羅 偉,段振華,*,劉小兵
(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南 ???570228;2.海南椰島(集團(tuán))股份有限公司,海南 ???570105)
貽貝煮汁酶解液美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化及其產(chǎn)物氨基酸組成分析
羅 偉1,段振華1,*,劉小兵2
(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南 ???570228;2.海南椰島(集團(tuán))股份有限公司,海南 ???570105)
為提高對貽貝副產(chǎn)物的利用,以木瓜蛋白酶水解貽貝煮汁得到的酶解液為原料,經(jīng)聯(lián)合脫腥后進(jìn)行美拉德反應(yīng),以感官評價及褐變程度為指標(biāo),研究影響貽貝煮汁酶解液美拉德反應(yīng)呈味效果的各因素,并通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝條件,以獲得氨基酸態(tài)氮含量高且色澤風(fēng)味好的產(chǎn)物。結(jié)果表明:響應(yīng)面優(yōu)化的美拉德反應(yīng)最佳工藝條件為還原糖添加量3.3%、氨基酸添加量3.1%、加熱時間55 min、初始pH 8.0,經(jīng)高效液相色譜測定,貽貝煮汁液和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中均檢測出17 種氨基酸,在最優(yōu)條件下的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中,總氨基酸及必需氨基酸含量與煮汁液相比,分別增加了315.91%和428.84%??梢?,經(jīng)美拉德反應(yīng)后的產(chǎn)物在營養(yǎng)和風(fēng)味上均優(yōu)于貽貝煮汁液,是研制新型貽貝調(diào)味品的理想原料。
貽貝煮汁液;美拉德反應(yīng);氨基酸;美拉德反應(yīng)產(chǎn)物
貽貝,屬軟體動物門(Mollosca),貽貝科(Mytidea),是一種雙殼類軟體動物[1]。因其體內(nèi)所含豐富的蛋白質(zhì)、必需氨基酸、?;撬?、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)等不飽和脂肪酸[2],素有“海中雞蛋”美稱?,F(xiàn)代研究[3-4]表明,貽貝提取物有抗腫瘤、抗氧化、降血脂及增加機(jī)體免疫力等多種保健功能。但在貽貝生產(chǎn)加工過程中,經(jīng)蒸煮取肉后濾出的煮汁液常被作為廢棄物排放,不僅其中的水溶性營養(yǎng)成分和小分子蛋白質(zhì)得不到有效利用,而且造成環(huán)境污染,降低產(chǎn)品附加值。目前,國內(nèi)外在有關(guān)貽貝肉中提取活性物質(zhì)的研究日益倍增[6-7],關(guān)于高值化利用貽貝副產(chǎn)物,以往研究以水解度和苦味值為指標(biāo),比較了中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù) 合蛋白酶酶解貽貝煮汁的效果,得出了貽貝煮汁液的最佳酶解條件[5]。2009年我國貝類海產(chǎn)品中貽貝總加工量同比2008年增加32.81%,位列海產(chǎn)品加工總量第一[8]。因此,貽貝煮汁液作為一種易得且低值原料為新型貝類調(diào)味品的研發(fā)提供了可能。與傳統(tǒng)海鮮調(diào)味料的生產(chǎn)工藝相比,本研究在利用酶解和發(fā)酵脫腥技術(shù)的基礎(chǔ)上,結(jié)合美拉德反應(yīng)對酶解液進(jìn)行呈色和增香。應(yīng)用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)測定反應(yīng)前后氨基酸[9],并通過優(yōu)化反應(yīng)條件,使得制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物不僅游離氨基酸含量豐富,且具有一定的抗氧化活性,是研制新型貝類調(diào)味品的理想原料[10-11]。
1.1 材料與試劑
貽貝煮汁液(貽貝取肉后的蒸煮液經(jīng)小曲清香酒提純) 海南椰島(集團(tuán))股份有限公司。
木瓜蛋白酶(1.5×105U/g) 廣西杰沃利生物制品有限公司;L-賴氨酸(食品級) 冀州華恒生物科技有限公司;L-精氨酸(食品級) 上海協(xié)和氨基酸有限公司;D-木糖、D-葡萄糖(均為食品級) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
BS124S電子天平 德國Sartorius公司;LabTech EG35B微控?cái)?shù)顯電熱板 蘇州江東精密儀器有限公司; HP2695高效液相色譜系統(tǒng)(配有Waters-2475熒光檢測器) 美國Waters公司;T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠。
1.3 方法
1.3.1 工藝流程
貽貝煮汁液→木瓜蛋白酶水解→酵母發(fā)酵→離心分離→活性炭脫腥→抽濾→美拉德反應(yīng)→測定
操作要點(diǎn):原料貽貝煮汁液酶解方法參照文獻(xiàn)[5];酵母脫腥條件:質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%酵母水溶液、溫度30 ℃、時間60 min;活性炭脫腥條件:粉末狀活性炭占酵母脫腥液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、溫度55 ℃、時間50 min。
1.3.2 指標(biāo)測定
氨基酸態(tài)氮含量:甲醛滴定法[12];褐變:420nm波長處進(jìn)行吸光度測定[13];氨基酸組成:柱前衍生高效液相色譜法[14]。
1.3.3 感官綜合評價
感官綜合評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[15],見表1。
