周 駿，梅艷珍，楊 騰，康 莉，戴志東，戴傳超,*

（1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點實驗室，江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210023；2.尚德生物科技有限公司，江蘇 丹陽 212300）

內(nèi)生真菌擬莖點霉B3產(chǎn)漆酶分批發(fā)酵動力學(xué)

周 駿1，梅艷珍1，楊 騰1，康 莉1，戴志東2，戴傳超1,*

（1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點實驗室，江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210023；2.尚德生物科技有限公司，江蘇 丹陽 212300）

通過建立內(nèi)生真菌擬莖點霉（Phomopsis liquidambari）B3產(chǎn)漆酶分批發(fā)酵動力學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)B3菌漆酶生成與菌體生長呈現(xiàn)部分生長偶聯(lián)型。應(yīng)用MATLAB軟件將實驗數(shù)據(jù)與符合B3菌菌體生長的Logistic模型、漆酶生成的Luedeking-Piret模型和基質(zhì)消耗的Luedeking-Piret-Like模型進(jìn)行非線性擬合，求得最優(yōu)參數(shù)估計值和發(fā)酵動力學(xué)模型。分析動力學(xué)模型的擬合曲線，發(fā)現(xiàn)模型的曲線與實驗值能較好地擬合。驗證實驗表明模型計算值與實驗值的偏差大部分都低于10%，說明該動力學(xué)模型能很好地描述B3菌的實際發(fā)酵情況。

內(nèi)生真菌；擬莖點霉；漆酶；分批發(fā)酵；動力學(xué)模型

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）屬于分布范圍廣泛的藍(lán)色多銅氧化酶家族[1]，它能夠催化許多不同的底物，比如酚類和苯胺類化合物[2-3]，其活性部位含有4 個銅離子，通過銅離子的協(xié)同作用氧化底物，并催化氧還原成水[4]。由于漆酶具有較高非特異性氧化能力、無需輔酶因子可直接利用氧作為電子受體等特點[5]，使其被廣泛應(yīng)用于食品、紡織、造紙等許多工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[6]。例如在食品工業(yè)，漆酶可以用于食品工業(yè)廢水的生物修復(fù)、飲料（葡萄酒、啤酒和果汁）加工、抗壞血酸測定、甜菜果膠凝膠化、烘烤，以及作為生物傳感器改善食品感官參數(shù)等。漆酶可以在不需要高投入的情況下，提高生產(chǎn)率、改善食物產(chǎn)品的質(zhì)量，并且具有技術(shù)溫和的優(yōu)勢[7-8]。

前期研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌擬莖點霉B3有產(chǎn)漆酶的功能[9-11]。為了擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模、獲得更大的漆酶產(chǎn)量，對這個重要的非線性生物過程建立發(fā)酵動力學(xué)模型成為必然。發(fā)酵動力學(xué)模型能夠?qū)ξ⑸镞^程進(jìn)行預(yù)測和控制，非常有助于減少一個生物過程從經(jīng)驗探討到擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)失敗的風(fēng)險。因此，建立發(fā)酵動力學(xué)模型及對其進(jìn)行實驗驗證通常作為離開實驗室進(jìn)行試點擴(kuò)大，轉(zhuǎn)變?yōu)樯虡I(yè)生產(chǎn)之前的必要步驟[12]。

本實驗旨在研究B3菌發(fā)酵過程中菌體生長、漆酶生成和基質(zhì)消耗的內(nèi)在規(guī)律，建立B3菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的動力學(xué)模型，并評價該模型對B3菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的擬合度，為進(jìn)一步放大實驗和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

內(nèi)生真菌擬莖點霉（Phomopsis liquidambari）B3為實驗室保藏菌株，分離自大戟科重陽木（Bischofia polycarpa）莖內(nèi)皮[13]。

1.2 試劑與儀器

2,2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；其他相關(guān)試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-6000分光光度計 上海元析儀器有限公司；AL104電子天平 梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；GZX-9030MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠；PB-10 pH計 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基，pH 7.0）：馬鈴薯提取物200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L。

種子培養(yǎng)基（PDB培養(yǎng)基，pH 7.0）：馬鈴薯提取物200 g/L、葡萄糖20 g/L。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（自然pH值）：NaNO33.0 g/L、K2HPO41.0 g/L、MgSO40.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO40.01 g/L、蔗糖2.0 g/L、CuSO4·5H2O 0.002 g/L、對羥基苯甲酸（C7H6O3）0.25 g/L。

1.4 方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

將斜面培養(yǎng)基中保藏的B3菌接入種子培養(yǎng)基中活化，種子液在28 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)48 h。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)

