劉回民，程國棟，陳方奇，鄭明珠，詹冬玲，劉景圣*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

玉米半胱氨酸蛋白酶突變體W308C的原核表達和酶學(xué)性質(zhì)表征

劉回民，程國棟，陳方奇，鄭明珠，詹冬玲，劉景圣*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

通過對玉米半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease from Zea mays，zmCP1）同源模建和底物對接研究發(fā)現(xiàn)，W308位點在木瓜蛋白酶家族（C1家族）高度保守，且位于zmCP1催化三聯(lián)體殘基N306位點附近，與絕大多數(shù)底物形成π-π鍵，可參與底物和酶活性中心的結(jié)合，是該酶的關(guān)鍵位點；結(jié)合Rosetta design程序設(shè)計，對W308位點進行突變，獲得W308C突變體，并在大腸桿菌BL21中表達。酶學(xué)性質(zhì)表征實驗結(jié)果表明：突變體W308C的最適溫度為55 ℃，最適pH 6.0；在70、80、90 ℃下的半衰期為75.33、57.24、40.29 min，分別是野生型的1.21、1.19、1.01倍；突變體W308C和野生型的特異性常數(shù)Kcat/Km分別為11.02、5.92 L/（μmol·min），催化活性提高了0.86倍。

半胱氨酸蛋白酶；突變體；原核表達；酶學(xué)性質(zhì)

微生物是商業(yè)用酶的主要來源，但植物來源的酶因其較好的安全性而被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)、制藥等領(lǐng)域[1]。自19世紀40年代以來，來源于灌藦、牛角瓜屬、阿魯藤屬、獼猴桃屬等植物中的半胱氨酸蛋白酶已被分離鑒定。其中木瓜蛋白酶家族（C1家族）半胱氨酸蛋白酶因其在具有較寬的適用溫度和pH值范圍而倍受關(guān)注。在食品行業(yè)中，C1家族半胱氨酸蛋白酶可用于肉類嫩化、啤酒澄清、餅干松化[2]。在醫(yī)學(xué)中，可用于傷口愈合、消炎、止痛等[3]。此外，C1家族蛋白酶還具有美白、改善肌膚等美容功能，還可用于牙膏中的美白劑以及飼料添加劑[4]。

玉米半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease from Zea mays，zmCP1）為C1家族的一員，序列比對結(jié)果如圖1所示。該蛋白酶通常以酶原的形式存在，大多數(shù)為內(nèi)切酶，少數(shù)為外切酶，含有10～26 個氨基酸殘基組成的前導(dǎo)肽，前導(dǎo)肽結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，通過分子內(nèi)或分子間蛋白水解而激活酶的活性區(qū)域[5-6]。C1家族中的很多蛋白的3D結(jié)構(gòu)都已經(jīng)被解析，包括木瓜蛋白酶、獼猴桃素、木瓜蛋白酶Ⅳ、組織蛋白酶B等[7-11]。盡管該家族酶的一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)具有很高的同源性，但是在穩(wěn)定性、活性和底物特異性上有很大差別[5]。

圖1 zmCP1的同源序列比對Fig.1 Sequence alignment of zmCP1 with homologous proteins

目前有關(guān)C1家族的研究主要集中在酶類的提取、純化和性質(zhì)研究和其在種子萌發(fā)中的生理功能等方面[9,12-13]，但是對該酶空間結(jié)構(gòu)改造的研究尚未見報道。美國國立生物技術(shù)信息中心已收錄的C1家族酶類的序列有6 909條，已確定的有223 種，而結(jié)構(gòu)已知的有40 種。通過同源序列比對（圖1）可以看出，高粱、水稻、獼猴桃與zmCP1的同源性較高，可達到50%以上。其中，蓖麻半胱氨酸蛋白酶（1S4V）晶體結(jié)構(gòu)已知，因此我們以此為模板進行同源模建和底物分子對接研究，結(jié)果見圖2。

圖2 zmCP1的W308位點與熒光肽R-AMC作用Fig.2 Interactions of W308 and R-AMC

由圖1、2可知，W308位點在該家族中高度保守，并且位于催化三聯(lián)體N306位點附近，通過底物虛擬對接預(yù)測該位點可以與底物形成π-π共軛雙鍵，參與底物接合，因此推測W308位點是zmCP1活性關(guān)鍵殘基。因此，本實驗結(jié)合Rosetta design程序設(shè)計構(gòu)建zmCP1突變體W308C，并對其酶學(xué)性質(zhì)開展研究，為開發(fā)更適合工業(yè)生產(chǎn)用酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3），重組表達載體pE-zmCP1為本實驗室保存。

