白；三步沉淀；鹽析

雞卵類黏蛋白（hen’s egg ovomucoid，HOVM）是一種單亞基糖蛋白，等電點約為4.1，約占雞蛋清蛋白總量的11%，分子質(zhì)量約為28 kD。該蛋白中蛋白部分約占75%～80%[1-2]，含186 個氨基酸殘基以及9 個二硫鍵；而糖基部分約占20%～25%[3-4]。HOVM是目前已知雞蛋中變態(tài)反應(yīng)原性最強的蛋白[4-6]，由于其結(jié)構(gòu)緊密，且具耐熱、耐酸堿以及抗胰蛋白酶消化等特性[5-6]，因而其致敏性難以克服，且作用持久。更甚之，即便利用蛋白酶酶解將其降解成肽段，這些降解后的片段仍具有一定抗原性和過敏原性。這些都嚴重威脅著過 敏人群（特別是嬰幼兒）的機體健康，甚至是生命安全[7-8]。研究分析該分子的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，特別是其結(jié)構(gòu)與其過敏原性的關(guān)系，以及如何消減其過敏原性等基礎(chǔ)研究需要一定量的高純度HOVM（最佳純度不小于99%），因此能簡便地獲取高純度HOVM對于后續(xù)的研究與應(yīng)用具有十分重要的意義。

目前文獻報道的HOVM分離純化方法包括沉淀法[9-10]（有機溶劑沉淀法和鹽析法）、層析法[11-12]（離子交換層析法和分子篩層析法）、雙水相萃取法[13-14]和電泳法[15]等。其中雙水相萃取法和電泳法處理量小且不具有實際應(yīng)用價值[16-17]；分子篩層析不僅成本高，且處理量很小，而離子交換層析的處理量有一定的提升，但其規(guī)模仍難以滿足規(guī)模化制備的需要，且所用樹脂介質(zhì)較貴，技術(shù)也較為繁瑣；目前分離純化HOVM的沉淀技術(shù)多是利用二步沉淀法[9-10]，即：第一步利用有機溶劑（如三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA））除去雜蛋白，然后利用鹽析或有機溶劑沉淀法獲得HOVM，該法處理量大、成本低、操作簡便，但沉淀法的選擇性較小， 目前利用該法分離所得的HOVM純度均低于90%，還需利用其他技術(shù)，如層析技術(shù)或高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)，進一步純化，如史曉霞[18]利用TCA沉淀法結(jié)合丙酮沉淀法制備得到HOVM粗品，進一步通過離子交換層析純化才能得到純度約為95.3%的HOVM。為克服現(xiàn)有兩步沉淀法獲得HOVM普遍純度低于90%的缺點，本研究以雞蛋清為原料，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和HPLC技術(shù)的檢測手段，確定三步沉淀法獲得高純度HOVM的過程中各步驟的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋 市售；標(biāo)準Marker（PageRuler Prestained Protein Ladder#Sm0672） 美國Fermentas公司；HOV M標(biāo) 準品、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、SDS、丙烯酰胺（acrylamide，ACR）、甲叉雙丙烯酰胺（bis-acrylamide，Bis）、過硫酸銨（ammo nium peroxydisulfate，AP）、甘油、β-巰基乙醇、三氟乙酸（色譜純）、溴酚藍 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國J.T.Baker公司；去離子水、超純水 實驗室自制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2000ES全自動四元梯度高效液相色譜儀（配套UV1000紫外檢測儀） 美國Allteach公司；FDU-810型EYELA冷凍干燥機 日本東京理化公司；3-18K低溫高速離心機 德國Sigma公司；AUW120D型電子天平日本Shimadzu公司；164-5052電泳儀、164-8003小型垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；FiveEasy Plus? pH計瑞士Mettler Toledo公司；78-1型磁力加熱攪拌器 杭州儀表電機廠；新飛冷藏冷凍冰箱 河南新飛電器有限公司；TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；214TP C4色譜柱 美國Grace Vydac公司。

