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        響應(yīng)面法優(yōu)化郫縣豆瓣制曲工藝

        2014-03-08 05:40:17黃韜睿李玉鋒
        食品科學(xué) 2014年15期

        孟 甜,黃韜睿,李玉鋒

        (1.四川旅游學(xué)院烹飪系,四川 成都 610100;2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院,四川 成都 610039)

        響應(yīng)面法優(yōu)化郫縣豆瓣制曲工藝

        孟 甜1,黃韜睿1,李玉鋒2

        (1.四川旅游學(xué)院烹飪系,四川 成都 610100;2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院,四川 成都 610039)

        本實驗采用Box-Behnken法分析優(yōu)化郫縣豆瓣制曲工藝。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取曲精量、制曲溫度、制曲時間為響應(yīng)因素,以成曲質(zhì)量指標(biāo)(蛋白酶活力和α-淀粉酶活力)綜合評分為響應(yīng)值,建立回歸模型,并結(jié)合實際操作情況,得出郫縣豆瓣最佳制曲工藝條件為:曲精量0.28%、制曲溫度33.50 ℃、制曲時間32.50 h,此時成曲質(zhì)量指標(biāo)綜合評分為98.23。

        Box-Behnken法;優(yōu)化;郫縣豆瓣;制曲工藝

        郫縣豆瓣是最為出名的四川調(diào)味品之一,被譽為川菜之魂[1-2],以色澤油潤紅亮、醬香濃郁、味鮮辣醇和、外觀黏稠絨實等特點著稱[3-4]。在許多經(jīng)典川菜如麻婆豆腐、回鍋肉等的烹調(diào)中都必不可少,而且還是四川火鍋底料中的主料,不僅增色提味,還別具風(fēng)味。

        傳統(tǒng)郫縣豆瓣以豆瓣為原料,霉菌為主要微生物菌種,經(jīng)自然制曲、天然發(fā)酵而成[5]。制曲的目的是通過米曲霉等菌種在原料上生長繁殖,以便于在發(fā)酵時利用它們所分泌的多種酶類。這種方法通常需要7~8 d,受到季節(jié)限制不能常年生產(chǎn),且成曲質(zhì)量也不穩(wěn)定[6]。而豆瓣質(zhì)量的好壞關(guān)鍵在于制曲質(zhì)量,因此在整個生產(chǎn)過程中制曲環(huán)節(jié)顯得尤為重要,是豆瓣生產(chǎn)中最重要的質(zhì)量控制點[7]。目前對豆瓣發(fā)酵工藝研究較多[8-12],而制曲工藝的報道卻較少。為了對傳統(tǒng)的制曲工藝進(jìn)行優(yōu)化,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken法,以成曲中蛋白酶活力和α-淀粉酶活力為指標(biāo),對影響成曲質(zhì)量的主要因素進(jìn)行研究,并對結(jié)果加以驗證。

        1 材料與方法

        1.1 菌種

        滬釀3.042號米曲霉 中國科學(xué)院成都分院。

        1.2 試劑

        鉬酸鈉、鎢酸鈉、硫酸鋰、磷酸、濃鹽酸、碳酸鈉、三氯乙酸、硼酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、碘液 成都科龍化工試劑廠。

        1.3 儀器與設(shè)備

        UV-2600紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;ISO9001電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;PHS-25型pH計 上海雷磁儀器廠;TMQ-R-3250自動臺式滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

        1.4 方法[13]

        1.4.1 蛋白酶活力測定

        稱取充分研細(xì)的成曲5 g,加水至100 mL,在40 ℃水浴內(nèi)間斷攪拌1 h,過濾,濾液用pH 7.2磷酸緩沖液稀釋至一定倍數(shù);取樣品稀釋液1 mL,置于40 ℃水浴中預(yù)熱2 min,再加入同樣預(yù)熱的酪蛋白溶液1 mL,精確保溫10 min,時間到后立即再加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL終止反應(yīng);繼續(xù)置于水浴保溫20 min,使殘余蛋白質(zhì)沉淀后過濾,取濾液1 mL,再加0.4 mol/L碳酸鈉5 mL、已稀釋的福林試劑1 mL搖勻,40 ℃保溫發(fā)色20 min后,680 nm波長處測定吸光度??瞻讓φ赵诩永业鞍字跋燃?.4 mol/L三氯乙酸2 mL,使酶失活,再加入酪蛋白[14]。

