徐麗青，朱雪梅*，熊 華

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

高壓微射流制備巖藻黃素納米乳液的影響因素及其理化分析

徐麗青，朱雪梅*，熊 華

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

采用高壓微射流制備巖藻黃素納米乳液（fucoxanthin nanoemulsion，F(xiàn)CNE），研究均質(zhì)條件、乳化劑類型和質(zhì)量分數(shù)、乳化溫度、助乳化劑（甘油）對FCNE理化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：FCNE粒徑和多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）隨均質(zhì)壓強和次數(shù)的增加而減小，壓強120 MPa、 均質(zhì)4 次后FCNE粒徑基本達到最?。?54 nm，PDI=0.19）。不同乳化劑（吐溫80、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、酪蛋白酸鈉）制備的FCNE粒徑大小為：SDS＜吐溫80＜酪蛋白酸鈉，且隨著乳化劑質(zhì)量分數(shù)和乳化溫度的升高，F(xiàn)CNE粒徑顯著減?。≒＜0.05）。此外，添加不同質(zhì)量分數(shù)的甘油后，吐溫80和SDS制備的FCNE粒徑顯著減小（P＜0.05），而酪蛋白酸鈉制備的FCNE粒徑變化較小，表明SDS和吐溫80制備的FCNE比酪蛋白酸鈉制備的FCNE對水相 黏度變化更敏感。在不同的pH值條件下，吐溫80制備的FCNE可穩(wěn)定存在，表面電荷基本不變；而SDS和酪蛋白酸鈉制備的FCNE在酸性條件下穩(wěn)定性較差，且pH值從7變化至3時，其粒徑變化顯著（P＜0.05）。在37℃條件下儲存30d后，納米乳液中巖藻黃素殘留量明顯高于有機相，表明將巖藻黃素制成FCNE顯著提高了巖藻黃素的儲存穩(wěn)定性。

巖藻黃素；納米乳液；高壓微射流；影響因素

巖藻黃素（fucoxanthin）又稱巖藻黃質(zhì)、褐藻黃素，是一種具有共軛雙鍵，且含丙二烯和環(huán)氧烷結(jié)構(gòu)的胡蘿卜素類色素，廣泛存在于各種海帶、裙帶菜、海洋植物、羊棲菜中[1]，約占海帶類胡蘿卜素總量的60%[2]。目前有關(guān)巖藻黃素的研究主要集中在巖藻黃素的提取及其功能特性的分析，諸多生物學(xué)活性如減肥、抗腫瘤、抗高血壓、調(diào)節(jié)血糖等已被證實[3-4]。KKAy小鼠實驗表明攝入巖藻黃素可以使得糖尿病小鼠體重減輕并且通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子mRNA，有效調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖含量[5]。Hosokawa等[6]研究證明巖藻黃素能使結(jié)腸癌細胞誘導(dǎo)DNA斷裂，使誘導(dǎo)細胞凋亡，從而抑制結(jié)腸癌細胞的增殖。巖藻黃素的良好生物活性使其備受關(guān)注，然而巖藻黃素不溶于水，易受光、熱、高溫、氧氣等因素的影響而發(fā)生氧化降解[7]。這些問題都極大地限制了巖藻黃素在食品、醫(yī)藥以及其他領(lǐng)域的應(yīng)用，如何提高巖藻黃素的穩(wěn)定性和生物利用率是目前面臨的主要問題。

納米乳液是一種液相以液滴形式分散于第2相、粒徑為20～500nm、呈動力學(xué)穩(wěn)定的膠體分散體系[8]。與普通乳液相比，納米乳液具有粒徑小、穩(wěn)定性高、比表面積大等特點，將其作為生物活性脂質(zhì)、藥物、香料、抗氧化物質(zhì)等功能成分的傳輸系統(tǒng)，可以很大程度地改善其水溶性、穩(wěn)定性，提高生物利用率[9-10]。目前制備納米乳液的方法大致可分為低能乳化法和高能乳化法[11-12]，高能乳化法常借用高壓均質(zhì)機、微射流、超聲等設(shè)備提供的高機械能將體系的分散相粒子進行破碎，而低能乳化法多通過轉(zhuǎn)相法制備。高壓微射流作為制備納米乳液的主要方法，能在短時間內(nèi)實現(xiàn)高速撞擊、剪切、氣蝕、瞬時壓降等綜合作用，達到流體的細化、乳化、均質(zhì)，獲得超精細的均一流體[13]，而均質(zhì)條件、乳液組成和連續(xù)相性質(zhì)則是影響納米乳液理化性質(zhì)的主要因素。

