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        小分子物質的非競爭免疫分析方法最新研究進展

        2014-03-08 05:40:26何慶華
        食品科學 2014年15期
        關鍵詞:半抗原復合物抗原

        陳 波,何慶華,許 楊,*

        (1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌 330047;2.南昌大學中德聯(lián)合研究院,江西 南 昌 330047)

        小分子物質的非競爭免疫分析方法最新研究進展

        陳 波1,2,何慶華1,2,許 楊1,2,*

        (1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌 330047;2.南昌大學中德聯(lián)合研究院,江西 南 昌 330047)

        小分子物質(即半抗原)因分子質量小、抗原表位單一,其免疫學分析方法目前多為競爭型,然而非競爭型的分析靈敏度、精確度和線性范圍均優(yōu)于競爭型。本文介紹了近幾年小分子物質的非競爭免疫分析方法的最新研究進展,重點闡述了各 類分析方法的原理、特點及應用,并對小分子物質的非競爭免疫學分析方法的發(fā)展趨勢進行了展望。

        非競爭免疫分析;半抗原;特殊抗體

        小分子物質(如生理激素、農獸藥殘留、生物毒素等)的快速靈敏檢測技術在臨床醫(yī)學診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全控制等領域具有重大意義。近年來,國內外已建立了一系列針對小分子的高靈敏度的儀器檢測方法,如高效液相色譜[1]、氣相色 譜[2]、色譜-質譜聯(lián)用[3]和表面等離子共振[4]等,但該類方法需要較昂貴的儀器設備和專業(yè)操作人員,且樣品常常需要特殊處理,耗時費力?;诳乖贵w特異性結合的免疫分析技術在確保檢測靈敏度的前提下,具有簡便快速、廉價和高通量篩選等優(yōu)點,有利于基層檢測機構的推廣運用,因而成為目前研究熱點之一。

        免疫分析有競爭和非競爭兩種基本形式,應用于小分子物質檢測的主要是競爭分析形式。競爭型免疫分析靈敏度主要受抗原抗體親和力的限制[5],只有當抗體的親和力常數(shù)(Ka)超過1011L/mol才能使檢測限達到飛摩爾水 平,但通過傳統(tǒng)的制備抗體技術親和力常數(shù)很難超過1010L/mol[6]。非競爭型免疫分析理論上比競爭性具有更高靈敏度、精密度和線性范圍[7],被分析物的含量與檢測信號在競爭型免疫分析中呈負相關,而在非競爭型免疫分析中呈正相關,圖1直觀地說明了非競爭型免疫分析在檢測靈敏度方面的優(yōu)越性。雙位點分析已經(jīng)被廣泛應用于蛋白質、多糖等具有多個抗原表位的大分子物質的檢測[8],然而其并不適用于小分子物質,因為小分子物質(即半抗原)不能夠同時提供兩個或兩個以上的表位結合抗體。近20 年,研究者們不斷創(chuàng)新以克服這個困難,已建立了一些非競爭型免疫檢測小分子物質的方法,包括基于化學修飾半抗原[9-10]、特殊分離儀器[11]和特殊抗體等。

        圖1 非競爭型分析和競爭型分析靈敏度的對比[12]Fig.1 The different sensitivities between competitive immunoassay and noncompetitive immunoassay[12]

        本文主要就近年來國內外建立的基于小分子物質非競型爭免疫分析最新研究進展進行了評述,并對其發(fā)展趨勢進行了初步展望。

        1 基于抗獨特型抗體非競爭型檢測小分子

        抗獨特型抗體(anti-idiotype antibody,AId或Ab2)是機體針對抗體可變區(qū)產生的特異性抗體,能夠作為抗原的替代物,因而被稱為抗原分子的“內影像”,可以模擬抗原分子的三維結構。α-AId能夠識別抗體分子上抗原結合位點以外的獨特位,即識別抗體可變區(qū)上的框架區(qū)相關的獨特位,且與半抗原-抗體間的結合互不干擾。而β-AId識別抗體上抗原結合位點,即與抗原分子具有相同的抗原決定簇,能與半抗原分子競爭結合抗體的抗原結合位點。當β-AId與抗體結合形成復合物后,由于空間阻礙的存在,α-AId不能結合β-AId/Ab1復合物。基于抗獨特型抗體,Barnard等[13]建立了血清中雌二醇的非競爭檢測方法,并將這種非競爭檢測模式稱為“Idiometric Assay”如圖2,其檢測信號強度與目標分析物的濃度成正比。Kobayashi等[5]利用磁珠分離與抗獨特型抗體結合檢測11-脫氧皮質醇,最低檢出限達到了70 amol/assay。最近Niwa等[14]將抗皮質醇單克隆抗體與KLH偶聯(lián)免疫小鼠,制備了α-和β-抗獨特型抗體,建立了皮質醇的非競爭型免疫檢測方法,結果表明該方法的靈敏度比傳統(tǒng)競爭型方法提高了3 倍,并具有很好的特異性,適用于尿液中皮質醇的檢測。