        在40 ℃下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸,定義為1個蛋白酶活力單位,以U/g干基表示。

        1.4.2 α-淀粉酶活力測定

        取2%可溶性淀粉20 mL和pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液5 mL于25 mm×200 mm試管中,在60 ℃恒溫水浴中預(yù)熱4~5 min。加入預(yù)先稀釋的酶液0.5 mL,立即記錄時間,充分搖勻,定時用吸管取出反應(yīng)液0.5 mL,滴于預(yù)先充滿比色稀碘液(約1.5 mL)的白瓷板空穴內(nèi)。當(dāng)穴內(nèi)顏色反應(yīng)由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色,與標(biāo)準(zhǔn)終點色相同時,即為反應(yīng)終點,并記錄時間/min。1 mL酶液于60 ℃、pH 6.0條件下,1 h液化1 g可溶性淀粉,即為1個酶活力單位,以U/g干基表示。

        1.5 制曲工藝

        取蒸熟冷卻后的蠶豆和小麥(質(zhì)量比4:1)500 g,加入已與面粉拌和后的曲精(曲精、面粉質(zhì)量比1:10),充分拌勻,攤平,置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中按照試驗設(shè)計工藝條件進(jìn)行培養(yǎng),中間翻曲一次。其中,曲精呈黃綠色、無夾心、無灰黑絨毛及其他異色,孢子數(shù)經(jīng)測定[15]約為17×109個/g(干基計),細(xì)菌數(shù)低于104個/g。

        1.6 試驗設(shè)計

        1.6.1 單因素試驗

        以蛋白酶活力和α-淀粉酶活力為指標(biāo),采用單因素試驗依次對曲精量、制曲溫度、制曲時間進(jìn)行考察,試驗水平分別選取曲精量質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%;制曲溫度25、28、31、34、37、40 ℃;制曲時間12、18、24、30、36、42、48 h。

        1.6.2 Box-Behnken試驗設(shè)計

        根據(jù)單因素試驗結(jié)果及Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理,采用響應(yīng)面法設(shè)計三因素三水平試驗方案。響應(yīng)變量Y為根據(jù)蛋白酶活力和α-淀粉酶活力在成曲質(zhì)量中的重要性求加權(quán)和得到的綜合評分。自變量A為曲精量、B為制曲溫度、C為制曲時間。本試驗的設(shè)計、模型建立及數(shù)據(jù)分析,利用Design Expert 8.0.5軟件輔助完成。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗結(jié)果

        2.1.1 曲精量考察

        接種曲精量直接影響豆瓣制曲的周期。接種量大可縮短制曲周期,減少雜菌污染機會;但接種量過大,營養(yǎng)物質(zhì)主要被用于菌體細(xì)胞增長,并產(chǎn)生大量代謝廢物,導(dǎo)致微生物所處環(huán)境惡化,菌體細(xì)胞會較早衰老,且有限的營養(yǎng)物質(zhì)也不足以維持米曲霉的生長所需,會形成大量休眠孢子,降低酶活力;接種量過小,微生物生長繁殖不足,使得營養(yǎng)過剩,造成浪費,增加生產(chǎn)成本[16]。選定制曲時間30 h、制曲溫度30 ℃,考察曲精量對成曲質(zhì)量的影響,結(jié)果如圖1所示。

        圖1 曲精量對蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影響Fig.1 Effect of inoculum amount on protease activity and α-amylase activity