從搖瓶培養(yǎng)的種子液中取5 mL接種到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.5 測定方法

每隔12 h進(jìn)行損毀性取樣，真空抽濾發(fā)酵培養(yǎng)基，菌絲體用于生物量的測定，濾液用于漆酶的活性檢測和還原糖含量測定。所有發(fā)酵過程都進(jìn)行3 個重復(fù)，測定結(jié)果以平均值表示。

1.5.1 生物量測定

干質(zhì)量減量法：抽濾后的菌絲體，用烘箱100 ℃烘干至恒質(zhì)量進(jìn)行測定。

1.5.2 漆酶酶活力測定

5 mL反應(yīng)混合物中包含1 mL粗酶液，測定5 mmol/L ABTS在0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 5.5）中氧化1 min吸光度A420nm的變化。每分鐘氧化1 μmol ABTS所消耗的酶量定義為1個酶活力單位（U）。計算酶活力所用的摩爾消光系數(shù)ε為3.6×104L/（mol·cm）[14]。

1.5.3 蔗糖質(zhì)量濃度測定

用蒽酮-硫酸法測定[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌擬莖點霉B3發(fā)酵產(chǎn)漆酶曲線

圖1 內(nèi)生真菌擬莖點霉B3發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation curves of Phomopsis liquidambari B3

在內(nèi)生真菌擬莖點霉B3的發(fā)酵過程中，取樣測定其生物量、漆酶酶活力和蔗糖質(zhì)量濃度，繪制其發(fā)酵曲線，如圖1所示。，菌體利用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)漆酶，經(jīng)過短暫的延滯期之后，菌體進(jìn)入指數(shù)生長階段，與此同時，漆酶開始產(chǎn)生，并且產(chǎn)量不斷增大。60 h之后，B3菌生長進(jìn)入平穩(wěn)期。在84 h左右，漆酶酶活力達(dá)到最高（86.4 U/mL），隨后開始下降。蔗糖質(zhì)量濃度由最初的217.24 μg/mL下降到41.10 μg/mL，它的消耗主要用于菌體生長、代謝活動的維持和漆酶的生成，隨著菌體生長和漆酶產(chǎn)生而不斷減少。由此可以看出，漆酶的生成與B3菌的生長有著很強(qiáng)的線性關(guān)系，這種關(guān)系屬于部分生長偶聯(lián)型。

2.2 內(nèi)生真菌擬莖點霉B3發(fā)酵動力學(xué)模型的建立

微生物過程的數(shù)學(xué)模型可以用兩種不同的機(jī)制表達(dá)：結(jié)構(gòu)模型和非結(jié)構(gòu)模型。結(jié)構(gòu)模型會把細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和成分這些基本的方面考慮進(jìn)去。相反，非結(jié)構(gòu)模型只用生物量來評價生物系統(tǒng)[16]。實驗發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)模型更便于從菌體生長、漆酶生成和基質(zhì)消耗方面描述發(fā)酵過程的特征。

2.2.1 菌體生長動力學(xué)模型

通常用來描述菌體生長的非結(jié)構(gòu)模型主要有Monod動力學(xué)模型、Logistic方程和Haldane模型[17]。我們先前的實驗數(shù)據(jù)顯示Monod動力學(xué)模型并不適用于B3菌的發(fā)酵過程，而Logistic方程則被廣泛地應(yīng)用于單一基質(zhì)的菌體生長模型，通過不依賴于基質(zhì)濃度的S形曲線，簡單計算得到具有生物學(xué)和幾何意義的發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)[18]。B3菌生物量達(dá)到最大值后會有一個極限，Logistic方程很好地描述了這樣的生長動力學(xué)：

式中：dX/dt為菌體的生長速率/（g/（L·h））；X為生物量/（g/L）；t為發(fā)酵時間/h；μm為菌體生長速率最大時的比生長速率（h-1）；Xm為最大生物量/（g/L）。

當(dāng)t=0時，X=X0，對公式（1）積分，得到公式（2）：

式中：X0為初始生物量/（g/L）。

2.2.2 漆酶生成動力學(xué)模型

漆酶生成動力學(xué)建立在Luedeking-Piret方程的基礎(chǔ)上，該模型通常用來描述產(chǎn)物生成速率和細(xì)胞生長速率之間的關(guān)系[19]。產(chǎn)物的形成速率取決于線性方程中的即時生物量X和菌體生長速率dX/dt[20]，如公式（3）所示：

