張召鋒，顧嬌嬌，鮑 雷，蔡夏夏，李 勇*（北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，食品安全毒理學(xué)研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191）

α-硫辛酸和乙酰左旋肉堿改善炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)胰島細(xì)胞功能障礙的作用

張召鋒，顧嬌嬌，鮑 雷，蔡夏夏，李 勇*
（北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，食品安全毒理學(xué)研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191）

目的：探討α-硫辛酸（α-lipoic acid，LA）和乙酰左旋肉堿（acetyl-L-carnitine，ALC）改善炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)胰島細(xì)胞功能障礙的效果并探討機(jī)制。方法：大鼠胰島素瘤RIN-m5f細(xì)胞用腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）聯(lián)合作用（TII）48 h造成損傷模型。LA和ALC干預(yù)48 h后噻唑藍(lán)法檢測胰島細(xì)胞的活力情況，熒光細(xì)胞技術(shù)法檢測細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）表達(dá)水平，放射免疫法檢測胰島素分泌情況，Western blotting檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)和胰島素分泌相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：TII作用48 h可使RIN-m5f細(xì)胞活力明顯下降，凋亡增加；并降低基礎(chǔ)狀態(tài)下和高糖刺激狀態(tài)下胰島素分泌水平；增加ROS水平，增加一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性，增加一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）水平，促進(jìn)NF-κB向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位；TII還可增加RIN-m5f細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白I-κB、Bcl-2表達(dá)，增加線粒體細(xì)胞色素c釋放。而LA、ALC可改善TII誘導(dǎo)的RIN-m5f細(xì)胞凋亡，提高基礎(chǔ)狀態(tài)和高糖刺激狀態(tài)下胰島素分泌水平；抑制NF-κB向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位、降低細(xì)胞NO水平；降低Bax、Caspase-3表達(dá)，增加抗凋亡蛋白I-κB、Bcl-2表達(dá)，抑制線粒體細(xì)胞色素c釋放；LA與ALC聯(lián)合作用效果強(qiáng)于單獨(dú)作用。結(jié)論：炎癥細(xì)胞因子作用48 h可通過ROS-cytochrome c-NF-κB-NOS-NO通路最終引起胰島β細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響胰島素分泌；LA和ALC聯(lián)用可抑制炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島素分泌。

炎癥細(xì)胞因子；胰島細(xì)胞功能障礙；α-硫辛酸；乙酰左旋肉堿

研究證實，不論是1型還是2型糖尿病，動物和人群體內(nèi)均存在炎癥細(xì)胞因子的過度表達(dá)，在糖尿病發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用，其中影響最大的3 種炎癥細(xì)胞因子是腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）[1-3]。已證實目前臨床上的降糖藥物 （格列酮類、α-糖苷酶抑制劑）均有一定抗炎作用，能部分改善胰島細(xì)胞功能，但其毒副作用較大；而天然藥物具有作用持久、緩和、毒副作用小、從整體水平上防治和治療糖尿病等特點。α-硫辛酸（α-lipoic acid，LA）屬于類維生素物質(zhì)，是線粒體脫氫酶的天然輔助因子，能清除除超氧陰離子自由基（O2-·）、羧自由基（ROO·）以外的其他自由基和活性氧，從而發(fā)揮抗氧化作用，已在糖尿病治療研究中取得了較大進(jìn)展[4-5]。乙酰左旋肉堿（acetyl-L-carnitine，ALC）是L-肉堿的一種天然形態(tài)，存在于體內(nèi)的一種自然物質(zhì)，尤其在肌肉、大腦及精子中含量特別豐富。ALC能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體內(nèi)酰基比率，將短鏈脂肪?；鶑木€粒體膜內(nèi)運(yùn)到膜外，維持機(jī)體生理平衡[6]。研究表明，LA和ALC聯(lián)用對油酸處理的胰島MIN6細(xì)胞有一定的保護(hù)作用[7]。然而ALC單獨(dú)作用或與LA聯(lián)合作用對炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的胰島細(xì)胞功能障礙是否有效果還未見報道。因此本實驗擬通過大鼠胰島素瘤RIN-m5f細(xì)胞的培養(yǎng)，探討采用LA、ALC干預(yù)對炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)胰島細(xì)胞功能障礙的作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠胰島素瘤RIN-m5f細(xì)胞株由北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系周春燕教授惠贈。