本實驗采用高壓微射流制備水包油（油/水）型巖藻黃素納米乳液（fucoxanthin nanoem ulsion，F(xiàn)CNE），研究了均質(zhì)條件、乳化劑類型和質(zhì)量分數(shù)、乳化溫度、助乳化劑（甘油）對FCNE理化性質(zhì)的影響，并考察了FCNE在不同的pH值條件下的穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性，為制備穩(wěn)定均一的FCNE、提高巖藻黃素的穩(wěn)定性和生物利用率提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米油 當?shù)爻?；聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐?0）、酪蛋白酸鈉 上海Aladdin試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國Sigma公司；巖藻黃素（純度≥99.3%） 北京三區(qū)生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Model 101高壓微射流 美國Newton 公司；Ultra Turrax T25高速分散機RCT basic1恒溫攪拌器 德國IKA公司；Nano-ZS90粒度分析儀 英國馬爾文公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；BS 224S型電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FCNE的制備[14]

0.02 %（質(zhì)量分數(shù)，下同）巖藻黃素溶于10%玉米油中，攪拌至充分溶解，然后分別加入不同質(zhì)量分數(shù)（1%～8%）的乳化劑（吐溫80、SDS、酪蛋白酸鈉），預(yù)先混合加熱至不同溫度（25、50、75℃），持續(xù)攪拌加熱40 min，然后用注射器逐滴滴入水相中（水相質(zhì)量分數(shù)82%～89%，pH 7.0）中，混合攪拌1 h后，采用高速分散機以7 500 r/min轉(zhuǎn)速剪切4 min，制備得到粗乳液。粗乳液進一步采用微射流均質(zhì)機通過不同均質(zhì)壓強（30～150 MPa）和均質(zhì)次數(shù)（1～8 次）處理得到FCNE。

1.3.2 制備FCNE的影響因素

1.3.2.1 均質(zhì)條件

吐溫80質(zhì)量分數(shù)1%、乳化溫度25 ℃時制備的粗乳液經(jīng)過微射流均質(zhì)機在30、60、90、120、150 MPa條件下分別處理1、2、3、4、5、6、7、8 次。

1.3.2.2 乳化劑類型和質(zhì)量分數(shù)

乳化劑（吐溫80、SDS、酪蛋白酸鈉）質(zhì)量分數(shù)分別為1%、2%、4%、6%、8%，乳化溫度25℃，制備的粗乳液在120MPa條件下均質(zhì)4 次。

1.3.2.3 乳化溫度

吐溫80質(zhì)量分數(shù)分別為1%和8%，油和乳化劑混合，分別加熱至25、50、75 ℃，持續(xù)攪拌加熱40 min后，滴加至水相中（pH 7.0），制備的粗乳液在120 MPa條件下均質(zhì)4 次。

1.3.2.4 助乳化劑（甘油）質(zhì)量分數(shù)

乳化劑（吐溫80、SDS、酪蛋白酸鈉）質(zhì)量分數(shù)為1%，分別添加質(zhì)量分數(shù)為10%、20%、30%、40%、50%的甘油至水相中，乳化溫度25 ℃，制備的粗乳液在120 MPa條件下均質(zhì)4 次。

1.3.3 FCNE理化性質(zhì)分析

1.3.3.1 粒徑和電位分析[14]

將制備的FCNE用去離子水稀釋100 倍，以避免多重散射的影響，采用激光粒度儀于室溫條件下分析FCNE的粒徑、粒徑分布（多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）、粒徑分布圖）和電位。