1.3 方法

1.3.1 HOVM提取工藝流程

手工分離蛋清與蛋黃→蛋清預(yù)處理降低黏度→加入一定量10% TCA溶液（pH 1.15）并混合均勻→用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH值→4 ℃條件下靜置4 h →離心（4℃，4 000×g）15 min→棄沉淀取上清液→量取上清液體積→4 ℃條件下24 h透析除去TCA →上清液中加入硫酸銨至一定飽和度→ 4 ℃條件下靜置4 h →離心（4℃，4 000×g）15 min→棄沉淀取上清液→上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至更高的飽和度→4 ℃條件下再次靜置4 h→再次離心（4 ℃，4 000×g）15 min→沉淀透析凍干→得到HOVM樣品→SDS-PAGE電泳或HPLC檢測純度

1.3.2 雞蛋清液的預(yù)處理

參照Guérin-Dubiard[19]、張晴晴[20]等的方法，略有改動，具體過程為：手工分離蛋清與蛋黃，得到蛋清并量取體積，加入等體積去離子水，4 ℃條件下磁力攪拌2.0 h，離心（4 ℃，4 000×g）15 min，棄沉淀與不溶物，上清液即為所得蛋清預(yù)處理液。

1.3.3 TCA法沉淀去除雜蛋白條件優(yōu)化

按照史曉霞[18]的方法，略有改動。具體步驟如下：一定體積的蛋清預(yù)處理液中緩慢加入一定體積10% TCA溶液（pH 1.15）并混合均勻，其中預(yù)處理蛋清溶液與TCA溶液的體積比分別為1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0以及1∶2.5；并用NaOH溶液（1.0 mol/L）調(diào)節(jié)混合溶液pH值（分別為2.5、3.0、3.5、4.0和4.5），室溫條件下靜置4 h以上，離心（4℃，4 000×g）15 min，所得上清液透析去除TCA，再經(jīng)凍干得到HOVM粗品。各條件下所得的樣品，均復(fù)溶于同樣體積的水中，再分別按照1.3.5節(jié)和1.3.6節(jié)方法進行SDS-PAGE和HPLC分析檢測蛋白純度。

1.3.4 兩步鹽析法純化HOVM

選取1.3.3節(jié)所得的最佳預(yù)處理蛋清溶液與TCA溶液體積比，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)至1.3.3節(jié)所得的最佳初始pH值，制備所得的HOVM粗提液中加入一定量的硫酸銨（飽和度分別為30%、40%、50%、60%、70%），4 ℃條件下靜置4 h，離心（4℃，4 000×g）15 min后棄沉淀取上清液，并分別按照1.3.5節(jié)和1.3.6節(jié)方法進行SDSPAGE和HPLC分析檢測蛋白純度。

選取第一步鹽析的最佳飽和度所得的蛋白上清液，繼續(xù)加入一定量硫酸銨（飽和度分別至65%、70%、75%、80%以及100%），4 ℃條件下靜置4 h后離心（4 ℃，4 000×g）15 min，棄上清液取沉淀，沉淀復(fù)溶于20.0 mL去離子水中，過夜透析后凍干。所得蛋白樣品按照1.3.5節(jié)和1.3.6節(jié)方法進行SDS-PAGE和HPLC分析檢測樣品。

1.3.5 SDS-PAGE檢測[21]

SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)樣品條件：質(zhì)量分數(shù)12%分離膠、5%濃縮膠、上樣量10 μL、200 V恒壓電泳1 h。

1.3.6 HPLC檢測蛋白純度[22]

色譜柱：Vydac 214TP C4（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃，檢測波長220 nm，進樣量20 μL；流動相A：含0.1%三氟乙酸的水溶液，流動相B：含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。線性梯度洗脫程序：0.0 min，50%B；7.0 min，57%B；9.1 min，58%B；11.1 min，60%B；13.1 min，61%B；17.1 min，63%B。流速0.3 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCA添加量對HOVM純化效果的影響

圖1 TCA沉淀除雜蛋白時TCA添加量對HOVM提取效果的影響Fig.1 Effect of the amount of TCA added to remove non-HOVM proteins on the recovery of HOVM

