王 晶，閆訓友*，王萬雷，朱垣緣，常世民

（廊坊師范學院生命科學學院，河北 廊坊 065000）

阿魏側耳胞外多糖對荷瘤小鼠免疫能力的影響

王 晶，閆訓友*，王萬雷，朱垣緣，常世民

（廊坊師范學院生命科學學院，河北 廊坊 065000）

通過皮下注射小鼠腹水瘤細胞構建荷瘤小鼠模型，灌胃法給藥，采用血液分析儀、細胞培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附等設備和方法測定血液中白細胞和淋巴細胞數(shù)量、腹腔巨噬細胞吞噬能力、脾淋巴細胞增殖能力、免疫器官指數(shù)、血漿中腫瘤壞死因子-α含量等來研究阿魏側耳胞外多糖對荷瘤小鼠免疫功能的調節(jié)作用。結果顯示：與荷瘤對照組相比，灌胃100、200 mg/kg的阿魏側耳胞外多糖可顯著降低荷瘤小鼠瘤體質量（P＜0.05）、提高血液中白細胞和淋巴細胞數(shù)量（P＜0.05）、促進脾淋巴細胞的增殖（P＜0.05），增加免疫器官指數(shù)（P＜0.05）和血漿中腫瘤壞死因子-α的含量（P＜0.05）；灌胃200 mg/kg的阿魏側耳胞外多糖可以顯著增強荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力（P＜0.05）。因此，一定濃度的阿魏側耳胞外多糖可提高荷瘤小鼠的免疫能力。

阿魏側耳；胞外多糖；免疫器官指數(shù)；腫瘤壞死因子-α；脾淋巴細胞

作為自然界中含量最豐富的大分子聚合物之一，多糖廣泛分布于動植物、真菌和細菌中[1]，可通過其特異性識別受體[1-2]發(fā)揮免疫調節(jié)、抗腫瘤等多種功效[3-6]。近年來對于食藥用真菌多糖的分離純化及生物學功能的研究較多，但未見阿魏側耳胞外多糖的免疫調節(jié)作用的相關報道。本實驗自制阿魏側耳胞外多糖，采用皮下注射腫瘤細胞法建立荷瘤小鼠模型，通過測定模型鼠的多項免疫功能指標，探究阿魏側耳胞外多糖對荷瘤小鼠免疫功能的影響作用。

1　材料與方法

1.1材料、實驗動物與試劑

阿魏側耳（Pleurotus ferulae Lanzi）胞外多糖（粗多糖，多糖含量約13.45%），參照閆訓友等[7]方法從阿魏側耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基中制得；雞血紅細胞懸液，參照楊漢民[8]的方法并改進：雞翅下靜脈抽血，適量Alsever’s溶液抗凝，離心，棄上清液和中層淡黃色細胞層（白細胞和血小板），0.85 g/100 mL氯化鈉溶液調節(jié)細胞密度至1×107個/mL，冰箱冷藏備用。

BALB/c小鼠6～8 周齡，雄性，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

S180小鼠腹水瘤細胞購自中國科學院細胞庫；四季青胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司；腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）ELISA檢測試劑盒 上海研謹生物科技有限公司；植物凝集素（phytohaemagg lutinin，PHA） 美國Sigma公司；四甲基偶氮唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Amresco公司；二甲基亞砜索萊寶公司；環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；紅細胞裂解液 上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱、MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 日本SANyO公司；BC-3000Plus全自動血液分析儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；FD-1D-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；ZHJH-C超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；BX50系統(tǒng)顯微鏡、CKX41SF倒置顯微鏡 日本Olympus公司；SunriseTM光吸收酶標儀 瑞士Tecan公司；Milli-Q超純水機 美國Millipore公司；BS-2F振蕩培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1多糖溶液的配制