        由圖1可知,蛋白酶活力和α-淀粉酶活力隨接種曲精量的增加而增大,達(dá)到最大值時的曲精量分別為0.25%、0.35%,相應(yīng)的酶活力分別為2 135.81、133.45 U/g;隨著接種量的持續(xù)增加,酶活力呈逐漸減小趨勢。因此,控制接種曲精量在0.25%~0.35%。

        2.1.2 制曲溫度考察

        溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素之一。一般來講,溫度低于25 ℃霉菌發(fā)芽緩慢;溫度高于38 ℃,也不利于霉菌發(fā)芽,反而適合細(xì)菌的發(fā)育繁殖,易染雜菌,影響制曲[17-18]。在溫度控制適當(dāng)時,米曲霉占絕對優(yōu)勢,可以抑制雜菌生長,空氣中的雜菌只能少量繁殖,對成曲的質(zhì)量影響不大。選定接種曲精量為0.25 %,制曲時間30 h,考察制曲溫度對成曲質(zhì)量的影響,結(jié)果如圖2所示。蛋白酶活力和α-淀粉酶活力隨著制曲溫度的升高而增大,達(dá)到最大值時的溫度分別為34、31 ℃;隨著制曲溫度的繼續(xù)升高,酶活力呈逐漸減小趨勢。因此,控制制曲溫度在31~34 ℃。

        圖2 制曲溫度對蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影響Fig.2 Effect of koji-making temperature on protease activity and α-amylase activity

        2.1.3 制曲時間考察

        制曲時間對微生物生長繁殖有著重要影響。制曲時間過短,微生物生長沒有達(dá)到最佳,原料利用率低,酶活力不高;制曲時間過長,酶活力反而逐漸下降,同時由于微生物的生長繁殖,又需要多消耗原料,增加了浪費,而且影響制曲設(shè)備的周轉(zhuǎn)、增加通風(fēng)機電力消耗[19]。因此以酶活力達(dá)到最高點為依據(jù)制定制曲時間。選定接種曲精量為0.25 %、制曲溫度31 ℃,考察制曲時間對成曲質(zhì)量的影響,結(jié)果如圖3所示。

        圖3 制曲時間對蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影響Fig.3 Effect of koji-making time on protease activity and α-amylase activity

        由圖3可知,隨著制曲時間的延長,蛋白酶活力和α-淀粉酶活力逐漸增大,二者達(dá)到峰值的時間分別為30、36 h;繼續(xù)延長制曲時間,蛋白酶活力和α-淀粉酶活力逐漸減小。因此選擇制曲時間在30~36 h之間。

        2.2 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果

        Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表1。對表1試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合,獲得成曲質(zhì)量指標(biāo)(蛋白酶活力和α-淀粉酶活力)的綜合評分Y對自變量曲精量(A)、制曲溫度(B)、制曲時間(C)的多元回歸方程:

        該模型方差分析結(jié)果見表2。對成曲質(zhì)量綜合評分所建立的回歸模型極顯著(P<0.000 1),且各因子系數(shù)均有意義,試驗的3 個因素對蛋白酶活力的曲面效應(yīng)皆顯著,對綜合評分的交互影響中,AB、AC交互作用顯著。此外,回歸模型的診斷分析表明,相關(guān)系數(shù)R2= 0.994 2,模型的信噪比為25.293,一般認(rèn)為模型的可接受信噪比大于4,說明模型的擬合度和可信度非常高;變異系數(shù)越小說明試驗可靠性越高,本試驗的變異系數(shù)為1.73,說明試驗可靠性良好。

        表1 Box-Behnken設(shè)計矩陣響應(yīng)數(shù)據(jù)結(jié)果Table 1 Box-Behnken design matrix with experimental results and response valluueess

        表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the regression model

        為更直觀地反映響應(yīng)因素對響應(yīng)值的影響,對獲得的回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面圖及等高線圖分析,結(jié)果如圖4所示??梢钥闯?,3 個響應(yīng)因素在選定的范圍內(nèi)都存在響應(yīng)極值,AB、AC交互作用顯著,BC交互作用不顯著,結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致。由等高線和響應(yīng)面圖分析,結(jié)合回歸模型可以預(yù)測出當(dāng)曲精量(A)為0.28%、制曲溫度(B)33.67 ℃、制曲時間(C)32.73 h時,成曲質(zhì)量指標(biāo)綜合評分為98.69。