雞蛋清富含蛋白，除HOVM以外，含量較多蛋白質(zhì)還包括卵白蛋白（含量約54%～69%）、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（含量約12%～13%）、溶菌酶（含量約3.4%～3.5%）、卵黏蛋白（含量約1.5%～3.5%）、球蛋白G2（含量約4.0%）和球蛋白G3（含量約4.0%）[23-24]。蛋清經(jīng)預(yù)處理可有效去除卵黏蛋白，但仍含有大量的非HOVM蛋白[19]。因此接下來提取HOVM過程中利用沉淀法除去非HOVM的雜蛋白。HOVM具有特殊的溶解性能，能對TCA沉淀作用具有一定的抗性，即使在3%～5%的TCA溶液中也具有很好的溶解性，而此條件下蛋清中其他的蛋白溶解度卻大大降低[9-10]，因此可以利用TCA除去大部分雜蛋白。從圖1A可以看出，2～6電泳道中具有一條較寬的電泳帶，且顏色較深。HOVM含有20%～25%的糖基，含有如此高糖基含量的蛋白在做SDS-PAGE時，通常其條帶較寬[17,25]，本研究也驗證了這點。從圖1A還可知：當(dāng)預(yù)處理的蛋清溶液與10% TCA溶液體積比為1∶0.5（圖1A中第6電泳道）時，上清液中仍然含有一定量的雜蛋白，而通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)在保留時間為10.385 min時有69.053%的雜蛋白，通過與標(biāo)準分子質(zhì)量蛋白Marker比對，發(fā)現(xiàn)此時主要的雜蛋白為分子質(zhì)量約45k D的蛋白，推測其可能為白蛋白。電泳道2～5（分別代表預(yù)處理蛋清溶液與10% TCA溶液的體積比為1∶2.5、1∶2、1∶1.5和1∶1）所示的實驗結(jié)果來看，這些條件下去除非HOVM的雜蛋白的效果基本相同，而通過HPLC檢測結(jié)果可知（圖1B、C），預(yù)處理蛋清溶液與10% TCA溶液的體積比例為1∶1時該蛋白的純度最高，因此可以選取預(yù)處理蛋清溶液與10% TCA溶液的體積比1∶1，這個比例也與Lineweaver等[9]的結(jié)果一致。

2.2 TCA沉淀時pH值對分離HOVM效果的影響

不同pH值條件下HOVM耐受有機溶液沉淀的性能有一定的差別，中性或偏酸性條件下耐受性較高，而在堿性條件下耐受性差，且Fredericq等[10]發(fā)現(xiàn)若TCA質(zhì)量分數(shù)在3%～5%范圍內(nèi)，此時在pH 2.8～4.9時，HOVM溶解度會在12.60～16.15 g/L范圍有一定的變化。按照1.3.3節(jié)方法，將蛋清預(yù)處理液與10% TCA溶液按照體積比1∶1混勻后，以pH值為單因素條件，利用 NaOH（1 mol/L）溶液將混合液pH值調(diào)節(jié)至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5后靜置并離心，收集上清液再經(jīng)透析除去TCA，凍干，各條件下 所得樣品都復(fù)溶成同樣體積的溶液，因此所得SDS-PAGE電泳圖，既能體現(xiàn)其純度，也能體現(xiàn)其濃度，各個樣品的SDS-PAGE圖譜如圖2A所示，HPLC檢測圖譜如圖2C所示。結(jié)果表明，pH值為4.5、4.0、3.5條件下（圖2A中的電泳道2～4），HOVM存在于上清液中的量基本相同，但pH 4.5和pH 4.0條件下，非HOVM的雜蛋白在上清液中含量較高，由HPLC檢測圖譜2C5、C4可知，在保留時間分別為10.388min和10.378min時出現(xiàn)雜蛋白，推測這些非HOVM的蛋白，一種可能是分子質(zhì)量約為45 kD的卵清白蛋白，另一種可能是分子質(zhì)量為32～36 kD的核黃素結(jié)合蛋白；而pH 3.0和pH 2.5條件下（圖2A中的電泳道5和6），上清液中的HOVM純度雖然較好，但是HOVM在上清液中的含量明顯降低，并由圖2B可知，在pH 3.5條件下該蛋白純度最高，純度為96.831%。因此用NaOH溶液將蛋清預(yù)處理液與10% TCA的混合液的pH值調(diào)為3.5，TCA法沉淀除去非HOVM的雜蛋白的效果較好?？赡艿脑驗槁亚灏椎鞍纂m然在卵清中的含量很高，但是卵清白蛋白的等電點（pI 4.5）高于HOVM的等電點（pI 4.0），在pH 3.5條件下，卵清白蛋白帶有更多正電荷，更易與TCA所帶有負電荷中和而沉淀[11]。本研究與1949年Fredericq等[10]的研究結(jié)果也一致。

