申婷婷，馬 娜，李成龍，余 軒，薛文琛，王 浩,*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

根皮苷對高脂膳食喂飼倉鼠氧化損傷保護機制的研究

申婷婷1,2，馬 娜1,2，李成龍2，余 軒2，薛文琛1，王 浩2,*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

以飼喂高脂膳食的倉鼠為動物模型，研究根皮苷在喂飼高脂膳食倉鼠體內(nèi)的抗氧化活性。實驗動物隨機分為對照組和3 個實驗組（3、6、9 g/kg根皮苷），6 周后測定倉鼠血清、心臟、腎臟及肝臟中抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和總抗氧化力（total antioxidant capacity，T-AOC）的活力、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量及采用熒光定量聚合酶鏈式反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測肝臟中抗氧化相關基因mRNA表達水平?？寡趸富盍y定結(jié)果顯示，給予根皮苷后血清、心臟、腎臟及肝臟中SOD、GSH-Px、CAT酶活力均有升高，氧化產(chǎn)物MDA含量顯著降低。RT-PCR結(jié)果顯示，3 個不同劑量根皮苷實驗組CuZn-SOD、Mn-SOD、GSH-Px、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）mRNA表達水平與對照組相比均極顯著升高（P＜0.01）；給予6、9 g/kg根皮苷，CAT基因表達水平較對照組極顯著升高（P＜0.01）。因此，根皮苷對高脂膳食喂飼倉鼠氧化應激損傷的保護作用可能是通過激活抗氧化基因Nrf2表達，并上調(diào)抗氧化基因SOD、GSH-Px、CAT、HO-1 mRNA表達水平，進而增加抗氧化酶的活力實現(xiàn)的。

根皮苷；抗氧化；酶活力；基因表達

線粒體是氧化磷酸化供能的主要場所，在氫質(zhì)子和氧供應失調(diào)或者在機體代謝和耗能時，會生成自由基，有氧生物產(chǎn)生自由基是不可避免的[1]，特別是當機體處于一定生理（年老）、病理或者能量過剩狀態(tài)時，會產(chǎn)生過多的自由基，當超出了機體清除能力時，自由基便會攻擊細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA等，且受損的DNA不易降解會對機體造成嚴重損傷，最終造成細胞死亡，機體組織功能受損[2-6]。

為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)機體本身存在自由基清除體系。Nrf2-Keap1/ARE通路是機體內(nèi)的一種復雜且極為重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路[7]。正常生理情況下，Keap1與Nrf2緊密結(jié)合，抑制Nrf2誘導靶基因的表達；當機體處于氧化應激狀態(tài)時，Nrf2與Keap1解離[8]，Nrf2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞核中，識別并與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合，啟動Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，提高細胞對氧化應激的反應能力。另外，Nrf2是超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）的上游基因，Nrf2的激活可以促進抗氧化基因的表達，且能對抗衰老引起的免疫力下降[9]。其中，SOD能催化O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，CAT和GSH-Px等能將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O。HO-1是血紅素降解反應的限速酶[10]，催化血紅素降解為膽綠素、CO及Fe2+，膽綠素再在還原酶作用下轉(zhuǎn)化為膽紅素，血紅素的3 種代謝產(chǎn)物均具有抗氧化功能[11]。

根皮苷富含酚羥基，多存在于在蘋果和多穗柯甜茶嫩葉中，多個研究表明根皮苷具有抗氧化、降血糖等活性[12-13]。高脂膳食能夠?qū)е聞游矬w內(nèi)能量代謝失衡，進而造成機體氧化應激損傷[14]，本實驗以飼喂高脂膳食倉鼠為動物模型，研究根皮苷對倉鼠氧化應激損傷的保護作用機制，為富含根皮苷的蘋果渣深度開發(fā)應用提供基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

基礎飼料 北京維通利華實驗動物技術有限公司；根皮苷 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒、超氧化物歧化酶（S OD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測試盒 南京建成生物工程研究所；Trizol試劑、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

Myclcyer PCR儀、MyiQ2 Real Time-PCR儀 美國Bio-Rad公司；UVmini-1240紫外-可見分光光度計 日本島津公司；冷凍離心機 美國Thermo公司。

1.3 動物

倉鼠（Mesocricetus auratus），清潔級，36 只，（125±10）g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物飼養(yǎng)條件及實驗分組

動物飼養(yǎng)條件：屏障系統(tǒng)動物房，溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%，控制照明時間為12 h，適應1 周后開始實驗。