表1 感官綜合評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards of sensory evaluation
1.3.4 HPLC條件
色譜柱為Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱,流動相A為醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液,流動相B為乙腈(色譜純)與高純水混合,流速1.0 mL/min,柱溫37 ℃,檢測波長248 nm。
1.3.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
前期實(shí)驗(yàn)確定,本次實(shí)驗(yàn)條件為反應(yīng)溫度120℃、風(fēng)味添加劑半胱氨酸(Cys)添加量0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),在此基礎(chǔ)上,以氨基酸態(tài)氮含量和褐變程度(A420nm)為指標(biāo),并結(jié)合品評人對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官描述,選擇還原糖(D-葡萄糖與D-木糖質(zhì)量比2∶1)添加量、氨基酸(L-賴氨酸與L-精氨酸質(zhì)量比1∶2)添加量、加熱時間、初始pH值進(jìn)行單因素試驗(yàn)。
1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法優(yōu)化美拉德反應(yīng)工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels used in response surface design
2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 還原糖添加量對美拉德反應(yīng)的影響
圖1 還原糖添加量對美拉德反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of reducing sugar amount on Maillard reaction
表3 還原糖添加量對感官的影響Table 3 Effect of reducing sugar amount on sensory evaluation
在加熱溫度120 ℃基礎(chǔ)上,設(shè)定氨基酸添加量2%、加熱時間60 min、初始pH 8.5,測得還原糖添加量對美拉德產(chǎn)物褐變程度(A420nm)及氨基酸態(tài)氮含量的影響結(jié)果如圖1所示,感官評分及描述如表3所示。
從圖1可以看出,隨還原糖添加量的增加反應(yīng)褐變程度呈遞增趨勢,其中當(dāng)糖添加量處于1%~4%時A420nm上升較快,可見美拉德反應(yīng)進(jìn)行劇烈;但還原糖添加量超過4%時,A420nm上升變緩,可能隨氨基酸不斷被消耗,美拉德反應(yīng)達(dá)到最大程度;隨羰氨縮合反應(yīng)的進(jìn)行,體系中—NH2不斷被消耗,導(dǎo)致其與含氮物質(zhì)的結(jié)合率下降,氨基酸態(tài)氮含量呈遞減趨勢[16]。由表3可以看出,當(dāng)還原糖添加量超過3%后,產(chǎn)物焦糊及苦味變重。原因可能為當(dāng)還原糖添加過量后,反應(yīng)中生成的香味小分子又不斷環(huán)化形成感官不佳的大分子物質(zhì),部分掩蓋香味揮發(fā)性物質(zhì)[17]。綜上所述,選擇3%還原糖添加量進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗(yàn)。
2.1.2 氨基酸添加量對美拉德反應(yīng)的影響
圖2 氨基酸添加量對美拉德反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of amino acid amount in Maillard reaction
表4 氨基酸添加量對感官的影響Table 4 Effect of amino acid amount on sensory evaluation
選取還原糖添加量3%,同時設(shè)定加熱溫度120 ℃、加熱時間60min、初始pH 8.5,測得氨基酸添加量對美拉德產(chǎn)物褐變及氨基酸態(tài)氮含量的影響結(jié)果如圖2所示,感官評分及描述如表4所示。從圖2可看出,隨氨基酸添加量的增大A420nm呈上升趨勢,說明氨基酸不斷參加反應(yīng)生成類黑色素使褐變程度增加;氨基酸態(tài)氮含量隨氨基酸添加量的增加呈緩慢上升趨勢,當(dāng)氨基酸添加量超過4%后,可能由于美拉德反應(yīng)達(dá)到平衡,氨基酸態(tài)氮含量變化不大,這與Seong等[18]研究葡萄糖-谷氨酸模式美拉德反應(yīng)所得出的結(jié)論基本相近。表4顯示,氨基酸添加量超過3%時感官綜合評分下降,所以保證褐變程度在可接受的范圍且吸光度指示的香味中間體積累較多的情況下[19],結(jié)合感官結(jié)果,選擇適宜氨基酸添加量為3%。
2.1.3 加熱時間對美拉德反應(yīng)的影響
圖3 加熱時間對美拉德反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of heating time on Maillard reaction
表5 加熱時間對感官的影響Table 5 Effect of heating time on sensory evaluation