        圖4 各因素及其相互作用影響綜合評分的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of independent variables on comprehensive quality score

        2.3 回歸模型的實驗驗證

        為驗證預(yù)測值與真實值之間的擬合程度及方程的合適性、有效性,采用綜合評分最大響應(yīng)值對應(yīng)的響應(yīng)因素值進(jìn)行實驗驗證,考慮到實際操作的方便及工藝的實際情況,對響應(yīng)因素值進(jìn)行修正,曲精量(A)為0.28 %、制曲溫度(B)33.50 ℃、制曲時間(C)32.50 h,經(jīng)過3 組平行實驗,綜合評分平均值為98.23,預(yù)測結(jié)果(98.69)與實驗值相對偏差僅為0.47%,此時蛋白酶活力和α-淀粉酶活力平均值分別為2 071.06 U/g、138.72 U/g。證明模型是合適有效的,具有一定的實踐指導(dǎo)意義。在后期發(fā)酵實驗中[20],測得豆瓣的氨基酸態(tài)氮含量為1.95 g/100 g,全氮利用率可達(dá)90%以上,與制曲工藝優(yōu)化前相比提高了10%左右。

        3 結(jié) 論

        在本實驗范圍內(nèi),曲精量、制曲溫度、制曲時間對郫縣豆瓣制曲過程中米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力、α-淀粉酶活力均有顯著影響,顯著順序為曲精量>制曲時間>制曲溫度,而且各因素存在一定的交互作用。

        通過單因素試驗和Box-Behnken試驗得出郫縣豆瓣最優(yōu)的制曲工藝條件為:接種曲精量0.28%、制曲溫度33.50 ℃、制曲時間32.50 h,在此條件下成曲質(zhì)量指標(biāo)綜合評分可達(dá)98以上。同時,在本試驗范圍內(nèi)建立的回歸模型可靠有效,可用來預(yù)測設(shè)定條件范圍內(nèi)郫縣豆瓣制曲工藝參數(shù)的響應(yīng)值,且擬合度較好,在此條件下,豆瓣的氨基酸態(tài)氮含量為1.95 g/100 g豆瓣,全氮利用率達(dá)90%以上,與制曲工藝優(yōu)化前相比提高了10%左右。研究結(jié)果可為郫縣豆瓣傳統(tǒng)制曲工藝的改進(jìn)提供參數(shù)借鑒。

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        Optimization of the Preparation of Pi’xian Bean Sauce Koji by Response Surface Methodology

        MENG Tian1, HUANG Tao-rui1, LI Yu-feng2
        (1. Department of Cuisine, Sichuan Tourism University, Chengdu 610100, China; 2. College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

        Response surface methodology using Box-Behnken design was employed to optimize the preparation of Pi’xian bean sauce koji. Based on single-factor experiments, inoculum amount, koji-making temperature and time were chosen as independent variables, and the comprehensive evaluation score of koji quality indicators (protease activity and α-amylase activity) was the response variable. As a result, a mathematical model was established by Box-Behnken design. The optimal preparation conditions for Pi’xian bean sauce koji under actual operation circumstances were determined as 0.28%, 33.50 ℃ and 32.50 h for inoculum amount, koji-making temperature and time, respectively. The resulting product exhibited a comprehensive quality score of 98.23.

        Box-Behnken design; optimization; Pi’xian bean sauce; koji preparation

        TS264.2

        A

        1002-6630(2014)15-0193-05

        10.7506/spkx1002-6630-201415039

        2013-09-05

        四川省教育廳科研基金項目(10ZC063)

        孟甜(1985—),女,講師,碩士,研究方向為食品科學(xué)。E-mail:mengtian85@sohu.com

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