        建立基于抗獨特型抗體非競爭型檢測方法需同時制備獲得3 種抗體(抗半抗原抗體Ab1、獨特型抗體α-AId和β-AId),尤其是抗獨特型抗體的篩選和鑒定過程非常復雜,近年這方面的研究很少。不過,近年來不斷發(fā)展的抗體庫技術,為制備和篩選鑒定抗獨特型抗體提供了一條有效的解決途徑[15]。另外,采用商業(yè)化的噬菌體展示肽庫淘選抗原模擬表位,建立無毒競爭檢測小分子已經(jīng)有很多報導[16],但是還未見關于模擬表位肽與抗體結合后是否會對α-AId與抗體的結合產生空間位阻的研究報道。

        圖2 基于抗獨特型抗體的免疫檢測技術基本原理[17]Fig.2 Principle of anti-idiotype antibody based immunoassay[17]

        2 基于抗體可變區(qū)片段非競爭檢測小分子

        Ueda等[18]報道了基于抗體可變區(qū)片段建立的一種新的非競爭免疫檢測方法,即開放夾心式免疫分析(open sandwich immunoassay,OSIA),見圖3,其理 論依據(jù)是游離的VH和VL之間的相互作用是非常微弱的,在低濃度下它們趨向于解離,然而加入相應的抗原后,VH與VL會通過抗原的“橋梁”作用而提高它們間的相互結合的親和力和穩(wěn)定性。OSIA檢測方法已成功應用于赤霉素[19]、苯甲醛[20]、玉米赤霉烯酮[21]、人骨鈣素[22]、雙酚A[23]、11-脫氧皮質醇[24]等小分子物質的檢測,最近,Dong等[25]在OSIA的基礎上,采用了基于噬菌體的實時熒光定量免疫-PCR技術,進一步提高檢測靈敏度,并將這種改進的方法成功應用于人骨鈣素和17β-雌二醇的檢測,最低檢出限分別達到了0.058 ng/mL和9.8 ng/mL。Minami等[26]基于分子印跡技術和開放夾心式理論,建了一種稱為開放夾心分子印跡技術(open-sandwich molecular imprinting,OS-MIP)用于檢測小分子,通過表面等離子共振生物感受器監(jiān)測分子的吸附和解吸。Ihara等[27]建立了一種稱為Micro OS-ELISA的方法檢測人骨鈣素,通過OSIA與微流芯片感受器相結合,檢出限達到了1 ng/mL,整個分析過程只需要12 min。

        開放夾心式免疫分析自其問世以來發(fā)展迅速,開拓了非競爭檢測小分子的另一個新領域。其不再受半抗原分子的大小和基團限制,既能應用于非均相又能應用均相檢測,特別是均相檢測(β-半乳糖苷酶的互補、熒光共振能轉移及生物發(fā)光等相結合[28-32]),完全避免了反復的孵育和洗滌過程,縮短檢測時間。然而只有游離的重鏈和輕鏈抗體可變區(qū)間的相互作用在抗原不存在時非常微 弱,即背景噪音很小,而抗原存在時相互作用顯著增強的條件下,才能應用于此方法且抗體的性質對靈敏度的提高有很大限制,因此OSIA需要高特異性的抗體。噬菌體抗體庫技術因其高庫容等優(yōu)點被視為制備高親和力和特異性抗體的有效途徑,同時近年來發(fā)展的分子定向改造技術也可以降低缺乏抗原時VH和VL之間的相互作用,提高檢測的性噪比。

        圖3 開放夾心免疫檢測小分子原理[33]Fig.3 Open-sandwich enzyme immunoassay for noncompetitive detection of hapten[33]

        3 基于抗異型抗體及抗免疫復合物多肽

        抗異型抗體(anti-metatype antibody)是針對抗原-抗體復合物中抗原與抗體之間形成的特定表位(即異型位點)產生的,所謂異型位點是由于抗原和抗體結合而引起抗體活性位點發(fā)生構象改變而形成的位點??巩愋涂贵w這一性質首先被Ullman等[34]用于建立了一種新的非競爭免疫分析檢測四氫大麻酚,其檢測過程是將抗異型抗體包被于酶標板孔,加入酶標記的抗四氫大麻酚單克隆抗體和待分析物共同孵育30 min,洗滌去除非特異性結合后加入底物液,待分析物的含量與測定的吸光度呈正比。隨后,這種方法被應用于地高辛[35]、血管緊張素Ⅱ[36]和微囊藻毒素[37]的檢測,檢測限分別達到了30、1 pg/mL和2 pg/mL,檢測快速且具有較好的精確度。