選擇還原糖、氨基酸添加量均為3%,設(shè)定溫度120 ℃、初始pH 8.5,測得加熱時間對美拉德產(chǎn)物褐變程度及氨基酸態(tài)氮的影響結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出,在所選時間范圍(30~70 min)內(nèi),隨加熱時間的延長,A420nm上升呈先快后緩的趨勢。主要因?yàn)榉磻?yīng)初期生成褐色物質(zhì)相對較少,隨反應(yīng)進(jìn)行,體系內(nèi)產(chǎn)物已積累到一定程度,美拉德反應(yīng)逐漸趨向完全[20];由于游離出的氨基酸態(tài)氮不斷參加反應(yīng),其含量隨加熱時間的延長呈下降趨勢,當(dāng)體系內(nèi)反應(yīng)達(dá)到平衡后趨于穩(wěn)定,這一結(jié)果與盧茳虹等[21]的研究結(jié)果相近。從表5的感官評價可看出,當(dāng)反應(yīng)時間超過50 min時,可能由于過量生成的類黑精色素被環(huán)化產(chǎn)生一系列吡嗪、吡啶等含氮雜環(huán)化合物[17],主要產(chǎn)生的焦香味和雜氣掩蓋了貽貝原有的鮮味。綜合考慮褐變程度及氨基酸態(tài)氮含量,選取加熱時間為50 min。
2.1.4 初始pH值對美拉德反應(yīng)的影響
選擇還原糖、氨基酸添加量均為3%、加熱溫度120 ℃、加熱時間50 min,測得初始pH值對美拉德產(chǎn)物褐變及氨基酸態(tài)氮含量的影響結(jié)果如圖4所示,氨基在酸性條件下質(zhì)子化,以—NH3+形式存在,阻礙羰氨縮合[22],導(dǎo)致美拉德反應(yīng)褐變程度不明顯,顏色無顯著變化。從圖4可以看出,偏堿性的環(huán)境有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行,且堿性越高,反應(yīng)越強(qiáng)烈[23];氨基酸態(tài)氮含量在pH值大于8后下降明顯,主要因?yàn)閴A性條件下氨基酸態(tài)氮被游離到體系中參加反應(yīng)[20]。從表6可以看出,堿性條件下當(dāng)pH值超過8.0時,美拉德產(chǎn)物的顏色、香氣、味道均受到不同程度影響,綜合考慮確定pH 8.0作為美拉德反應(yīng)體系的最適初始pH值。
圖4 初始pH值對美拉德反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of original pH on Maillard reaction
表6 初始pH值對感官的影響Table 6 Effect of original pH on sensory evaluation
2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
由表7的綜合評分結(jié)果可以看出,除各因素均在最佳條件下反應(yīng)得到的美拉德產(chǎn)物感官分值較高外,由于因素間交互作用影響,其他試驗(yàn)組感官綜合評分并無明顯變化規(guī)律。考慮到感官指標(biāo)大多采用定性描述,而氨基酸態(tài)氮是醬油等調(diào)味品呈鮮成分的特征指標(biāo),其含量的高低可表示鮮味程度,也反映產(chǎn)品質(zhì)量的好壞[24]。因此,以氨基酸態(tài)氮含量作為主要指標(biāo)對美拉德反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。
利用Design-Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)分析,各因素經(jīng)擬合后,得到關(guān)于氨基酸態(tài)氮含量Y的回歸方程Y=384.44+ 3.81X1-0.52X2+2.66X3-6.92X4-3.68X1X2+5.98X1X3-0.83X1X4+5.00X2X3-3.67X2X4+6.75X3X4-9.18X12-13.32X22-0.38X32-14.44X42。由表8可看出,此模型P<0.000 1說明相應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平。從因素X1、X2、X3、X4對氨基酸態(tài)氮影響看,除方程的一次項(xiàng)X2及二次項(xiàng)X32影響不顯著外,其余因素影響均為極顯著(P<0.01)。通過比較方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小,可以判斷因子影響的主次性。本試驗(yàn)因素間影響順序依次為X4>X1>X3>X2;交互項(xiàng)中除X1X4影響不顯著,其余因素交互作用均為極顯著(P<0.01),且各因素對響應(yīng)值的影響呈二次關(guān)系。
表7 美拉德反應(yīng)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化方案及結(jié)果(n=5)Table 7 Box-Benhnken experimental designs and results (n == 55))
表8 氨基酸態(tài)氮含量回歸模型方差分析表Table 8 Analysis of variance of regression equation
驗(yàn)證模型預(yù)測準(zhǔn)確性,采用最佳美拉德反應(yīng)條件還原糖添加量3.3%、氨基酸添加量3.1%、加熱時間55 min、pH 8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測得氨基酸態(tài)氮含量376.50 mg/100 mL,與模型預(yù)測值389.46mg/100mL基本符合。表明預(yù)測值和真實(shí)值間有較好的擬合性,進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。
2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的氨基酸組成分析
采用柱前衍生高效液相色譜法,以6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯為衍生劑,對優(yōu)化后的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測,氨基酸的組成及含量如表9所示。
表9 氨基酸組成分析Table 9 Amino acid profiles of mussel juice and Maillard reaction products mg/mL