阿魏側耳胞外多糖分別用0.9 g/100 mL氯化鈉溶液和RPMI-1640培養(yǎng)基溶解，0.22 μm針頭濾器過濾除菌，冰箱中冷藏備用。

1.3.2小鼠腹水瘤細胞S180的培養(yǎng)與傳代

取對數(shù)生長期的S180細胞懸液，離心，吸棄上清液，含體積分數(shù)10%胎牛血清RPMI-1640重懸，以1/2的細胞密度接種至新培養(yǎng)瓶中，置37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1 次，收集對數(shù)生長期的細胞進行皮下接種，構建荷瘤小鼠模型。

1.3.3構建荷瘤小鼠模型及給藥

BALB/c小鼠50 只，適應性飼養(yǎng)3 d后，于右腋皮下接種密度為1×107個/mL的S180小鼠腹水瘤細胞懸液0.1 mL并隨機分為5 組：荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺組、高劑量多糖組、中劑量多糖組、低劑量多糖組。各組小鼠均自由攝食飲水，荷瘤對照組每天灌胃0.9 g/100 mL氯化鈉溶液，環(huán)磷酰胺組隔天腹腔注射25 mg/kg體質量的環(huán)磷酰胺（0.9 g/100 mL氯化鈉溶液配制）；高、中、低劑量阿魏多糖胞外多糖組每天分別灌胃200、100、50 mg/kg體質量的無菌多糖溶液（0.9 g/100 mL氯化鈉溶液配制），連續(xù)15 d。灌胃第15天，準確稱量動物體質量后，腹腔注射雞血紅細胞懸液1 mL，輕揉小鼠腹部，30 min后采血，測定血液中白細胞數(shù)量、淋巴細胞數(shù)量、血漿中TNF-α含量，采血后處死小鼠，剝離腫瘤并稱質量，無菌條件下收集腹腔液、脾臟、胸腺進行腹腔巨噬細胞吞噬功能、免疫器官指數(shù)、脾淋巴細胞增殖能力測定。

1.3.4白細胞和淋巴細胞數(shù)量測定

眼底取血，肝素鈉抗凝血，全自動血液分析儀測定各實驗組小鼠血液中白細胞和淋巴細胞數(shù)量[9-10]。

1.3.5血漿TNF-α含量測定

取部分血液，3 000 r/min離心20 min，取上清液，按照試劑盒說明，采用雙抗體夾心法測定血漿中TNF-α含量，即酶標板分設為標準孔、空白孔和待測樣品孔，標準孔依次加質量濃度分別為480、320、160、80、40 ng/L的標準品溶液50 μL，空白孔加標準品稀釋液50 μL，樣品孔加樣品稀釋液40 μL和各待測樣品10 μL，37 ℃ 溫育30 min，棄液體，甩干，洗滌液洗板，重復5 次，拍干。除空白孔外每孔加酶標試劑50 μL，37 ℃ 溫育30 min，同樣操作洗板5 次后拍干，添加顯色劑A 、B 各50 μL，輕震混勻，37 ℃避光顯色15 min，再加50 μL終止液終止反應。以空白孔調零，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度A450nm，根據(jù)濃度標準曲線計算血漿中TNF-α含量。

1.3.6腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定——雞血紅細胞吞噬法[8,11]

頸椎脫臼法處死小鼠，75%乙醇浸泡處理2 次，超凈工作臺中無菌收集腹腔液，滴于潔凈的載玻片上，37 ℃濕盒中孵育30 min，漂洗去未貼附的細胞，甲醇固定10 min，吉姆薩（Giemsa）染液染色10 min，流水沖洗，甘油封片，鏡檢并統(tǒng)計細胞數(shù)量，以吞噬雞血紅細胞的腹腔巨噬細胞數(shù)量和腹腔巨噬細胞總數(shù)的比值表示小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率（%）。

1.3.7免疫器官指數(shù)測定[12]

超凈工作臺中無菌取胸腺和脾臟，去除脂肪和結締組織，無菌稱濕質量，以胸腺或脾臟質量（g）和動物體質量（g）的比值表示小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