        當抗原和抗體結合后,大于85%的抗原可接近表面積被包埋,只有極小部分與抗體形成異型表位,因而制備抗異型抗體特別困難。不過,Gonzalez-Sapienza等[38]研究噬菌體展示多肽庫中篩選得到抗免疫復合物多肽以替代傳統(tǒng)的抗異型抗體,并將此方法稱為噬菌體抗免疫復合物分析法(phage anti-immune complex ass ay,PHAIA),見圖4。該研究小組應用此方法篩選得到了抗草達滅免疫復合物多肽,并建立PHAIA用于非競爭檢測草達滅,檢測限為0.73 ng/mL,其靈敏度是傳統(tǒng)競爭ELISA法的30 倍。苯氧基苯甲酸[39]和廣滅靈[40]的PHAIA檢測方法也先后被他們建立。此外,在PHAIA的基礎上,該課題組結合實時熒光定量PCR(real-time PCR)建立了一種稱為PHAIA-PCR的方法用于檢測苯氧基苯甲酸和草達滅,檢測限分別達到了20 pg/mL、0.2 ng/mL[41]。但是噬菌體是生物 有機體,能夠感染大腸桿菌,且穩(wěn)定性不如普通生物試劑,不利于實際應用。Vanrell等[42]通過化學合成抗草達滅和廣滅靈抗免疫復合物多肽(稱為納米肽適配子),建立了基于納米肽適配子的非競爭檢測草達滅和廣滅靈ELISA方法,最低檢出限分別達到了1.2 ng/mL和3.2 ng/mL,并制備了快速檢測草達滅和廣滅靈的免疫試紙條。

        圖4 抗免疫復合物多肽篩選及檢測基本原理[12]Fig.4 Schematic diagram for the selection of anti-immune complex peptides and the setting up of phage anti-immune complex assay[12]

        利用噬菌體展示多肽庫淘選抗抗原-抗體復合物多肽從而替代抗異型抗體是今后的一個重要發(fā)展趨勢,其篩選與鑒定效率高、制備周期短,而且PHAIA的檢測靈敏度高、特異性強。另外,該方法檢測時無需制備檢測抗原,從而避免了檢測抗原的批間差異的影響和有毒小分子對操作人員的危害,是一種新的綠色免疫分析方法。

        4 結 語

        為了實現(xiàn)醫(yī)學、環(huán)境和食品等中小分子物質快速、靈敏的檢測,建立非競爭免疫檢測方法是一種行之有效的途徑,是今后發(fā)展的主要方向,我國還未見此方面的報導。建立開放夾心式免疫分析需要獲得高特異性抗體,然而目前抗體體外進化技術只能改進抗體親和力,卻不能預測VH和VL之間的相互作用,如果能建立一種既能夠篩選高親和力抗體,又能測定VH與VL間的相互作用的抗體庫,那將為開放夾心式免疫檢測小分子物質提供關鍵的技術支持,已經(jīng)有關于這種抗體庫的研究[43]。

        小分子物質和抗體結合后,小分子物質絕大部分可接近表面積被包埋在抗獨特位,與抗異型抗體相比,多肽呈現(xiàn)更小的結合表面,因此通過淘選能更好控制多肽與抗原結合位點外的其他抗體結構的交叉反應,減小檢測時的信噪比。其次PHAIA不僅適用親水性物質[44],而且適用疏水性物質[45]的檢測,關鍵是取決于半抗原抗體對溶劑的耐受度,特別適合基于膜基質的現(xiàn)場快速檢測。

        膜芯片和免疫傳感器能夠實現(xiàn)高通量,多分析物同時﹑快速檢測,將是今后檢測方法發(fā)展的趨勢。OSIA及抗免疫復合物多肽因其分子質量小,易改造以及修飾,在膜芯片和免疫傳感器方面將具有更高的應用價值。

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        Latest Progress on Noncompetitive Immunoassays for Small Molecules

        CNEN Bo1,2, HE Qing-hua1,2, XU Yang1,2,*
        (1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Sino-Germany Joint Research Institut e, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

        Although competitive immunoassays are currently used more commonly to detect small molecules due to their low molecular weight and single epitope, noncompetitive immunoassays have better specificity, higher sensitivity and broader linear ranges. This review describes the latest progress on various noncompetitive immunoassays for small molecules with emphasis on their principles, characteristics and applications. Furthermore, future developmen t trends are di scussed.

        noncompetitive immunoassay; haptens; specif i c antibody

        TS446.6

        A

        1002-6630(2014)15-0310-04

        10.7506/spkx1002-6630-201415061

        2013-07-10

        國家自然科學基金面上項目(31171696)

        陳波(1987—),男,碩士研究生,研究方向為食品質量與安全。E-mail:nevercb@foxmail.com

        *通信作者:許楊(1951—),女,教授,博士,研究方向為微生物及食品生物技術。E-mail:xuyang1951@126.com

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