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；anti-β-actin、anti-Bcl-2、anti-Bax、anti-NF-κB、anti-I-κB、anti-Caspase-3、anticytochorome c抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 美國Santa Cruz公司；IFN-γ、IL-1β、TNF-α 美國Peprotech公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒 北京普利萊基因技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、LA、ALC美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱 日本SANyO公司；CK40-SL倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Bio-Rad 550型酶聯(lián)免疫檢測儀、蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移裝置 美國Bio-Rad公司；UV762型分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Adventurer? 通用型分析天平 美國OHAUS公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠RIN-m5f胰島素瘤細(xì)胞用含10% FBS及2 mol/L谷氨酰胺的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱（5% CO2，37 ℃）中孵育。待細(xì)胞生長至約80%融合，將其用含0.2% FBS的DMEM培養(yǎng)基饑餓過夜，各種不同因素處理細(xì)胞。

1.3.2 實驗分組

分為5組：1）正常對照組：胰島細(xì)胞不作任何處理；2）炎性細(xì)胞因子損傷組：1000 U/mL IFN-γ+ 2 ng/mL IL-1β+10 ng/mL TNF-α組（簡稱TII組）；3）LA干預(yù)組（1、10、100 μmol/L）；4）ALC干預(yù)組（1、10、100 μmol/L）；5）LA+ALC聯(lián)合干預(yù)組（10 μmol/L LA+10 μmol/L ALC；100 μmol/L LA+100 μmol/L ALC）。LA、ALC分別預(yù)處理2 h，細(xì)胞培養(yǎng)48 h。

1.3.3 MTT比色法檢測細(xì)胞活力

在各種因素處理后，將10 μL的MTT儲備液（5 mg/mL）加到每孔，然后將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)4 h。孵育結(jié)束后，棄去各孔培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，振蕩均勻后，在570 nm波長處測定吸光度。每組有6 個復(fù)孔，以無細(xì)胞孔的吸光度作為空白本底，計算各組細(xì)胞的抑制率。

1.3.4 熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞以50%～80%密度接種于事先放入爬片的6 孔培養(yǎng)板中，經(jīng)過相應(yīng)處理后，去除上清用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛0.5 mL重懸細(xì)胞，4℃過夜；PBS洗滌2 次，每次3 min；加入0.5 mL Hoechst 33258染色5 min；用PBS洗滌2次，每次3 min，滴加一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，使細(xì)胞接觸封片液，熒光顯微鏡檢測呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長在350 nm左右，發(fā)射波長在460 nm左右。

1.3.5 基礎(chǔ)胰島素檢測和胰島素釋放實驗

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的RIN-m5f胰島細(xì)胞以104/孔密度接種于96 孔板，經(jīng)相應(yīng)處理48 h后，去除培養(yǎng)基，用含2.8、17.6 mmol/L葡萄糖的無酚紅培養(yǎng)基200 μL分別刺激1 h后，收集細(xì)胞上清液，用I125胰島素放射免疫分析藥盒檢測基礎(chǔ)狀態(tài)下和高糖狀態(tài)下胰島素釋放水平。

1.3.6 細(xì)胞NO的檢測

各種因素處理后，收集細(xì)胞上清液，用NO測定試劑盒檢測NO水平，同時各實驗組進(jìn)行蛋白定量，結(jié)果以各組NO濃度/蛋白含量比值表示，具體方法：按50 μL/孔，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品。樣品為細(xì)胞裂解液，各孔加入室溫Griess ReagentⅠ 50 μL/孔；按50 μL/孔，各孔加入室溫Griess Reagent Ⅱ；540 nm波長處測定吸光度。

1.3.7 細(xì)胞NOS的檢測

細(xì)胞經(jīng)刺激后，吸盡培養(yǎng)液，加入100 μL NOS檢測緩沖液，再加入100 μL檢測反應(yīng)液，輕輕混勻，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。直接取該96孔板用熒光酶標(biāo)儀檢測。以沒有細(xì)胞的孔為空白對照，激發(fā)波長為495 nm，發(fā)射波長為515 nm。NOS相對活力的計算：以未刺激樣品中NOS的活力為1，刺激后樣品中NOS相對活力按下式計算。