1.3.3.2 pH值穩(wěn)定性

乳化劑（吐溫80、SDS、酪蛋白酸鈉）質(zhì)量分數(shù)為1%，將乳化溫度25 ℃、120MPa條件下均質(zhì)4 次制備的FCNE分裝于4 支試管中，分別調(diào)節(jié)pH值至3.0、5.0、7.0、9.0，于室溫條件下密封避光保存5 d后，測定FCNE的電位和粒徑。

1.3.3.3 儲存穩(wěn)定性[15]

以1%吐溫80作為乳化劑、乳化溫度25 ℃、120 MPa條件下均質(zhì)4 次制備的FCNE，與相同質(zhì)量分數(shù)同樣處理方法溶解在正己烷-乙醇（1∶1，V/V）中的巖藻黃素，共同置于37 ℃條件下密封避光保存30 d。每隔5 d定期取樣1 mL，以正己烷-乙醇（1∶1，V/V）萃取FCNE中的巖藻黃素，445 nm波長處分別測定吸光度，以正己烷-乙醇溶液作為空白，根據(jù)巖藻黃素標準曲線計算巖藻黃素殘留量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復(fù)3 次，采用Origin 8.0和S PSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進處理，使用Duncan法比較平均值之間的差異性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 均質(zhì)壓強和次數(shù)對FCNE粒徑的影響

表1 不同均質(zhì)壓強和次數(shù)條件下FCNE粒徑比較Table 1 Size comparison of FCNE under different pressure and homogenization numbers nm

由表1可以看出，粗乳液（粒徑d=9 031 nm）經(jīng)過不同壓強分別均質(zhì)1 次后，粒徑減小至401、295、223、195、182 nm，表明微射流均質(zhì)對粗乳液的粒徑有顯著影響。在同一壓強條件下，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，F(xiàn)CNE粒徑顯著減小（P＜0.05），經(jīng)過4～5 次處理后再增加均質(zhì)次數(shù)，此時FCNE粒徑變化不明顯，這是因為微射流均質(zhì)1 次并不能達到100%的效率，當FCNE多次通過射流閥時，F(xiàn)CNE顆粒受到巨大剪切力、撞擊和空穴效應(yīng)等作用，從而使得FCNE粒徑不斷減小[13]，而FCNE經(jīng)過多次處理后，粒徑基本達到“飽和”[16]，此時增加均質(zhì)次數(shù)不能無限減小FCNE的粒徑。當均質(zhì)次數(shù)一定時，隨著處理壓強的增加，F(xiàn)CNE粒徑顯著減?。≒＜0.05），當壓強達到120MPa后，繼續(xù)增大壓強，F(xiàn)CNE 粒徑變化較小，這與康波等[17]對乳鐵蛋白納米乳液的研究結(jié)果相一致。綜合考慮均質(zhì)壓強和次數(shù)對FCNE的影響，實驗中選取120MPa均質(zhì)4 次制備FCNE。

PDI也是表明乳液穩(wěn)定性的重要參數(shù)，PDI值反映了液滴的尺寸分布，PDI值越小，表明乳液粒度分布越集中。圖1a、b分別是均質(zhì)4 次和壓強為120 MPa時的粒徑分布圖，可以看出隨著處理壓強和次數(shù)的增加，F(xiàn)CNE粒徑分布逐漸變窄，PDI值逐漸減小。

圖1 均質(zhì)壓強（a）和均質(zhì)次數(shù)（b）對FCNE粒徑分布的影響Fig.1 Effect of homogenization pressure (a) and number (b) on droplet size distribution of FCNE

2.2 不同乳化劑類型和質(zhì)量分數(shù)對FCNE粒徑的影響

目前，應(yīng)用于食品中的乳化劑主要包括小分子乳化劑、磷脂、蛋白質(zhì)和多糖等，不同乳化劑對納米乳液的理化性質(zhì)有顯著影響。本實驗考察了3 種不同質(zhì)量分數(shù)的乳化劑對FCNE粒徑的影響。