實驗分組：將健康倉鼠隨機分成4 組，每組9 只，分別為對照組、低劑量組（3 g/kg根皮苷）、中劑量組（6 g/kg根皮苷）、高劑量組（9 g/kg根皮苷）。高脂飼料配方：玉米淀粉408 g/kg、酪蛋白242 g/kg、蔗糖119 g/kg、豬油150 g/kg、礦物質(zhì)混合物40 g/kg（AIN93）、維生素混合物20 g/kg（AIN93）、DL蛋氨酸1 g/kg，實驗組在此基礎上添加3、6、9 g/kg根皮苷。倉鼠飼養(yǎng)6 周，實驗期間自由攝食攝水。

實驗6 周后，倉鼠禁食不禁水12 h，CO2麻醉后取血、處死并解剖。4 ℃離心分離血清后-80 ℃保存，用于后期SOD、GSH-Px、CAT酶活力及MDA含量檢測。收集心臟、腎臟、肝臟等重要器官，生理鹽水清洗后-80 ℃保存。

1.4.2 血清、心臟、腎臟、肝臟中酶活力的測定

血清、心臟、腎臟、肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA含量測定具體參照文獻[13]方法。

1.4.3 RT-PCR檢測肝臟中抗氧化基因CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT、GSH-Px、OH-1、Nrf2 mRNA表達水平

Trizol法提取倉鼠肝臟中的RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，-80 ℃保存，具體方法參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒。SYBR Green法檢測基因表達水平，以GAPDH為內(nèi)參基因。基因引物信息見表1。

表1 倉鼠抗氧化基因?qū)崟r定量引物Table 1 RT-PCR primers used to measure mRNA expression levels of hepatic antioxidant enzyme genes

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 根皮苷對倉鼠血清、心臟、腎臟中SOD、GSH-Px、CAT酶活力及MDA含量的影響

T-AOC通過測 定反應體系中Fe3+還原為Fe2+的量，反映了體系內(nèi)自由基總的清除能力。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應后的終產(chǎn)物，會引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)聚合，具有細胞毒性。

表2 給予不同劑量根皮苷對倉鼠血清、心臟、腎臟中抗氧化酶活性及氧化產(chǎn) 物MDA生成量的影響Table 2 Effect of different doses of dietary supplementation with phlorizin on antioxidant enzyme activities and MDA content in plasma, kidney and heart of hamsters

由表2可知，實驗組血清總SOD活力與對照組相 比，低劑量組、中劑量組有升高趨勢但無顯著性（P＞0.05），高劑量組顯著升高（P＜0.05）；GSH-Px酶活性在3、9 g/kg根皮苷劑量組較對照組顯著升高（P＜0.05），6 g/kg根皮苷劑量組與對照組相比極顯著升高（P＜0.01）；CAT活力測定結(jié)果顯示6 g/kg根皮苷可以極顯著升高其酶活性（P＜0.01），9 g/kg根皮苷顯著升高其酶活力（P＜0.05）；血清中T-AOC活性呈上升趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）；氧化產(chǎn)物MDA含量3 個實驗組與對照組相比極顯著減少（P＜0.01）。

心臟抗氧化酶活力及MDA含量測定結(jié)果顯示：3、9 g/kg根皮苷劑量組與對照組相比，SOD、CAT酶活力極顯著升高（P＜0.01），6 g/kg劑量組SOD、CAT酶活力顯著升高（P＜0.05）；給予3、9 g/kg根皮苷，T-AOC活性顯著升高（P＜0.05），6 g/kg根皮苷劑量組T-AOC活性極顯著升高（P＜0.01）；6 g/kg根皮苷劑量組GSH-Px酶活力顯著升高（P＜0.05），9 g/kg劑量組極顯著升高（P＜0.01）；氧化產(chǎn)物MDA含量在3、9 g/kg根皮苷實驗組與對照組相比極顯著降低（P＜0.01），6 g/kg根皮苷劑量組顯著降低（P＜0.05）。

3、6 g/kg根皮苷劑量組與對照組相比腎臟中SOD酶活性顯著升高（P＜0.05），9 g/kg根皮苷劑量組SOD酶活性極顯著升高（P＜0.01）；與對照組相比，3 g/kg根皮苷劑量組GSH-Px酶活力顯著升高（P＜0.05），6、9 g/kg根皮苷劑量組GSH-Px酶活力極顯著升高（P＜0.01）；CAT酶活力6、9 g/kg實驗組較對照組極顯著升高（P＜0.01）；給予根皮苷能極顯著升高倉鼠腎臟中T-AOC活力（P＜0.01）和降低氧化產(chǎn)物MDA水平（P＜0.01）。

2.2 根皮苷對肝臟中抗氧化酶活性及抗氧化相關基因表達的影響

圖1 不同劑量根皮苷對倉鼠肝臟中抗氧化酶活性及氧化產(chǎn)物MDDAA含量的影響（Fig.1 Effects of different doses of dietary supplementation with phlorizin on antioxidant enzyme activities in heart of hamsters