式中：RFU為實際測定得到的相對熒光強(qiáng)度。

1.3.8 ROS檢測

按照活性氧檢測試劑盒，利用熒光探針2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorofluorescein diace-tate，DCFH-DA）進(jìn)行活性氧檢測，最后用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.3.9 Western blotting實驗

收集細(xì)胞，加入冰預(yù)冷的裂解液并置于冰上裂解30 min，于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液。用2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）法定量蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠后，被轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用含5%的脫脂奶粉的封閉液4 ℃過夜封閉PVDF膜，并以相應(yīng)一抗雜交，洗膜后再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）孵育。膜經(jīng)清洗后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行自顯影。采用β-actin作為內(nèi)對照。用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行掃描，然后用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 LA、ALC對胰島細(xì)胞存活率的影響

圖1 MTT法檢測LA和ALC對TII處理的胰島細(xì)胞抑制率的影響Fig.1 Effects of LA and ALC on the viability of cytokines-treated RIN-m5f cells by MTT assay

由圖1可知，當(dāng)TII刺激細(xì)胞48 h后，RIN-m5f細(xì)胞死亡明顯增多，與對照組比較，細(xì)胞被抑制40.3%，有極顯著性差異（P＜0.01）；而LA和ALC單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)后，TII的細(xì)胞抑制作用明顯減輕（P＜0.05或P＜0.01），并且LA的作用呈劑量反應(yīng)關(guān)系，LA和ALC聯(lián)合作用比兩者單獨(dú)作用強(qiáng)，說明二者存在協(xié)同效應(yīng)。

2.2 LA、ALC對胰島細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2 LA、ALC對TII處理的胰島細(xì)胞形態(tài)的影響（×2 000）Fig.2 Visualization of RIN-m5f cells under fluorescence microscopy after being stained with Hoechst 33258 (× 2 000)

由圖2可知，熒光顯微鏡觀察可見正常對照組的細(xì)胞核邊界規(guī)則整齊，呈彌散均勻熒光；TII組細(xì)胞核致密濃染，呈碎塊狀，熒光強(qiáng)度比正常細(xì)胞高，核膜皺縮，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變；而LA和ALC處理組的細(xì)胞核與TII組相比，凋亡細(xì)胞明顯減少，對凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化也有所改善，說明TII能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而LA和ALC能抑制TII誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡。

JDR-30DB絞車是一種交流變頻控制的齒輪傳動單軸絞車，主要由大功率交流變頻電動機(jī)、小功率送鉆電機(jī)(含減速機(jī))、大減速箱、大聯(lián)軸器、小聯(lián)軸器、氣胎離合器、液壓盤剎、滾筒軸、絞車架、氣控系統(tǒng)、潤滑系統(tǒng)、控制箱等單元部件組成。絞車結(jié)構(gòu)見圖1所示。

2.3 LA、ALC對胰島β細(xì)胞胰島素分泌能力的影響

與正常對照組相比，TII組胰島細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下和高糖刺激下的胰島素水平降低，刺激指數(shù)（stimulating index，SI）：高糖刺激狀態(tài)胰島素與基礎(chǔ)狀態(tài)胰島素的比值也下降，胰島素分泌存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。與TII組比較，當(dāng)預(yù)先給予LA、ALC后，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下和葡萄糖刺激下胰島素分泌能力都有不同程度的改善（P＜0.05或P＜0.01），并且呈現(xiàn)劑量依賴性，同時刺激指數(shù)也有一定的增加，結(jié)果見表1。

表1 LA和ALC對RIN-m5f細(xì)胞胰島素分泌的影響Table 1 Effects of LA and ALC on insulin secretion in RIN-m5f cells

表1 LA和ALC對RIN-m5f細(xì)胞胰島素分泌的影響Table 1 Effects of LA and ALC on insulin secretion in RIN-m5f cells

注：#.與對照組相比，差異顯著（P＜0.05）； ##.與對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別胰島素分泌水平/（ng/mL）刺激指數(shù)2.8 mmol/L葡萄糖16.7 mmol/L葡萄糖對照組47.16±9.43135.70±13.092.88 TII32.34±6.63#60.26±14.58##1.85#LA1036.24±5.2373.20±11.532.02 LA10040.37±8.18*97.69±10.38**2.42*ALC1034.13±5.6368.60±12.642.01 ALC10038.75±8.23*87.96±9.96*2.27*LA10+ALC1039.76±6.48*93.83±16.47**2.36*LA100+ALC10046.23±8.34*125.74±16.52**2.72*