式中：dP/dt為產(chǎn)物漆酶的生成速率/（U/mL·h）；P為漆酶的酶活力/（U/mL）；α為生長相關(guān)常數(shù)，β為非生長相關(guān)常數(shù)。根據(jù)方程，微生物生長和產(chǎn)物生成之間的關(guān)系被分為3類：當(dāng)α≠0、β=0時，產(chǎn)物生成同菌體生長偶聯(lián)；當(dāng)α≠0、β≠0時，產(chǎn)物生成同菌體生長部分偶聯(lián)；當(dāng)α=0、β≠0時，產(chǎn)物生成與菌體生長無關(guān)[21]。根據(jù)實驗結(jié)果和圖1顯示，漆酶的生成和B3菌的生長屬于部分偶聯(lián)型，對公式（3）積分，得到公式（4）：

2.2.3 基質(zhì)消耗動力學(xué)模型

在B3菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶過程中，基質(zhì)蔗糖主要用于B3菌的生長、代謝產(chǎn)物的生成以及細(xì)胞正常代謝活動的維持。因此，基質(zhì)消耗動力學(xué)可以由Luedeking-Piret-Like方程表示：

式中：dS/dt為基質(zhì)蔗糖的消耗速率/（μg/（mL·h））；S為基質(zhì)濃度/（μg/mL）；λ即1/YX/S，YX/S為菌體得率系數(shù)；γ即MS，為菌體細(xì)胞維持系數(shù)。對公式（5）積分得到公式（6）：

式中：S0為初始基質(zhì)質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

2.3 發(fā)酵動力學(xué)模型參數(shù)求解

2.3.1 菌體生長動力學(xué)模型

利用最小二乘法調(diào)用MATLAB 7.13中的nlinfit函數(shù)迭代求解內(nèi)生真菌擬莖點霉B3菌體生長動力學(xué)模型的相關(guān)參數(shù)值（表1），將測得的B3菌生物量實驗值與菌體生長動力學(xué)模型公式（2）非線性擬合，得到圖2。將μm=0.060 8、Xm=1.59、X0=0.355 4分別代入公式（1）、（2）得到公式（7）、（8）：

表1 內(nèi)生真菌擬莖點霉B3發(fā)酵動力學(xué)模型參數(shù)估計值Table 1 Estimated parameters of the fermentation kinetic model of Phomopsis liquidambariB3

圖2 內(nèi)生真菌擬莖點霉B3生長動力學(xué)模型與實驗值的擬合Fig.2 Growth kinetic model and experimental data fitting of Phomopsis liquidambari B3

由圖2可知，生長動力學(xué)模型與實驗值有較好的擬合。尤其是60 h之前，實驗值與模型曲線幾乎一致，在60 h后，菌體生長受到菌體濃度的抑制，B3菌的生長進(jìn)入平穩(wěn)期，所測生物量的實驗值出現(xiàn)微小的波動，與生長動力學(xué)模型曲線有所偏差。

2.3.2 漆酶生成動力學(xué)模型

利用最小二乘法調(diào)用MATLAB 7.13中的nlinfit函數(shù)迭代求解內(nèi)生真菌擬莖點霉B3漆酶生成動力學(xué)模型的相關(guān)參數(shù)值（表1），將所測得的B3菌產(chǎn)漆酶酶活力實驗值與漆酶生成動力學(xué)模型公式（4）非線性擬合，得到圖3。將μm=0.060 8，Xm=1.59、X0=0.355 4、α= 25.352 5、β=0.271 0分別代入公式（3）、（4）得到公式（9）、（10）：

圖3 內(nèi)生真菌擬莖點霉B3漆酶生成動力學(xué)模型與實驗值的擬合Fig.3 Kinetic model of laccase production and experimental data fitting of Phomopsis liquidambari B3

由圖3可知，漆酶生成動力學(xué)模型曲線與漆酶酶活力的實驗值擬合情況較好。在菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期之前，漆酶酶活力與模型曲線幾乎保持一致，當(dāng)菌體生長受到抑制后，B3產(chǎn)漆酶的能力也受到影響，在84 h達(dá)到產(chǎn)漆酶最大值之后，B3菌產(chǎn)漆酶能力開始下降，末期的漆酶酶活力實驗值明顯低于模型計算值。

2.3.3 基質(zhì)消耗動力學(xué)模型

利用最小二乘法調(diào)用MATLAB 7.13中的nlinfit函數(shù)迭代求解內(nèi)生真菌擬莖點霉B3基質(zhì)消耗動力學(xué)模型的相關(guān)參數(shù)值（表1），將測得發(fā)酵中的蔗糖含量實驗值與基質(zhì)消耗動力學(xué)模型公式（6）非線性擬合，得到圖4。將μm=0.060 8、Xm=1.59、X0=0.355 4、λ=104.750 3、γ= -0.483 2、S0=240.518 8分別代入公式（5）、（6）得到公式（11）、（12）：