由圖1a可知，肝臟中CuZn-SOD酶活力測定結(jié)果顯示，3 g/kg根皮苷組CuZn-SOD酶活力較對照組顯著升高（P＜0.05），6、9 g/kg根皮苷組CuZn-SOD酶活力極顯著升高（P＜0.01）；由圖1b可知，Mn-SOD酶活力較對照組升高，且9 g/kg劑量組具有顯著性（P＜0.05）；由圖1c可知，給予根皮苷后肝臟中GSH-Px酶活力增加，與對照組相比6、9 g/kg根皮苷劑量組GSH-Px酶活力顯著升高（P＜0.05）；由圖1d可知，給予6、9 g/kg根皮苷，肝臟中CAT酶活性極顯著升高（P＜0.01）；由圖1e可知，實驗組肝臟中T-AOC活力較對照組都極顯著升高（P＜0.01）；由圖1f可知，給予根皮苷能夠極顯著降低肝臟中氧化產(chǎn)物MDA含量（P＜0.01）。

圖2 不同劑量根皮苷對倉鼠肝臟中抗氧化酶CuZn-SOD、Mn-SOODD、CAT、GSH-Px、 HO-1和Nrf2 mRNA表達水平的影響Fig.2 Effects of different doses of dietary supplementation with phlorizin on antioxidant enzyme gene mRNA expression in hamsters

由圖2可知，與對照相比，給予3、6、9 g/kg根皮苷，肝臟中Mn-SOD、CuZn-SOD、GSH-Px、HO-1、Nrf2 mRNA表達水平極顯著上調(diào)（P＜0.01）；給予6、9 g/kg根皮苷亦能顯著上調(diào)肝臟中CAT基因表達水平（P＜0.01）。

3 討 論

目前，已有多個研究證明蘋果多酚能保護機體抵抗氧化應激、慢性動脈粥樣硬化、冠心病、癌癥、中風及炎癥等[15-17]，如Lu Yinrong等[18]對蘋果皮渣中含有的天然活性成分的抗氧化活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其中含有根皮苷、原花青素B2、綠原酸等具有很強的 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧陰離子自由基清除能力的物質(zhì)，在體外根皮苷的超氧陰離子清除能力是VC和VE的2～3 倍[15]。血清、心臟、腎臟、肝臟中SOD、GSH-Px、CAT酶活力測定實驗結(jié)果顯示，給予根皮苷后動物體內(nèi)抗氧化酶及總抗氧化活力升高，氧化產(chǎn)物MDA水平降低。這與馮天艷等[19]研究發(fā)現(xiàn)的根皮苷對小鼠CCl4致急性肝損傷具有保護作用，能顯著降低肝組織MDA含量，升高肝組織T-AOC和GSH-Px活力結(jié)果一致。另外，Wang Hao等[20]研究發(fā)現(xiàn)山楂黃酮可以升高加速衰老鼠體內(nèi)抗氧化酶活力及上調(diào)肝臟內(nèi)CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT mRNA表達，這與本實驗研究結(jié)果顯示的根皮苷實驗組CuZn-SOD、Mn-SOD、GSH-Px、CAT、Nrf2、HO-1 mRNA表達水平與對照組相比均極顯著升高（P＜0.05）一致。

因此，根皮苷對高脂膳食倉鼠氧化應激保護作用可能是通過激活Nrf2 mRNA及其蛋白質(zhì)表達，進而上調(diào)抗氧化基因SOD、GSH-Px、CAT、HO-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，增加抗氧化酶的活性實現(xiàn)的。

[1] ALLEN R G, TREINI M. Oxidative stress and gene regulation[J]. Free Radical Biology & Medicine, 2000, 28(3): 463-499.

[2] 王琳琳, 凌文華. 線粒體DNA氧化損傷機制的探討[J]. 疾病控制雜志, 2000, 4(1): 79-83.

[3] KOWALTOWSKI A J, VERCESI A E. Mitochondrial damage induced by conditions of oxidative stress[J]. Free Radical Biology & Medicine, 1999, 26(3/4): 463-471.

[4] YU E, MERCER J, BENNETT M. Mitochondria in vascular disease[J]. Cardiovascular Research, 2012, 95(2): 173-182.

[5] DAIBER A. Redox signaling (cross-talk) from and to mitochondria involves mitochondrial pores and reactive oxygen species[J]. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 2010, 1797(6/7): 897-906.

[6] DIKALOV S. Cross talk between mitochondria and NAPDH oxidases[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2011, 51(7): 1289-1301.

[7] 鐘敏. Nrf2-Keap1抗氧化系統(tǒng)研究進展[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2006, 22(3): 360-362.

[8] LI Wenge, KONG A N. Molecular mechanisms of Nrf2-mediated antioxidant response[J]. Molecular Carcinogenesis, 2009, 48(2): 91-104.