2.4 LA、ALC對胰島RIN-m5f細(xì)胞NO和NOS的影響

圖3 LA、ALC對TII處理的胰島RIN-m5f細(xì)胞NO含量和NOS活力的影響Fig.3 Effects of LA and ALC on TII-induced NO production and NOS expression in RIN-m5f cells

由圖3可知，與對照組相比，TⅡ刺激細(xì)胞48 h后RIN-m5f細(xì)胞分泌NO顯著增加，NOS表達(dá)也增加（P＜0.01）。經(jīng)LA和ALC預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)NO水平較TII組均明顯減少（P＜0.01），并呈現(xiàn)一定劑量依賴性，提示LA和ALC能夠減輕TII誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡同時可減少細(xì)胞內(nèi)NO的水平。同時LA（100 μmol/L）、兩個LA+ ALC組預(yù)處理明顯地抑制TII誘導(dǎo)RIN-m5f細(xì)胞NOS表達(dá)水平的增加（P＜0.01或P＜0.05）。

2.5 LA、ALC對胰島細(xì)胞ROS的影響

圖4 LA、ALC對胰島細(xì)胞ROS的影響Fig.4 Effects of LA and ALC on ROS levels in RIN-m5f cells

由圖4可知，與對照組比較，TII組胰島RIN-m5f細(xì)胞DCFH-DA的熒光強(qiáng)度顯著增加（P＜0.05）。當(dāng)預(yù)先給予LA和ALC后，細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA的熒光強(qiáng)度顯著減少（P＜0.01）。

圖5 LA、ALC對TII誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Effects of LA and ALC on apoptosis-related protein of RIN-m5f cells treated by TII for 48 h

由圖5可知，RIN-m5f細(xì)胞經(jīng)炎癥細(xì)胞因子處理48 h后，凋亡蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，抗凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)分別增加3.25、2.42倍，Bcl-2、I-κB蛋白表達(dá)較對照組分別降低58.3%、52.6%，與對照組比較差異具有顯著性（P＜0.05）。而分別加入LA和ALC后上述凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有明顯的改善。此外，與對照組對比，炎癥細(xì)胞因子對總的NF-κB表達(dá)沒有影響，但TII組細(xì)胞核蛋白NF-κB表達(dá)增加了1.5倍，而胞漿蛋白NF-κB表達(dá)減少了50%（P＜0.05），說明炎癥細(xì)胞因子能促進(jìn)NF-κB由細(xì)胞漿向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，而加入LA+ALC后NF-κB轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核的量均明顯減少（P＜0.05）。

圖6 LA、ALC對TII誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素c釋放的影響Fig.6 Effects of LA and ALC on cytochrome c release of RIN-m5f cells treated by TII for 48 h

由圖6可知，RIN-m5f細(xì)胞受TII刺激后，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c釋放進(jìn)入胞漿中，與對照組相比其胞漿細(xì)胞色素c的濃度增加了近1倍，線粒體中細(xì)胞色素c的濃度降低了50%，顯著低于對照組（P＜0.05）；加入LA+ALC預(yù)處理后，線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c表達(dá)量增加。細(xì)胞漿中細(xì)胞色素c表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。

3 討 論

近年來，炎癥細(xì)胞因子在1型和2型糖尿病的病理生理機(jī)制中所起的作用一直是關(guān)注的熱點。本實驗發(fā)現(xiàn)TNF-α、IFN-γ和IL-1β聯(lián)合使用可導(dǎo)致胰島RIN-m5f細(xì)胞凋亡。TNF-α、IFN-γ和IL-1β均為促炎性細(xì)胞因子，它們對胰島β細(xì)胞的炎癥性損害已見報道[8-9]，IFN-γ、IL-1β、TNF-α對β細(xì)胞生存能力的影響可能具有不同的機(jī)制，這說明3 種炎癥細(xì)胞因子在促進(jìn)胰島細(xì)胞凋亡過程中起到了協(xié)同作用。凋亡對胰島細(xì)胞產(chǎn)生的直接影響就是胰島素分泌障礙，本實驗發(fā)現(xiàn)TNF-α、IFN-γ、IL-1β聯(lián)合作用48 h后，RIN-m5f細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌和高糖狀態(tài)下胰島素分泌都減少，刺激指數(shù)也明顯下降，這與以前文獻(xiàn)報道是一致的[10]。本實驗還發(fā)現(xiàn)LA和ALC預(yù)處理能抑制TII誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡，并且LA表現(xiàn)為一定的劑量依賴性，同時LA和ALC聯(lián)合作用比單獨(dú)作用效果更加明顯，說明二者存在協(xié)同效應(yīng)。加入LA和ALC，胰島細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下和葡萄糖刺激狀態(tài)下胰島素分泌量明顯增加。再次證明LA和ALC聯(lián)用對TII引起的胰島β細(xì)胞凋亡具有明顯的拮抗作用。