圖2 乳化劑類型和質(zhì)量分數(shù)對FCNE粒徑的影響Fig.2 Effect of emulsifier type and concentration on droplet diameter of FCNE

圖2 顯示，隨著乳化劑質(zhì)量分數(shù)升高，3 種不同乳化劑（吐溫80、SDS、酪蛋白酸鈉）制備的FCNE粒徑均減小，當乳化劑質(zhì)量分數(shù)達到8%時，F(xiàn)CNE粒徑分別為90、77、185 nm。這是由于乳化劑質(zhì)量分數(shù)較高時，更多的乳化劑分子覆蓋在油分子表面，油/水界面表面積增大，乳化劑吸附速率加快，可防止小液滴間的重新聚合[18]。此外，吐溫80和SDS制備的FCNE粒徑明顯小于酪蛋白酸鈉制備的FCNE，主要原因是吐溫80和SDS為小分子乳化劑，吸附到油/水界面速率快，而酪蛋白酸鈉為大分子乳化劑，吸附速率慢[19]；同時，吐溫80和SDS分子結(jié)構(gòu)較為緊湊，空間位阻作用小，容易在油水界面形成致密的乳化劑層，從而迅速降低界面張力，促進小液滴的形成[20]，因而吐溫80和SDS制備的FCNE粒徑較小?？紤]到實驗結(jié)果和乳化劑的實際添加量，實驗中選取質(zhì)量分數(shù)為1%的吐溫80制備FCNE考察其儲存穩(wěn)定性。

2.3 乳化溫度對FCNE粒徑的影響

圖3 乳化溫度對FCNE粒徑的影響Fig.3 Effect of emulsifying temperature on droplet diameter of FCNE

從圖3可以看出，當吐溫80的質(zhì)量分數(shù)分別為1%和8%時，乳化溫度由25 ℃升高至75 ℃，F(xiàn)CNE粒徑分別由154 nm和90 nm顯著減小至122 nm和73 nm（P＜0.05）。這主要是因為隨著乳化溫度的升高，油相的黏度不斷降低，油/水界面張力顯著下降，有利于乳化過程的進行[21]。同時，乳化溫度升高將導(dǎo)致非離子表面活性劑分子的親水頭部脫水，幾何結(jié)構(gòu)和溶解性發(fā)生變化，進一步減小界面張力，促進乳化和小液滴的形成[22]。此外，乳化溫度過高容易導(dǎo)致巖藻黃素的降解，因而實驗中選取25 ℃制備FCNE。

2.4 添加助乳化劑（甘油）后FCNE粒徑變化

圖4 甘油質(zhì)量分數(shù)對FCNE粒徑的影響Fig.4 Effect of glycerol concentration on droplet size of FCNE

實際生產(chǎn)應(yīng)用中，乳化劑的用量均有一定的限制，為了制備穩(wěn)定的納米乳液，可以添加適當?shù)闹榛瘎?。研究表明添加助乳化劑可顯著改善水相的黏度，直接影響到納米乳液的性質(zhì)[19]。如圖4所示，隨著甘油質(zhì)量分數(shù)的增大，F(xiàn)CNE的粒徑均有所減小?？赡茉蚴歉视唾|(zhì)量分數(shù)的增加導(dǎo)致水相黏度增大，從而增大剪切壓強，使得對液滴作用力增大[23]；其次，黏度增加意味著液滴間碰撞頻率減小，液滴重新聚合的機率減小[24]。此外，甘油分子極性比 水分子小，可以降低界面張力，促進乳化作用，形成均一穩(wěn)定的FCNE[23]。