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品DL2 000、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、EcoRⅠ 日本TAKARA公司；Phusion超保真DNA聚合酶、重組限制性核酸內(nèi)切酶DpnⅠ 美國NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖?美國Axygen公司；卡那霉素北京鼎國有限公司；胰蛋白胨、NaCl、酵母粉 英國OXOID公司；蛋白表達及純化相關(guān)試劑 上海生工公司；引物、熒光肽R-AMC 上海生工公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1604N分析天平 梅特勒-托利多公司；TL-18M高速冷凍離心機 上海離心機研究所；Mini-Sub水平電泳儀 美國伯樂公司；SH010恒溫培養(yǎng)箱 上海實驗儀器廠；ULT超低溫冰箱 美國Thermo Fisher公司；5332小型PCR儀 德國Eppendorf公司；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 突變體W308C的構(gòu)建

在之前研究中通過特異性引物擴增得到了zmCP1的基因，并利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ成功構(gòu)建了原核表達載體pE-zmCP1。本實驗在此基礎(chǔ)上，以pE-zmCP1為模板進行全質(zhì)粒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）構(gòu)建突變體W308C。實驗中用到的引物見表1。

表 1 1 zmCP1zmCP1及突變體引物序列Table 1 The primer sequences of zmCP1 and mutant W308C

突變PCR反應(yīng)總體系為50 μL，模板1 μL，兩條引物各1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸混合液1 μL，5×buffer 10 μL，Phusion聚合酶1 μL，重蒸水35 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min、95 ℃變性2 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min/kb共20個循環(huán)、72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL的DpnⅠ在37 ℃金屬浴中消化60 min。取5 μL反應(yīng)液加到100 μL的感受態(tài)細胞BL21（DE3）中，利用熱激法進行轉(zhuǎn)化，加入800 μL Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基（不含抗生素）培養(yǎng)1 h后，涂于LB固體培養(yǎng)基（含卡那霉素，50 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)過夜后，進行陽性克隆篩選，將篩選得到的陽性克隆進行菌落PCR和雙酶切鑒定。

1.3.2 突變體W308C的表達純化及酶活力測定

分別挑取pE-zmCP1和突變體W308C的單菌落至2 mL LB培養(yǎng)基（含卡那霉素，50 μg/mL）中，37 ℃培養(yǎng)至菌液OD600nm值約為0.6，添加50 μL 100 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）進行誘導(dǎo)，37 ℃培養(yǎng)4 h。收集菌體后加入320 μL PBS沖洗后超聲破碎，對菌體破碎液進行離心分離（12 000 r/min，5 min），收集上清液，使用鎳柱純化。純化后的酶液通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和Western blotting進行鑒定。

參照文獻[14-15]方法測定酶活力。200 μL反應(yīng)體系：5 μL酶液，10 μL R-AMC底物（100 mmol/L，20%二甲基亞砜），185 μL Tris-HCl（pH 6.0，50 mmol/L）。將反應(yīng)液置于50 ℃水浴中加熱30 min，取出放于冰浴中1 h，利用熒光檢測其活力。設(shè)定激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長460 nm，狹縫寬度為5 nm/1.5 nm。酶活力單位為U，1 U為每分鐘催化生成1 μmol AMC所需的酶量。

1.3.3 突變體W308C最適反應(yīng)溫度及最適pH值測定

以R-AMC為底物，在50 mmol pH 6.0的Tris-HCl緩沖液中檢測30～90 ℃不同溫度下突變體的活力。

以三羥甲基甲胺基丙磺酸、2-(N-嗎啉基)乙磺酸、3-(環(huán)己胺)-1-丙磺酸和4-羥乙基哌嗪乙磺酸配制成pH值范圍3.0～10.0的緩沖液，以R-AMC為底物，將酶置于不同的pH值緩沖液中在55 ℃檢測酶活力，以最高酶活力作為100%。

1.3.4 突變體W308C熱穩(wěn)定性測定

在多個離心管中加入相同酶液和緩沖液，分別檢測突變體W308C在70、80、90 ℃的金屬浴中的熱穩(wěn)定性，每隔20 min取1管進行活力測定，以相對酶活力為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)作圖，求出酶失活半衰期。0 min的相對酶活力定義為100%。