1.3.8脾淋巴細胞增殖能力測定[13]

取上述無菌稱質量后的脾臟，經75%乙醇處理，無菌磷酸緩沖溶液漂洗后，機械法分散[14]，200目銅網過濾制備脾細胞懸液，紅細胞裂解液常規(guī)方法裂解紅細胞，1 000 r/min離心10 min，RPMI-l640完全培養(yǎng)基（含10%體積分數(shù)胎牛血清）洗滌，離心，RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸，臺盼藍染色，細胞計數(shù)，調整細胞密度為1×106個/mL，接種至96 孔培養(yǎng)板中，每孔180 μL，靜置0.5 h，每孔吸棄5 μL培養(yǎng)上清，同時添加5 μL終質量濃度為100 μg/mL的PHA，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中反應4 h，離心，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩混勻，酶標儀檢測570 nm波長處吸光度A570nm，作為脾淋巴細胞增殖的指標。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2　結果與分析

2.1阿魏側耳胞外多糖對荷瘤小鼠血液中白細胞和淋巴數(shù)量影響

血液中白細胞和淋巴細胞的數(shù)量在一定程度上反映機體的免疫能力[15-16]。如表1所示，中劑量多糖組和高劑量多糖組小鼠血液中白細胞數(shù)量和淋巴細胞數(shù)量均明顯增加（P＜0.05）。而環(huán)磷酰胺處理則顯著降低了小鼠血液中白細胞數(shù)量和淋巴細胞數(shù)量（P＜0.05）。

表1　阿魏側耳胞外多糖對荷瘤小鼠腹腔白細胞和淋巴細胞數(shù)量的影響Table 1 Modulation of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus　feruullaaee Lanzi on the numbers of leukocytes and lymphocytes in the blood of tumor-bearing mice

表1　阿魏側耳胞外多糖對荷瘤小鼠腹腔白細胞和淋巴細胞數(shù)量的影響Table 1 Modulation of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus　feruullaaee Lanzi on the numbers of leukocytes and lymphocytes in the blood of tumor-bearing mice

注：*.與荷瘤對照組相比，差異顯著（P＜0.05）。下同。

組別給藥劑量/（mg/kg）白細胞數(shù)量/（109個/mL）淋巴細胞數(shù)量/（109個/mL）荷瘤對照組03.43±0.06 1.20±0.16環(huán)磷酰胺組252.33±0.06*0.51±0.21*低劑量多糖組503.80±0.36 1.23±0.15中劑量多糖組1005.40±0.17*1.94±0.19*高劑量多糖組2004.87±0.23*1.76±0.22*

2.2阿魏側耳胞外多糖對荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力影響

表2　阿魏側耳胞外多糖對荷瘤小鼠部分免疫功能指標的影響Table 2 Modulation of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi on indices of immune function of tumor-bearing miiccee

表2　阿魏側耳胞外多糖對荷瘤小鼠部分免疫功能指標的影響Table 2 Modulation of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi on indices of immune function of tumor-bearing miiccee

血漿中TNF-α含量/（μg/L）荷瘤對照組035.07±1.691.48±0.448.20±0.860.245±0.0161.59±0.02環(huán)磷酰胺組2528.60±2.16 *0.25±0.07*5.76±0.90*0.197±0.017*1.36±0.06*低劑量多糖組5035.68±1.161.84±0.598.72±0.710.275±0.0211.61±0.11中劑量多糖組10037.83±3.062.31±0.36*11.67±1.92*0.307±0.012*1.73±0.08*高劑量多糖組20040.40±2.53*2.85±0.70*9.85±0.72*0.295±0.011*1.81±0.13*組別給藥劑量/（mg/kg）腹腔巨噬細胞吞噬百分率/%胸腺指數(shù)（×10-3）脾臟指數(shù)（×10-3）脾淋巴細胞數(shù)（A570nm）