圖4 內(nèi)生真菌擬莖點霉B3基質(zhì)消耗動力學(xué)模型與實驗值的擬合Fig.4 Kinetic model of substrate consumption and experimental data fitting of Phomopsis liquidambari B3

由圖4可知，基質(zhì)消耗動力學(xué)模型曲線很好地描述了蔗糖在發(fā)酵過程中的消耗情況，只是與發(fā)酵實驗?zāi)┢诘膶嶒炛涤兴?，可能與菌體生長受到抑制以及產(chǎn)漆酶能力下降有關(guān)。

2.4 模型的驗證

為了驗證B3菌菌體生長、產(chǎn)物漆酶生成和基質(zhì)蔗糖消耗動力學(xué)模型的可靠性，將通過模型求出來的計算值與表2中給出的另一批發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)作比較?？梢悦黠@看出，大部分實驗值與計算值之間的偏差都低于10%，生物量、漆酶酶活力和基質(zhì)質(zhì)量濃度的平均偏差分別為5.34%、7.91%和7.69%，這意味著這些模型能很好地描述B3發(fā)酵產(chǎn)漆酶的過程。

表2 內(nèi)生真菌擬莖點霉B3發(fā)酵實驗值與模型計算值比較Table 2 Comparison between experimental values and model calculation of Phomopsis liquidambari B3

3 結(jié) 論

本實驗中B3的漆酶生成和菌體的生長屬于部分生長偶聯(lián)型，根據(jù)B3菌在發(fā)酵過程中所測得的菌體生長、漆酶生成和基質(zhì)消耗的實驗數(shù)據(jù)，利用MATLAB軟件進(jìn)行非線性擬合，建立發(fā)酵動力學(xué)的模型，可以表述為：菌體生長動力學(xué)模型：；漆酶生成動力學(xué)模型：+7.087 0ln（0.776 5+0.223 5e0.0608t）-9.010 3；基質(zhì)消耗動力學(xué)模型：12.636 3ln（0.776 5+0.223 5e0.0608t）。

比較模型計算值與驗證實驗值，發(fā)現(xiàn)偏差大部分都低于10%，平均偏差分別為5.34%、7.91%和7.69%，說明該發(fā)酵動力學(xué)模型能很好地反映B3菌菌體生長、漆酶生成和基質(zhì)消耗的變化規(guī)律，對于B3菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶及其工業(yè)生產(chǎn)的放大具有參考價值。

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Kinetics of Laccase Production by Batch Fermentation of Endophytic Fungus Phomopsis liquidambari B3

ZHOU Jun1, MEI Yan-zhen1, YANG Teng1, KANG Li1, DAI Zhi-dong2, DAI Chuan-chao1,*
(1. Jiangsu Engineering and Technology Research Center for Industrialization of Microbial Resources, Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional Genomics, College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 2. Shangde Biotechnology Company, Danyang 212300, China)

The aim of this study was to establish a kinetic model of laccase production by batch fermentation of the endophytic fungus Phomopsis liquidambari B3. The experimental results showed that the production of laccase was partially associated with the growth of P. liquidambari B3. The experimental data were nonlinearly fitted to the Logistic equation describing cell growth, the Luedeking-Piret equation indicating laccase production and the Luedeking-Piret-Like equation revealing substrate consumption using MATLAB software, and the optimal parameters and the fermentation kinetic model were established. Validation experiments revealed the errors between the calculated and experimental values were less than 10%, indicating that the kinetic model can describe the actual fermentation process of P. liquidambari B3.

endophytic fungus; Phomopsis liquidambari B3; laccase; batch fermentation; kinetic model

Q815

A

1002-6630（2014）15-0183-05

10.7506/spkx1002-6630-201415037

2013-07-29

江蘇省社會發(fā)展項目（BE2010708）；江蘇省高?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進(jìn)工程項目（JHB2012-16）；

南京市科委工程中心創(chuàng)新能力提升項目（201105058）

周駿（1990—），男，碩士研究生，研究方向為微生物生態(tài)與環(huán)境工程。E-mail：raul1990713@163.com

*通信作者：戴傳超（1970—），男，教授，博士，研究方向為植物圈微生物資源與生態(tài)功能。E-mail：daichuanchao@njnu.edu.cn