[9] 蔡維霞, 張軍, 胡大海. 氧化和化學應激的防御性轉(zhuǎn)導通路: Nrf2/ ARE[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2009, 25(4): 297-303.

[10] KIM J S, SONG H J, KO S K, et al. Quercetin-3-O-β-D-glucuronopyranoside (QGC)-induced HO-1 expression through ERK and PI3K activation in cultured feline esophageal epithelial cells[J]. Fitoterapia, 2010, 81(2): 85-92.

[11] 朱子夫, 馬莉. HO-1抗氧化損傷的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述, 2010, 16(15): 2266-2270.

[12] EHRENKRANZ J R, LEWIS N G, KAHN C R, et al. Phlorizin: a review[J]. Diabetes-Metabolism Research and Reviews, 2005, 21(1): 31-38.

[13] ROSSETTI L, SMITH D, SHULMAN G I, et al. Correction of hyperglycemia with phlorizin normalizes tissue sensitivity to insulin in diabetic rats[J]. Journal of Clinical Investigation, 1987, 79(5): 1510-1515. [14] PFLUGER P T, HERRANZ D, VELASCO-MIGUEL S, et al. Sirt1 protects against high-fat diet-induced metabolic damage[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(28): 9793-9798.

[15] LEE K W, KIM Y J, KIM D O, et al. Major phenolics in apple and their contribution to the total antioxidant capacity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(22): 6516-6520.

[16] LOTITI S B, FREI B. Relevance of apple polyphenols as antioxidants in human plasma: contrasting in vitro and in vivo effects[J]. Free Radical Biology & Medicine, 2004, 36(2): 201-211.

[17] BOYER J, LIU Ruihai. Apple phytochemicals and their health benefits[J]. Nutrition Journal, 2004, 3: 5.

[18] LU Yinrong, YEAP FOO L. Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace[J]. Food Chemistry, 2000, 68(1): 81-85.

[19] 馮天艷, 方榮, 鄧改改, 等. 根皮苷對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用[J]. 中藥藥理與臨床, 2010, 26(5): 47-50.

[20] WANG Hao, ZHANG Zesheng, ZUO Yanbo, et al. Hawthorn fruit increases the antioxidant capacity and reduces lipid peroxidation in senescence-accelerated mice[J]. European Food Research Technology, 2011, 232(5): 743-751.

Mechanism by Which Phloridzin Protects against High-Fat Diet-Induced Oxidative Damage in Hamster

SHEN Ting-ting1,2, MA Na1,2, LI Cheng-long2, YU Xuan2, XUE Wen-chen1, WANG Hao2,*
(1. College of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Excessive exposure to dietary lipids causes deranged homeostasis of cellular energy metabolism and oxidative damage. Phlorizin is rich in phenolic hydroxyl groups which have been proved to play an antioxidant role in vivo and in vitro. This study aimed to investigative the antioxidant activity of phlorizin in hamsters fed a high fat diet. Totally, 36 hamsters were fed either control diet or one of the three experimental diets containing 3, 6, or 9 g/kg phlorizin for 6 weeks. Then the enzyme activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT), total antioxidant capacity (T-AOC) and the content of malonaldehyde (MDA) in hamster serum, heart, kidney and liver were assayed. Finally, the mRNA expression levels of antioxidant enzymes including SOD, GSH-Px, CAT, heme oxygenase-1 (HO-1) and F-E2-related factor 2 (Nrf2) were detected by real-time PCR (RT-PCR). Antioxidant enzyme activity assays showed that the activities of SOD, GSH-Px and CAT in serum, heart, kidney and liver were increased and the content of MDA was significantly reduced by dietary phloridzin supplementation. RT-PCR results showed that the mRNA expression levels of CuZn-SOD, Mn-SOD, GSH-Px, HO-1 and Nrf2 were significantly increased compared with those of the control group (P ＜ 0.01), while CAT gene in 6 and 9 g/kg groups were significantly increased (P ＜ 0.01) compared with the control group. Therefore, the protection of phloridzin against oxidative stress injury in hamsters fed a high fat diet may be mediated through the induction of the expression of Nrf2 gene and the increases in the mRNA expression levels of SOD, GSH-Px, CAT, and HO-1, which in turn increases the activities of antioxidant enzymes.

phlorizin; antioxidant; enzyme activity; gene expression

TS201.4

A

1002-6630（2014）15-0221-05

10.7506/spkx1002-6630-201415045

2013-08-01

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201322）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B05）；天津市高等學?？萍及l(fā)展基金計劃項目（20100609）

申婷婷（1988—），女，碩士研究生，主要從事食品營養(yǎng)學研究。E-mail：shenting890101@163.com

*通信作者：王浩（1979—），男，副教授，博士，主要從事食品營養(yǎng)學研究。E-mail：wanghao@tust.edu.cn