這種不同質(zhì)量分數(shù)甘油引起的FCNE粒徑變化的差異還可用以下方程來解釋：

式中：A和b為經(jīng)驗常數(shù)；ηc為水相黏度；d為對應(yīng)乳液的粒徑[24]。

當b＞－0.03時，納米乳液粒徑受水相黏度影響較小，而b＜－0.03時，納米乳液粒徑隨黏度增加而明顯減小[25-26]。實驗中，吐溫80、SDS和酪蛋白酸鈉對應(yīng)的b值分別為－0.32、－0.24、－0.029[23,27]，對比三者的b值可以看出，酪蛋白酸鈉制備的FCNE粒徑受水相黏度變化的影響小，而SDS和吐溫80制備的FCNE粒徑受水相影響較大，表明SDS和吐溫80制備的FCNE比酪蛋白酸鈉制備的FCNE對水相黏度變化更敏感，在圖4中則表現(xiàn)為隨甘油質(zhì)量分數(shù)的增大，SDS、吐溫80制備的FCNE粒徑顯著減?。≒＜0.05），而酪蛋白酸鈉制備的FCNE粒徑變化則較小。

2.5 pH值穩(wěn)定性

圖5 不同pH值對FCNE Z-電位的影響Fig.5 Effect of pH on droplet charge (Z-potential) of FCNE

如圖5所示，當pH值在3～9范圍內(nèi)時，吐溫80制備的FCNE電位變化較小，這主要是因為吐溫80為非離子型乳化劑，受pH值影響較小[28]。而SDS為陰離子型乳化劑，分子中的OSO3－電離使得FCNE液滴表面帶負電荷，當pH值由3增大至9時，Z-電位相應(yīng)從－12.1mV顯著降低至－66.9 mV（P＜0.05），這與Yang Ying等[29]采用陰離子乳化劑制備納米乳液的研究結(jié)果一致。酪蛋白酸鈉屬于兩性離子型乳化劑，等電點約為pH 4.6，當pH＜4.6時，NH3+使得FCNE液滴表面帶正電荷；相反，當pH＞4.6時，COO－使得FCNE液滴表面帶負電荷，當pH 4.6時，F(xiàn)CNE液滴表面電荷基本為零。對圖5中的Z-電位進行分析可知，SDS和酪蛋白酸鈉制備的FCNE易受pH值的影響，而吐溫80制備的FCNE在不同pH值條件下較穩(wěn)定。從表2可以更加明顯地看出，在不同的pH值條件下，吐溫80制備的FCNE粒徑基本保持不變，而SDS和酪蛋白酸鈉制備的FCNE在由中性（pH 7）變?yōu)樗嵝裕╬H 3）時粒徑變化顯著（P＜0.05）。

表2 不同pH值條件下的FCNE粒徑Table 2 Droplet diameters of FCNE at different pH conditions nm

2.6 儲存穩(wěn)定性

圖6 FCNE的儲存穩(wěn)定性Fig.6 Storage stability of FCNE

圖6A為納米乳液包覆的巖藻黃素與同質(zhì)量濃度的溶解在有機溶劑中的巖藻黃素在37 ℃條件下儲存，巖藻黃素殘留量隨時間的變化趨勢。從圖6A可以看出，溶于有機溶劑中的巖藻黃素含量隨儲存時間的延長迅速降低，儲存20 d后，巖藻黃素殘留量僅為5%，25 d后，巖藻黃素殘留量為零。相比之下，納米乳液包覆的巖藻黃素降解緩慢，由初始狀態(tài)（93%，均質(zhì)導(dǎo)致的少量損失）儲存30 d后殘留的巖藻黃素仍處在較高水平，為32%。對比儲存過程中的顏色變化則更加明顯，如圖6B所示，可以看出，儲存30d后，溶于有機溶劑的巖藻黃素基本變?yōu)闊o色，主要原因是巖藻黃素不穩(wěn)定，對溫度較為敏感，易發(fā)生降解，而納米乳液包覆的巖藻黃素由棕紅色變?yōu)闇\黃色（圖中未顯示顏色），表明將巖藻黃素制成FCNE后，穩(wěn)定性顯著增強。