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，通過吞噬作用發(fā)揮細胞免疫防御功能，活化后的巨噬細胞吞噬功能顯著增強[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，高劑量多糖可明顯增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力（P＜0.05）（表2），環(huán)磷酰胺則顯著降低了小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力（P＜0.05），中劑量和低劑量多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力無明顯影響。表明高劑量的阿魏側耳胞外多糖可活化巨噬細胞，增強其吞噬外源細胞或異物的能力，提高小鼠的細胞免疫功能。

2.3阿魏側耳胞外多糖對荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)和脾淋巴細胞增殖能力影響

脾臟和胸腺是機體重要的免疫器官，在獲得性免疫應答中發(fā)揮重要作用。由表2可知，與荷瘤對照組相比，中劑量多糖和高劑量多糖均可不同程度地促進小鼠胸腺和脾臟兩種免疫器官質量的增加，提高小鼠的胸腺指數(shù)（P＜0.05）和脾臟指數(shù)（P＜0.05），低劑量多糖對小鼠的免疫器官指數(shù)無顯著影響（P＞0.05）；環(huán)磷酰胺則明顯降低小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)（P＜0.05），其中對胸腺的影響更為顯著。

無菌分離的脾淋巴細胞體外培養(yǎng)的實驗表明，低劑量多糖和高劑量多糖均可顯著增強小鼠脾淋巴細胞的增殖能力（P＜0.05）（表2）；低劑量多糖對小鼠脾淋巴細胞的增殖無明顯影響（P＞0.05）；而環(huán)磷酰胺則削弱了小鼠脾淋巴細胞的增殖能力（P＜0.05）（表2）。表明一定劑量的阿魏側耳胞外多糖可能通過增強淋巴細胞的增殖能力和巨噬細胞的吞噬能力，提高血液中白細胞和淋巴細胞數(shù)量，增加胸腺和脾臟的質量，進而增強機體免疫能力；而環(huán)磷酰胺則可能通過誘導模型鼠體內淋巴細胞凋亡，降低血液中白細胞和淋巴細胞數(shù)量，引起胸腺和脾臟的退化，在一定程度上抑制了機體免疫能力[18]。

2.4阿魏側耳胞外多糖對小鼠血漿中TNF-α含量影響

TNF-α是由單核細胞、巨噬細胞或淋巴細胞分泌產生的一種多效細胞因子，在炎癥反應、免疫調節(jié)、抗腫瘤等方面起重要作用[19]。由表2得知，中劑量多糖和高劑量多糖可顯著增加小鼠血漿中TNF-α含量（P＜0.05），表明灌胃一定劑量的阿魏側耳胞外多糖可提高小鼠免疫能力。環(huán)磷酰胺則明顯降低小鼠血漿中TNF-α含量（P＜0.05），從而降低了機體免疫能力[18]。

2.5阿魏側耳胞外多糖對小鼠S180實體瘤生長的影響

表3　阿魏側耳胞外多糖對小鼠S180實體瘤生長的影響Table 3 Modulation of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus　feruullaaee Lanzi on the growth of implanted S180 tumor in mice

表3　阿魏側耳胞外多糖對小鼠S180實體瘤生長的影響Table 3 Modulation of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus　feruullaaee Lanzi on the growth of implanted S180 tumor in mice

組別給藥劑量/（mg/kg體質量）瘤體質量/g荷瘤對照組01.43±0.33環(huán)磷酰胺組250.33±0.09*低劑量多糖組501.27±0.20中劑量多糖組1000.93±0.30*高劑量多糖組2000.88±0.27*