激活NF-κB信號途徑后增加β細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是1型和2型糖尿病的共同發(fā)病機(jī)制[11-12]。靜息細(xì)胞中NF-κB與其抑制蛋白（I-κB）結(jié)合存在于胞漿中處失活狀態(tài)。炎癥細(xì)胞因子刺激可誘導(dǎo)I-κB磷酸化而使NF-κB活化，并轉(zhuǎn)位于胞核內(nèi)，結(jié)合至DNA上的相應(yīng)位點，調(diào)控下游相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，包括NOS、IL等，從而促進(jìn)NO產(chǎn)生而損傷β細(xì)胞[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)TNF-α、 IFN-γ和IL-1β聯(lián)合作用RIN-m5f細(xì)胞48 h后，I-κB蛋白表達(dá)量細(xì)胞下調(diào)，但對NF-κB總量影響不大，卻能明顯增加NF-κB轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)的量進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡。為了進(jìn)一步闡明LA和ALC改善胰島細(xì)胞凋亡的機(jī)制，通過分離細(xì)胞核蛋白檢測了NF-κB的轉(zhuǎn)位情況，發(fā)現(xiàn)LA+ALC能減少NF-κB轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)的量，從而改善TII誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡。

活化巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞產(chǎn)生的NO、氧自由基等為糖尿病的主要致病因素，以前的文獻(xiàn)都報道了炎癥細(xì)胞因子高表達(dá)可能主要通過誘導(dǎo)NOS表達(dá)，促進(jìn)NO產(chǎn)生而損傷β細(xì)胞[14]。本實驗結(jié)果證實：聯(lián)合使用3 種炎癥細(xì)胞因子作用48 h可顯著增強(qiáng)RIN-m5f細(xì)胞內(nèi)NOS的活性，并使培養(yǎng)上清液中NO的含量顯著增加，ROS水平表達(dá)增加。運(yùn)用LA、ALC干預(yù)后胰島細(xì)胞NOS活性和NO水平均明顯低于炎癥細(xì)胞因子損傷組。實驗結(jié)果表明LA、ALC對抗上述炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，抑制NOS活性，減少細(xì)胞內(nèi)NO生成，從而減輕NO對β細(xì)胞的毒性作用也是其保護(hù)細(xì)胞、促進(jìn)胰島細(xì)胞胰島素分泌的重要機(jī)制。

B細(xì)胞淋巴瘤蛋白家族（Bcl家族）是一類原癌凋亡基因家族，在程序性細(xì)胞死亡過程中起關(guān)鍵作用，Bcl-2和Bax分別是Bcl家族中最主要的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白[15]。在本實驗中，TNF-α、IFN-γ、IL-1β聯(lián)合作用RIN-m5f細(xì)胞48 h后Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)；而LA和ALC能升高胰島細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，降低Bax表達(dá)，提示Bcl-2基因家族既是TNF-α、IFN-γ和IL-1β誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡過程中的一種調(diào)節(jié)因子，也是LA和ALC發(fā)揮其保護(hù)作用的一個途徑。