3 結(jié) 論

本研究采用高壓微射流制備油/水型FCNE并研究了均質(zhì)條件（壓強、均質(zhì)次數(shù)）、乳化劑類型和質(zhì)量分數(shù)、乳化溫度、助乳化劑（甘油）對FCNE理化性質(zhì)影響。研究結(jié)果表明：增大均質(zhì)壓強和均質(zhì)次數(shù)有利于減小FCNE粒徑，形成均一穩(wěn)定的FCNE；適當升高乳化溫度可減小乳液黏度及油/水界面張力，從而加速乳化進程；小分子乳化劑如SDS和吐溫80制備的FCNE比大分子乳化劑（酪蛋白酸鈉）制備的FCNE粒徑更?。⊿DS＜吐溫80＜酪蛋白酸鈉），主要是因為小分子乳化劑吸附油水界面的速率更快；不同質(zhì)量分數(shù)的助乳化劑（甘油）加入到連續(xù)相中可以減小FCNE粒徑，因而在乳化劑用量受到限制時，可適當添加助乳化劑。添加不同質(zhì)量分數(shù)的甘油后，吐溫80和SDS制備的FCNE粒徑顯著減小，而酪蛋白酸鈉制備的FCNE粒徑變化較小，表明SDS和吐溫80制備的FCNE比酪蛋白酸鈉制備的FCNE對水相黏度變化更敏感。此外，吐溫80（非離子型乳化劑）制備的FCNE可在酸堿條件下穩(wěn)定，而SDS（陰離子型乳化劑）和酪蛋白酸鈉（兩性型乳化劑）制備的FCNE對pH值變化較為敏感，因而采用非離子型乳化劑制備的FCNE具有較好的pH值穩(wěn)定性，可適應(yīng)消化道（如胃和小腸）內(nèi)的不同pH值環(huán)境。實驗中的FCNE在37 ℃條件下儲存30 d后，殘留的巖藻黃素明顯高于溶解在有機相中的巖藻黃素，表明納米乳液可以顯著提高巖藻黃素的儲存穩(wěn)定性。高壓微射流作為一種綠色安全的物理手段，將巖藻黃素制成FCNE，對制備巖藻黃素新劑型，提高 巖藻黃素的穩(wěn)定性及生物利用 率具有積極意義。

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Preparation of Fucoxanthin Nanoemulsion Using High-pressure Homogenization: Factors Affecting Droplet Size

XU Li-qing, ZHU Xue-mei*, XIONG Hua
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Using high-pressure homogenization, we have examined the effects of different homogenization conditions such as emulsifier t ype and concentration, temperature and co-emulsifier on the physicochemical properties of fucoxanthin nanoemulsion (FCNE). The results showed that the droplet diameter decreased with increasing homogenization pressure and number. The minimum droplet diameter (154 nm, PDI = 0.19) could be produced after 4 consecutive treatments at 120 MPa. The droplet diameter also depended strongly on emulsifier type: SDS < Tween 80 < sodium caseinate, and decreased with emulsifier concentration and holding temperature (P < 0.05). For Tween 80 and SDS stabilized FCNEs, the droplet size decreased appreciably with glycerol concentration, while changed little for the sodium caseinate stabilized one, indicating that Tween 80 and SDS stabilized FCNEs were more sensitive to viscosity than sodium caseinate stabilized FCNE. The electrical charge and droplet diameter were constant at different pH conditi ons for Tween 80 stabilized FCNE, while SDS and sodium caseinate stabilized ones underwent great changes both in charge and diameter at acid conditions (P < 0.05). After storage at 37 ℃ for 30 days, the amount of residual fucoxant hin was higher in FCNE than in organic phase, suggesting FCNE could enhance the stability of fucoxanthin obviously.

fucoxanthin; nanoemulsion; high-pressure microfluidization; factor

TS201.1

A

1002-6630（2014）24-0045-06

10.7506/spkx1002-6630-201424009

2014-06-11

“十二五”國家科技計劃農(nóng)村領(lǐng)域課題（2013AA102203-05）；留學(xué)回國人員科研啟動基金項目（教外司留20130693）

徐麗青（1988—），女，碩士研究生，主要從事納米乳液研究。E-mail：xuliqing134@126.com

*通信作者：朱雪梅（1982—），女，講師，博士，主要從事功能性油脂和油脂化學(xué)研究。E-mail：zhuxuemei2005@gmail.com