圖2 TCA沉淀除雜蛋白時pH值對分離HOVM效果的影響Fig.2 Effect of pH on the recovery of HOVM and the removal of no n-HOVM proteins

2.3 第一步鹽析法去除非HOVM雜蛋白的效果

圖3 第一步鹽析時不同硫酸銨飽和度對分離HOVM效果的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate concentration on the recovery of HOVM at the first step of salting-out

預(yù)處理所得蛋清溶液與TCA溶液混合，可以除去大部分的非H OVM的蛋白，但仍有雜蛋白（可能是卵清白蛋白和核黃素結(jié)合蛋白）存在，如Lineweaver等[9]在TCA除雜蛋白后，直接用丙酮沉淀法，所得HOVM的純度僅僅為80%左右；Fredericq等[10]在TCA除雜蛋白后，直接用乙醇析出法，所得HOVM的純度也僅達到90%；而史曉霞[18]通過TCA和丙酮兩步沉淀所得到的HOVM制品再通過離子交換層析才能得到純度約為95.3%的樣品。因此在制備更高純度的HOVM樣品過程中，還利用有一步去除雜蛋白的步驟。SDS-PAGE圖譜如圖3A所示，硫酸銨飽和度在30%～70%，沉淀中會有非HOVM的雜蛋白出現(xiàn)，由HPLC檢測圖譜（圖3C）可知硫酸銨飽和度為30%～50%時，隨著硫酸銨飽和度的增加雜蛋白含量降低，但是硫酸銨飽和度不小于60%時，雜蛋白含量隨著硫酸銨飽和度的增加而增高，說明50%的硫酸銨飽和度就能夠較為有效地去除非HOVM的雜蛋白；另一個方面鹽析所得上清液的以及HPLC檢測圖譜也驗證了沉淀中蛋白分布的檢測結(jié)果，SDS-PAGE圖譜中硫酸銨飽和度為30%～70%時，上清液中的非HOVM雜蛋白較少，其中硫酸銨飽和度不小于50%，上清液中幾乎沒有非HOVM的雜蛋白，由HPLC檢測圖譜可知，當(dāng)硫酸銨飽和度為50%時蛋白純度為97.671%，該條件下所得蛋白純度最高。綜合上清液與沉淀中蛋白質(zhì)分布以及純度檢測情況，說明利用一次鹽析除去非HOVM雜蛋白是必要，且該步硫酸銨飽和度可確定為50%。

2.4 第二步鹽析沉淀純化HOVM的效果

圖4 第二步鹽析時不同硫酸銨飽和度對分離HOVM效果的影響Fig.4 Effect of ammonium sulfate concentration on the recoverys of HOVM at the second step of salting-out