1.3.5 突變體W308C的酶促反應(yīng)動力學(xué)

以熒光肽R-AMC為底物，Tris-HCl（pH 6.0）為緩沖液，在55 ℃測定不同底物濃度（5～200 μmol/L）時的反應(yīng)初速度，使用Graphpad Prism 6軟件通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法對該酶的動力學(xué)進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗結(jié)果的平均值，以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 zmCP1突變體W308C的構(gòu)建

圖3 突變體W308C鑒定Fig.3 Identification of mutant W308C

利用設(shè)計的突變引物進行全質(zhì)粒PCR，經(jīng)過DpnⅠ消化后，轉(zhuǎn)化篩選得到的陽性克隆。對陽性克隆進行菌落PCR鑒定。由圖3可知，通過引物zmCP1-up和zmCP1-down可以擴增出特異條帶，大小在1 000 bp左右，同zmCP1理論大小1 023 bp一致。W308C重組質(zhì)粒經(jīng)過EcoRⅠ和NdeⅠ酶切后可獲得大小約1 kb的目的基因條帶以及載體條帶，證明陽性克隆將篩選得到的突變體送至上海生工測序，結(jié)果證明在W308位點發(fā)生了預(yù)期突變，由色氨酸突變成了半胱氨酸。綜上所述，突變體W308C構(gòu)建成功。

圖4 突變體W308C的表達和純化Fig.4 Expression and purification of mutant W308C

2.2 突變體W308C的表達和純化野生型（WT）和突變體菌株經(jīng)100 mmol IPTG誘導(dǎo)表達后使用鎳柱分離純化，純化產(chǎn)物12% SDS-PAGE電泳進行檢測，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)過鎳柱純化后可以獲得條帶單一的蛋白，分子質(zhì)量在34 kD左右，與半胱氨酸蛋白酶理論分子質(zhì)量一致。利 用組氨酸抗體和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗鼠IgG對突變體W308C的表達產(chǎn)物進行

Western blotting鑒定，特異性條帶位置與SDS-PAGE的結(jié)果一致，證明實現(xiàn)了重組酶的特異性表達。分別對上清液和純化后的酶液進行酶活力測定，上清液的酶比活力為59.6 U/mg，而純化后酶比活力達到305.2 U/mg，純化倍數(shù)為5.12 倍。

2.3 突變體W308C的最適溫度及最適pH值

圖5 突變體W308C的最適溫度Fig.5 Optimal temperature of W308C

由圖5可知，突變體W308C的最適溫度為55 ℃，在40～80 ℃溫度范圍內(nèi)，保持了50%以上的活性，當(dāng)溫度高達90 ℃時仍有將近20%的活性，同野生型zmCP1一致，這也與C1家族的酶學(xué)特性相近，該家族中的菠蘿蛋白酶最適溫度為65 ℃[4]，狗牙花中提取的半胱氨酸蛋白酶（Ervatamin-C）的最適溫度為70 ℃[9]。Dutta等[17]在大腸桿菌BL21中異源表達了Ervatamin-C，重組酶和天然酶同樣都可以在溫度達到70 ℃的時候保持75%以上的活力，這與本實驗結(jié)果相似。

圖6 突變體W308C的最適pH值Fig.6 Optimal pH of W308C

由圖6可知，該酶在pH 6左右時活性最高，pH 3～6之間活性持續(xù)上升，而在pH 6以后活性迅速下降，到pH 10活性幾乎消失，同野生型zmCP1性質(zhì)接近，同樣偏愛中性環(huán)境。對該家族的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等研究結(jié)果表明[18-20]，該酶的最適pH值在5～7之間，大多數(shù)都偏愛中性環(huán)境，只有少量的酶的最適pH值為酸性。

由上述可知，突變體W308C的最適溫度和最適pH值同野生型一致?？赡苁且驗樵撏蛔儾⑽从绊懨富钚灾行牡慕Y(jié)構(gòu)，從而未影響催化三聯(lián)體的質(zhì)子傳遞以及酶活性中心的微環(huán)境，所以其最適溫度和最適pH值較野生型沒變化。