由表3可知，與荷瘤對照組相比，中劑量多糖組、高劑量多糖組和環(huán)磷酰胺組小鼠S180實體瘤的質量均明顯降低，表明中劑量和高劑量阿魏側耳多糖對小鼠S180實體瘤的生長具有一定的抑制作用，結合前述實驗結果，推測中劑量和高劑量阿魏側耳胞外多糖通過提高機體巨噬細胞吞噬能力和血液中的TNF-α含量等多種免疫能力，進而增強機體的抗腫瘤能力，抑制模型鼠S180實體瘤的生長，降低S180實體瘤的質量。

3　結 論

作為“食用菌皇后”，阿魏側耳具有不可忽視的藥用價值[20]，但目前對于阿魏側耳胞外多糖的研究多集中于多糖的制備及理化性質方面[7,21]，關于生物學活性的研究較少。本實驗利用從阿魏側耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基中制備的胞外粗多糖，采用皮下注射小鼠腹水瘤細胞法建立荷瘤小鼠模型，以抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺作為免疫抑制物參照，研究阿魏側耳胞外粗多糖對荷瘤小鼠免疫功能的影響。實驗結果表明，一定灌胃劑量（100、200 mg/kg）的阿魏側耳胞外粗多糖可通過增加小鼠血液中白細胞、淋巴細胞數(shù)量和TNF-α含量、增強腹腔巨噬細胞的吞噬能力（200 mg/kg），提高脾淋巴細胞的增殖能力從而增加小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，增強荷瘤小鼠的免疫能力，降低模型鼠S180實體瘤的質量，而低劑量（50 mg/kg）胞外多糖對實驗測定的各種免疫功能指標無明顯影響作用，這與鄧春生等[22]的研究結論相似，因此，從阿魏側耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基中獲得的胞外多糖在一定的灌胃劑量下具有增強荷瘤小鼠免疫能力的功效。

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Effect of Extracellular Polysaccharides Produced by Pleurotus ferulae Lanzi on Immune Function of Tumor-Bearing Mice

WANG Jing, YAN Xun-you*, WANG Wan-lei, ZHU Yuan-yuan, CHANG Shi-min
(College of Life Sciences, Langfang Normal University, Langfang 065000, China)

To investigate the immunoregulatory effect of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi immune in tumor-bearing mice, tumor-bearing mice were developed by subcutaneous injection of murine sarcoma S180 and intragastric administration. The numbers of leukocytes and lymphocytes in blood, peritoneal macrophage phagocytic activities,splenic lymphocyte proliferation, immune organ weight indexesand tumor necrosis factor-α (TNF-α) level in blood plasma were examined with an automatic blood analyzer, cell culture in vitro and enzyme-linked immunosorbent assay, respectively. The results showed that extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi at the concentrations of 100 and 200 mg/kg caused a significant reduction in the weight of tumor (P ＜ 0.05) and a significant increase in the numbers of leukocytes and lymphocytes in blood (P ＜ 0.05), the weight indexes of spleen and thymus gland (P ＜ 0.05) and the concentration of TNF-α in blood plasma (P ＜ 0.05), and also significantly enhanced the proliferation capacity of splenic lymphocytes (P ＜ 0.05); while phagocytic activities of murine peritoneal macrophages were significantly enhanced by the extracellular polysaccharides at the concentration of 200 mg/kg (P ＜ 0.05). Thus, the immune function of tumor-bearing mice could be improved by extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi at a certain concentration.

Pleurotus ferulae Lanzi; extracellular polysaccharides; immune organ indexes; tumor necrosis factor-α; splenic lymphocytes

Q946.3；Q952.6

A

1002-6630（2014）15-0268-04

10.7506/spkx1002-6630-201415054

2013-12-12

廊坊市科學技術研究與發(fā)展計劃項目（2011012003）；廊坊師范學院博士基金項目（LSZB201105）

王晶（1983—），女，講師，博士，研究方向為動物細胞工程和生物活性物質。E-mail：oucflora@163.com

*通信作者：閆訓友（1978—），男，副教授，碩士，研究方向為真菌活性物質提取。E-mail：yanxunyou@163. com