由表9可知,美拉德產(chǎn)物中氨基酸組成與貽貝煮汁原液相同,均檢測出17 種。但各氨基酸含量及氨基酸總量差別明顯,經(jīng)美拉德反應(yīng)后,產(chǎn)物中含有的17 種氨基酸總量為5.149 mg/mL,較原液增加了315.91%;其中必需氨基酸含量占總氨基酸的22.08%,較原液增加了428.84%。產(chǎn)物中谷氨酸和天冬氨酸變化率與煮汁液比較變化顯著;美拉德產(chǎn)物氨基酸組成中的亮氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸相比貽貝煮汁液也有較大提高,這些呈味氨基酸的增加使得產(chǎn)物海鮮味濃郁[25]。此外,從表9可看出,產(chǎn)物中精氨酸的含量最高,占總量的23.75%。由于精氨酸可以控制體內(nèi)細(xì)胞退化、降低血氨、提高免疫力等功能,因此,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可進(jìn)一步用于研發(fā)具有保健功能的新型貽貝調(diào)味品。
1)綜合考慮褐變程度、氨基酸態(tài)氮含量及感官評定,選擇還原糖添加量、氨基酸添加量、加熱時間和反應(yīng)初始pH值進(jìn)行單因素試驗(yàn),通過響應(yīng)面分析法對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在其最佳反應(yīng)條件(還原糖添加量3.3%、氨基酸添加量3.1%、加熱時間55 min、pH 8.0)下,測得氨基酸態(tài)氮含量376.50 mg/100 mL。2)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和貽貝煮汁原液中氨基酸均為17 種,其中氨基酸總量和必需氨基酸較原液分別增加了315.91%和428.84%;經(jīng)美拉德反應(yīng)后的甘氨酸、精氨酸等呈鮮味的氨基酸含量也有較大程度提高。此研究為貽貝副產(chǎn)物綜合利用提供了更好途徑,具有廣闊市場前景。
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Optimization of Maillard Reaction for Enzymatic Hydrolysates from Mussel Juice and Amino Acid Composition Analysis
LUO Wei1, DUAN Zhen-hua1,*, LIU Xiao-bing2
(1. College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Hainan Yedao (Group) Co. Ltd., Haikou 570105, China)
A papain hydrolysate of mussel juice was prepared and deodorized by sequential treatment with yeast followed by activated carbon before subjected to Maillard reaction. The optimization of reaction conditions for higher amino nitrogen contents as well as better color and flavor in Maillard reaction products (MRPs) was carried out using combination of single factor method and response surface methodology based on sensory evaluation and degree of browning. The results showed that the optimum conditions for Maillard reaction were 3.3% of reducing sugar, 3.1% of amino acids, 55 min of heating time, and 8.0 of initial pH. Under these conditions, 17 amino acids were detected in MRPs by high performance liquid chromatography (HPLC), and the contents of total amino acids and essential amino acids revealed an increase by 315.91% and 428.84%, respectively in comparison with mussel juice, suggesting that the nutrition and flavour of the MRPs were better, which therefore could provide an ideal material for developing new condiments.
mussel juice; Maillard reaction; amino acid; Maillard reaction products
TS254.9
A
1002-6630(2014)24-0040-05
10.7506/spkx1002-6630-201424008
2014-06-19
“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAB01B04);海南省科技興海專項(xiàng)(XH201308)
羅偉(1989—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)樗a(chǎn)食品科學(xué)技術(shù)。E-mail:416565119@qq.com
*通信作者:段振華(1965—),男,教授,博士,研究方向?yàn)樗a(chǎn)食品科學(xué)技術(shù)。E-mail:dzh65@126.com