圖4A結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銨飽和度在65%～80%范圍內(nèi)，硫酸銨飽和度增加會不斷提高HOVM在沉淀中的產(chǎn)量，而此時上清液中HOVM的存在量不斷減少，其中硫酸銨飽和度為80%時，上清液中幾乎沒有蛋白，說明此飽和度條件下HOVM蛋白基本都轉(zhuǎn)入到沉淀中了，進一步提高飽和度至100%時，所得沉淀與上清液的電泳結(jié)果與硫酸銨飽和度80%所得結(jié)果幾乎無差別，由HPLC檢測圖譜中可知，硫酸銨飽和度為65%～80%時，隨著硫酸銨飽和度的增加，蛋白純度逐漸增高，但當(dāng)硫酸銨飽和度由80%增至100%時，與硫酸銨飽和度80%時相比較蛋白純度有所降低，說明第二步鹽析若追加硫酸銨至飽和度80%就可充分將HOVM蛋白沉淀出來。

圖5 HPLC純度檢測圖譜Fig.5 Purity an alysis of recovered HOVM in comparison to standard from Sigma by HPLC

為了進一步檢驗所得樣品的純度以及樣品是否為HOVM，按照1.3.6節(jié)方法，利用HPLC技術(shù)進行檢測，并與HOVM標(biāo)品進行對比，所得HPLC檢測結(jié)果如圖5所示。HOVM標(biāo)品的保留時間約為7.792 min，而本研究所得HOVM樣品的保留時間為7.662 min，兩者的出峰時間與結(jié)束時間基本一致，可以判斷提取的蛋白為HOVM；另外純度檢測結(jié)果表明，本研究所得HOVM樣品的純度為99.202%，略高于標(biāo)品的純度（99.016%）。并且100 mL蛋清液中可以提取約0.300 g的HOVM，若按照根據(jù)文獻[26]參考值（HOVM占蛋清蛋白的11%），本提取工藝所得HOVM的提取率約為27.05%。

3 結(jié) 論

本研究得出了一種通過三步沉淀法從蛋清中純化得到HOVM純品的工藝路線，具體過程如下：蛋清液預(yù)處理按照體積比為1∶1加入10% TCA溶液（pH 1.15），混勻后用NaOH溶液（1.0 mol/L）調(diào)節(jié)pH值至3.5后經(jīng)兩步鹽析（第1步鹽析硫酸銨飽和度為50%，第2步鹽析硫酸銨飽和度為80%）后得到HOVM樣品。

通過該工藝所得到的HOVM樣品的純度為99.202%，提取率為27.05%。三步沉淀法操作簡單且處理量大，所得HOVM蛋白的純度很高。而如何提高其提取率還有待進一步研究。

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Purification of Hen’s Egg Ovomucoid by Three-Step Precipitation

WANG Shuai1, WU Zi-jian1,*, WANG Su-ying1, LIU Jian-fu1, ZHANG Wei1, TIE Hang1, RONG Qiang2
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China; 2. Cuisine Department, Tianjin Youth Professional Technology Institute, Tianjin 300191, China)

Hen’s egg ovomucoid (HOVM) is the dominant allergenic protein from chicken egg white, and obtaining highpurity HOVM is the prerequisite for understanding its structure and characteristics and reducing its allergenicity. This study presented a three-step precipitation procedure (precipitation with 10% trichloroacetic acid (TCA) followed by two-step fractional precipitation with ammonium sulfate) for purifying HOVM. The purification efficiency was evaluated by SDSPAGE and HPLC. It was found that after most of the protein impurities in the 2-fold diluted egg white were removed by adding 10% TCA, the centrifugal supernatant was added with ammonium sulfate to saturation (50%) for further removal of non-HOVM proteins by salting-out. Finally, additional ammonium sulfate was added to the supernatant fraction until saturation (80%). After centrifugation, the precipitation fraction was dialyzed and freeze-dried to obtain high-purity HOVM product. HPLC analysis (at 220 nm) showed that the purity of the HOVM was 99.202%, with a yiel d of 27.05%.

hen’s egg ovomucoid; three-step precipitation; salting-out

R392.1

A

1002-6630（2014）24-0074-07

10.7506/spkx1002-6630-201424014

2014-06-30

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃面上項目（14JCYBJC30900）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團隊項目（TD12-5049）

王帥（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wswangshuaiws@126.com

*通信作者：吳子健（1973—），男，副教授，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wzjian@tjcu.edu.cn