近年來人們對凋亡的認(rèn)識已經(jīng)從細(xì)胞核的改變決定凋亡，發(fā)展為重視線粒體，因為它構(gòu)成了細(xì)胞存亡的控制中心。細(xì)胞色素c是哺乳動物細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)過程的關(guān)鍵因素，通常情況下細(xì)胞色素c是一個定位于線粒體膜間隙的相對分子質(zhì)量為14.5 kD的水溶性蛋白質(zhì)，電穩(wěn)定性地結(jié)合于線粒體內(nèi)膜，不能通過外膜。凋亡過程中細(xì)胞色素c通過線粒體外膜釋放，導(dǎo)致Caspase-3激活，并進(jìn)一步激活下游的Caspases，引起一系列瀑布式反應(yīng)，最后致使細(xì)胞凋亡[16-18]。細(xì)胞色素c釋放還可通過引起線粒體呼吸鏈電子傳遞障礙，使ROS產(chǎn)生增加，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)：TNF-α、IFN-γ和IL-1β聯(lián)合作用RIN-m5f細(xì)胞48 h后，線粒體細(xì)胞色素C釋放明顯增加，Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高。這說明炎癥細(xì)胞因子作用胰島RIN-m5f細(xì)胞48 h能夠引起胰島細(xì)胞線粒體凋亡。此外，LA+ALC能夠明顯降低胰島細(xì)胞ROS水平，抑制線粒體細(xì)胞色素c的釋放，從而保護(hù)胰島細(xì)胞線粒體不被炎癥細(xì)胞因子破壞，這說明LA、ALC可保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能也是LA、ALC改善胰島細(xì)胞凋亡的主要途徑。

總之，炎癥細(xì)胞因子可通過ROS-cytochrome c釋放-ROS-NF-κB-NOS-NO通路最終引起胰島β細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而影響胰島素分泌；而LA和ALC聯(lián)用可抑制炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島素分泌。

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Effects of α-Lipoic Acid and Acetyl-L-Carnitine on Cytokines-Induced Islet Cell Dysfunction

ZHANG ZHAO-feng, GU Jiao-jiao, BAO Lei, CAI Xia-xia, LI Yong*
(Beijing Key Laboratory of Toxicological Research and Risk Assessment for Food Safety, Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Peking University, Beijing 100191, China)

Objective: To explore the effects of α-lipoic acid (LA) and acetyl-L-carnitine (ALC) on islet cell dysfunction. Methods: LA and ALC were co-incubated with a combination of three cytokines, i.e. tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interferon-γ (IFN-γ) for 48 h, to establish TII-treated rat insulinoma cell lines (Rin-m5F cells). Cell viability was detected with MTT assay and cell morphology was examined with the imunofluorescence technique. Reactive oxygen species (ROS) were measured with fl ow cytometry. The expression levels of apoptotic-related proteins including Bax, Caspase-3, NF-κB and Bcl-2 were examined via Western blotting analysis. Insulin level was measured through radioimmunoassay (RIA). Results: Treatment of rats with TII for 48 h significantly decreased RIN-m5f cells viability, and basal and glucose-stimulated insulin secretion. TII signif i cantly increased ROS and nitrite oxide (NO) levels, promoted NF-κB translocation into nucleus. TII increased NF-κB, Bax and Caspase-3 expression, inhibited I-κB and Bcl-2 expression. In addition, TII increased cytochrome c release from mitochondira. A combination of LA and ALC was seen to facilitate improvement of TII-induced islet cell dysfunction, increase RIN-m5f cells viability and basal and glucose-stimulated insulin secretion, decrease ROS and NO levels, inhibit NF-κB translocation into nucleus, decrease NF-κB, Bax and Caspase-3 expression and increase I-κB and Bcl-2 expression. LA+ALC decreased cytochrome c release from mitochondria. Conclusions: TII can induce RIN-m5f cells dysfunction and inhibit insulin secretion viaROS-mitochondria- apoptosis-NF-κB-NOS-NO pathway. LA+ALC can facilitate RIN-m5f cells function via ROS-mitochondria apoptosis-NF-κB-NOS-NO pathway.

cytokine; islet cell dysfunction; α-lipoic acid; acetyl-L-carnitine

151.2

A

1002-6630（2014）15-0232-06

10.7506/spkx1002-6630-201415047

2013-10-02

教育部博士點基金項目（20100001110060）

張召鋒 （1978—），男，講師，博士，研究方向為營養(yǎng)與疾病。E-mail：zhangzhaofeng@126.com

*通信作者：李勇（1958—），男，教授，博士，研究方向為營養(yǎng)與疾病。E-mail：liyong@bjmu.edu.cn