2.4 突變體W308C的熱穩(wěn)定性

圖7 不同溫度下野生型和突變體W308C的熱穩(wěn)定性Fig.7 Stability of WT and W308C

以R-AMC為底物，在pH 6.0的條件下，測定了突變體W308C和野生型在70、80、90 ℃下的熱穩(wěn)定性，通過酶活力的半衰期T50作為考量熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。由圖7可以看出，時間越長，剩余酶活力越低，突變體W308C的熱穩(wěn)定性要優(yōu)于野生型。突變體W308C在70、80、90 ℃下的T50分別為75.33、57.24、40.29 min，而野生型的分別為62.04、47.78、39.82 min。由此可見突變體W308C的熱穩(wěn)定性在70、80℃的時候要明顯高于野生型，而在90 ℃時則較為接近。在80、90 ℃的條件下放置120 min后活力幾乎喪失。在70 ℃條件下，W308C放置120 min時仍能保持15%左右的酶活力，而野生型在10%左右。這可能因為W308C突變酶的結(jié)構(gòu)更加緊湊，因此在高溫下能更好的保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)固，因而具有更好的熱穩(wěn)定性。

2.5 突變體W308C酶動力學(xué)研究

圖8 野生型和突變體W308C的動力學(xué)曲線Fig.8 Kinetic curves of wild type a nd mutant W308C with R-AMC as substrate

以不同濃度的R-AMC為底物，分別測定了野生型和突變體W308C的酶活初始速度V0，根據(jù)結(jié)果分別計算1/V和1/[S]，并按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖（圖8），得到野生型和突變體W308C的Km和Vmax。由圖8可知，野生型和突變體W308C的米氏常數(shù)Km分別為43.62 μmol/L和44.13 μmol/L，并沒有顯著變化，可見W308C的突變并沒有改變該酶的底物親和力，但是最大反應(yīng)速率Vmax的變化卻很明顯，由此計算出Kcat值，野生型和突變體分別為258、486/min，Kcat/Km值分別為5.92、11.02 L/（μmol·min），催化活性較野生型提高了1.86倍。

由動力學(xué)參數(shù)可以看出，突變體W308C的催化活性高于野生型，但是Km基本無變化。W308位于催化三聯(lián)體N306的附近，當(dāng)W308突變?yōu)镃308，側(cè)鏈官能團變小，空間位阻減小，有利于底物進入結(jié)合口袋，便于酶的親核進攻，因此酶的活力提高。

3 結(jié) 論

本實驗將zmCP1突變體W308C在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達，通過SDS-PAGE和Western blotting對表達產(chǎn)物進行驗證。酶學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果顯示，突變體W308C的最適溫度和最適pH值同野生型酶一致，即分別是55 ℃、pH 6.0，熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，突變體W308C在70 ℃和80 ℃下的熱穩(wěn)定性較野生型更穩(wěn)定，這與之前的研究結(jié)果相近，該家族的酶在中性pH值和高溫下穩(wěn)定[4-5,9,14,19]。本實驗首次對zmCP1進行定點突變研究，并且篩選得到了突變體W308C，對突變體和野生型酶學(xué)性質(zhì)進行了比較分析，為該酶的工業(yè)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression and Characterization of Cysteine Protease Mutant W308C from Zea mays

LIU Hui-min, CHENG Guo-dong, CHEN Fang-qi, ZHENG Ming-zhu, ZHAN Dong-ling, LIU Jing-sheng*
(National Engineering Laboratory for Wheat and Corn Deep Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Through homologous modeling and docking studies of cysteine protease from Zea mays (zmCP1), W308 was highly conserved in papain super family (C1 family), near the Asn306 which was the residues of catalytic triad, had π-π interaction with most of the ligands, and was the key residue for zmCP1. By using Rosseta design program, the mutant W308C was obtained and expressed in E.coli BL21. The characterization of enzymatic properties indicated that the optimal temperature and pH were 55 ℃ and 6.0, respectively. T50of W308C at 70, 80, and 90 ℃ were 75.33, 57.24, and 40.29 min, respectively, which were 1.21, 1.19 and 1.01 times higher than wild type. Kcat/Kmof W308C and wild type was 1.02 and 5.92 L/(μmol min), respectively, showing an activit y level 1.86 times higher than that of wild type.

cysteine protease; mutant; prokaryotic expression; enzymatic properties

Q786

A

1002-6630（2014）15-0122-05

10.7506/spkx1002-6630-201415025

2014-04-04

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171760）；國家糧食公益性行業(yè)科研專項（201313011-3）

劉回民（1984—），男，講師，博士研究生，主要從事食品生物制造與新資源利用研究。E-mail：hymanliu@126.com

*通信作者：劉景圣（1964—），男，教授，博士，主要從事功能性食品研究。E-mail：liujs1007@vip.sina.com